24R-Pyxinol化合物作为线粒体荧光探针的应用的制作方法

本发明涉及药物化学及线粒体用途领域，涉及24r-pyxinol化合物作为线粒体荧光探针的应用。具体地，涉及一种24r-pyxinol荧光探针在线粒体定位中的应用。

背景技术：

24r-pyxinol是原人参二醇在肝脏内的代谢产物之一，具有抗炎、抗心肌缺血/再灌注损伤等药理活性。前期研究发现，24r-pyxinol化合物具有抗心肌缺血/再灌注损伤的活性(chin.j.org.chem.2017,37(8),2109-2114)。

线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，是细胞中的主要能量供应者，素来有“细胞动力工厂”之称。并且还具有参与细胞代谢、细胞信号传导、细胞凋亡等多种功能，一直是科学界的研究热点。目前，定位于活细胞中线粒体的荧光探针逐渐被报道，实现了对活细胞线粒体的实时观察。常见的线粒体荧光探针如商品化线粒体染料(罗丹明123、菁染料、jc-1等)以及文献中报道的三苯基膦(tpp)、季铵盐阳离子等靶向线粒体。然而这些探针的染色都是依赖于线粒体膜电位，一旦线粒体膜电位降低或消失，就不能染色线粒体。另一方面，某些探针的染色时间长(如mitored)，短时间内无法对活细胞线粒体染色。

因此，开发不受线粒体膜电位影响、快速靶向线粒体的荧光探针具有重要价值。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，获得一种不受线粒体膜电位影响、快速靶向线粒体的荧光探针，本发明提供了一类24r-pyxinol荧光探针、其细胞线粒体示踪、定位可接受的盐，其具有不受线粒体膜电位影响、染色时间短等优势。进一步，该类荧光探针中，部分荧光探针对心肌细胞具有较高的选择性，可以用于心肌细胞的鉴定、分选等特色应用。

为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：

通式(i)所示24r-pyxinol化合物作为线粒体荧光探针的应用，

其中，r代表(c4-c8)直链烷基或乙氧基链、甘氨酰链；

优选，本发明的部分化合物为：

3β-o-[2-[2-(n-荧光素-5-异硫氰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰-(20s,24r)-环氧达玛-12β,25-二醇(探针1)；

3β-o-[n-(荧光素-5-异硫氰基)-6-氨基己酰]-(20s,24r)-环氧达玛-12β,25-二醇(探针2)；

3β-o-(n-荧光素-5-异硫氰基-甘胺酰甘胺酰甘胺酰)-(20s,24r)-环氧达玛-12β,25-二醇(探针3)。

所述24r-pyxinol荧光探针及其上述化合物的光学异构体或其生命科学上可接受的溶剂合物。

进一步的优选化合物，3β-o-[2-[2-(n-荧光素-5-异硫氰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酰-(20s,24r)-环氧达玛-12β,25-二醇(探针1)。

优选，上述化合物能够特异性识别心肌细胞的线粒体，可用于心肌细胞的筛选识别、及心肌线粒体的鉴定等应用。

本发明的有益效果：

一、本发明提供了一种24r-pyxinol荧光探针在线粒体定位中的应用，该荧光探针能够快速靶向活细胞的线粒体。

二、与其他线粒体定位剂相比，其他线粒体定位剂多为阳离子染料带有电荷，它们标识线粒体依赖于活细胞线粒体的膜电位，而本发明的24r-pyxinol荧光探针不带电荷，因此，其识别线粒体不受线粒体膜电位的影响，在线粒体膜电位降低或消失时依旧可以对线粒体进行染色；同时对心肌细胞具有较高的选择性。

三、与mitored相比，该染料对于线粒体的染色更迅速，染色时间更短。另外，该探针还具有溶解性好、显色强、生物相容性好等优点，在荧光生物标记领域和生命科学检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1为探针1在心肌细胞中的荧光成像图。

probe1代表探针1染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

图2为探针2在心肌细胞中的荧光成像图。

probe2代表探针2染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

图3为探针3在心肌细胞中的荧光成像图。

probe3代表探针3染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

图4为探针2在raw264.7细胞中的荧光成像图。

probe代表探针2染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

图5为探针1与线粒体荧光染料mitored的共定位染色图。

probe代表探针1染色，mitored代表线粒体荧光染料染色，merge代表两部分荧光信号的叠加。

图6为探针1、mitored对细胞染色的实时观察荧光图片。

观察时间分布为：5min(a)，10min(b)，20min(c)。

图7为探针1在心肌细胞和raw264.7细胞的混合细胞中的荧光成像图。

probe代表探针1染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

图8为探针1在心肌细胞和sgc7901肿瘤细胞的混合细胞中的荧光成像图。

probe代表探针1染色，merge代表两部分信号的叠加，dic代表白场信号即普通光学显微镜视野。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。而且，需要说明是由于说明书附图中按照要求需要提供灰度图像，下述实施例中涉及的颜色变化均以灰度在图像中表达，但是并不影响其在实施例中的实际色彩，在此予以说明。

实施例1：探针1在心肌细胞中的荧光成像

取对数生长期的h9c2心肌细胞消化计数，以8×10³/100μl孔接种于35mm激光共聚焦培养皿，于细胞培养箱培养24h；加入荧光探针1，使其终浓度为1μm，并于原培养环境继续培养1h；弃培养液，pbs清洗3遍，于激光共聚焦显微镜下进行观察记录。如图1所示，探针1在细胞内发出明亮的绿色荧光，聚集点极为明显，细胞内线型的线粒体清晰可见。

实施例2：探针2在心肌细胞中的荧光成像

操作方法同实施例1，只需要将实施例1中相应探针1改为探针2。

如图2所示，探针2也在细胞内发出明亮的绿色荧光，聚集点极为明显，细胞内线型的线粒体清晰可见。

实施例3：探针3在心肌细胞中的荧光成像

操作方法同实施例1，只需要将实施例1中相应探针1改为探针3。

如图3所示，探针3也在细胞内发出明亮的绿色荧光，聚集点极为明显，细胞内线型的线粒体清晰可见。

实施例4：探针2在raw264.7细胞中的荧光成像

取对数生长期的raw264.7细胞消化计数，以5×10⁴/100μl孔接种于35mm激光共聚焦培养皿，于细胞培养箱培养24h；加入荧光探针2，使其终浓度为1μm，并于原培养环境继续培养1h；弃培养液，pbs清洗3遍，于激光共聚焦显微镜下进行观察记录。如图4所示，探针2在细胞内发出明亮的绿色荧光。

以上实施例1-4表明本发明的提供的24r-pyxinol化合物能够作为线粒体荧光探针的应用，而且本发明的荧光探针能够快速靶向活细胞的线粒体。与其他线粒体定位剂相比，该染料不受线粒体膜电位的影响，在线粒体膜电位降低或消失时依旧可以对线粒体进行染色。

实施例5：探针1在细胞内的线粒体定位实验

取对数生长期的h9c2细胞接种于35mm激光共聚焦培养皿，于细胞培养箱培养24h。加入荧光探针1，终浓度为1μm，并于细胞培养箱继续培养1h。吸弃培养液，pbs清洗3遍，加入mitored染色剂，继续培养30min，于激光共聚焦显微镜下进行观察。

如图5所示，荧光探针在h9c2细胞内的聚集点和mitored染料在细胞内的聚集点基本完全重合，说明本发明所述的这种24r-pyxinol荧光探针能专一性地靶向活细胞中的线粒体。

实施例6：探针1、mitored对心肌细胞染色的实时观察

将荧光探针1与线粒体红色荧光探针mitored分别加入到已接种h9c2细胞的培养皿中，探针1终浓度为1μm，mitored终浓度为500nm，观察其进入细胞的过程，观察时间为30min。

如图6所示，说明探针1、mitored在细胞内的荧光随时间变化的情况，在5min(a)，10min(b)，20min(c)时，本发明所述24r-pyxinol荧光探针能够快速靶向线粒体。图6表明，与mitored相比，本发明的探针对于线粒体的染色更迅速，染色时间更短。

实施例7：探针1在raw264.7细胞和心肌细胞的混合细胞中的荧光成像

将对数生长期的h9c2细胞及raw264.7细胞接种于同一35mm激光共聚焦培养皿。加入荧光探针，终浓度为1μm，并于细胞培养箱继续培养1h。吸弃培养液，pbs清洗3遍，于激光共聚焦显微镜下进行观察记录。

如图7所示，探针1在两种细胞内的荧光情况有较大差别，在h9c2细胞内有明显的荧光及聚集点，但在raw264.7细胞中几乎没有荧光。这表明本发明所述24r-pyxinol荧光探针能够明显区分这两种细胞，对心肌细胞具有较高的选择性。

实施例8：探针1在sgc7901肿瘤细胞和心肌细胞的混合细胞中的荧光成像

将对数生长期的h9c2细胞及sgc7901肿瘤细胞接种于同一35mm激光共聚焦培养皿。加入荧光探针，终浓度为1μm，并于细胞培养箱继续培养1h。吸弃培养液，pbs清洗3遍，于激光共聚焦显微镜下进行观察记录。

如图8所示，探针1在两种细胞内的荧光情况有较大差别，在h9c2细胞内有明显的荧光及聚集点，但在sgc7901细胞中几乎没有荧光。这表明本发明所述24r-pyxinol荧光探针能够明显区分这两种细胞，对心肌细胞具有较高的选择性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言，仅仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明专利要求所限定的范围内，可对其进行许多改变、修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

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