一种检测DNA损伤标志物的稀土上转换荧光探针的制备方法及其应用与流程

本发明设计属于荧光纳米探针检测领域，具体涉及一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术：

活性氧(ros)作为生理过程、代谢和其他生化反应的一部分，在需氧生物的活细胞中不断形成，由于它们的反应性和一系列外源性因素，会对细胞膜脂质、蛋白质和dna造成氧化损伤，导致老化、恶性肿瘤和其他退行性疾病。因此开发一种快速灵敏检测dna损伤的方法对于评估各类环境污染问题对人体健康状况的影响以及疾病的早期预测具有重要意义。生物标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-ohdg)最早由kasai和nishimura于1984年报道，可通过血液运输并排泄到尿液中而不进行代谢，被最终确立为常用的dna损伤标志物。通过对尿样中8-ohdg的浓度检测可用于评价人体dna损伤程度。

目前已报道的8-ohdg检测方法主要包括高效液相色谱-串联质谱法(hplc/ms)、电泳法、酶联免疫吸附法(elisa)、电化学法等，然而，这些技术由于预处理繁杂、分析时间长、重复性差等原因显示出一定的局限性，我们需要一种简单、快捷的方法用于检测8-ohdg。近年来，荧光检测因其高灵敏度、高稳定性、很小的细胞毒性等优点被广泛的研究和使用。

稀土掺杂上转换纳米材料(ucnps)作为新型的发光材料，在近红外光激发下可发出可见光，这种反斯托克斯发光特性使ucnps具有较深的穿透深度、较高的化学稳定性及较低的毒性等优良性质，而nayf4:er,yb被认为是上转换效率最高的材料之一。此外，在近红外光激发下，生物组织本身所产生的荧光以及散射光几乎是可以忽略的。近年来，基于上转换材料构建荧光共振能量转移体系广泛被应用于各类物质的检测和分析。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针及其应用，与现有方法相比背景干扰低，灵敏度高，毒性低、体系稳定且操作简便，具有较大的应用潜力。

本发明的技术方案为：一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针及其应用，包括荧光探针的构建，步骤如下：

制备上转换纳米材料nayf4:er,yb并对其进行硅烷化处理，得到表面氨基化的上转换纳米材料nh2-ucnps，分散在超纯水中备用；

将酸性品红溶液与步骤(1)得到的nh2-ucnps分散液按照一定浓度比例混合得到稀土上转换荧光探针；

步骤(2)的酸性品红溶液与nh2-ucnps的浓度比为1mg/l～100mg/l:1mg/ml。

优选的，步骤(1)中的纳米上转换材料nayf4:er,yb尺寸为20-500nm。

本发明还提供了一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针的应用，将权利要求1～2任意一项所述的检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针的制备方法，制备得出的检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针，在检测dna损伤标志物中的应用。

优选的，检测方法步骤如下：将一定浓度的8-ohdg溶解于酸性缓冲溶液中，然后取适量与酸性品红溶液混合，再将nh2-ucnps加入上述溶液，最后加入一定量相同酸性缓冲溶液使总体积为3ml，混合后在980nm激发下记录545nm处的荧光光谱数据，根据添加不同浓度8-ohdg的检测液与样品空白荧光强度差值(f-f0)的不同，实现对8-ohdg的定量检测。

优选的，样品测定体系中试剂的加入方式为，先将8-ohdg与酸性品红溶液混合，然后加入nh2-ucnps分散液。

优选的，所述酸性缓冲溶液的ph值为1～4。

本发明的有益效果：本发明首先制备了一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针，该探针对dna损伤标志物8-ohdg有高灵敏度和较宽的线性检测范围，同时，基于上转换材料构建荧光探针可有效降低背景干扰，提高了分析结果的可靠性，在判定dna损伤领域具有较大的应用潜力，且探针毒性低，有望进一步应用于生物原位检测。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为溶剂热法制备的nh2-ucnps透射电镜图；

图2a为上转换检测体系对不同浓度梯度8-ohdg的荧光响应曲线；

图2b为上转换检测体系对不同浓度梯度8-ohdg的标准曲线图；

图3为加入顺序对体系检测灵敏度的影响结果图；

图4为酸性品红与nh2-ucnps的浓度比对检测体系灵敏度的影响结果图；

图5为体系ph值对上转换检测体系灵敏度影响的结果图；

图6为上转换检测体系对8-ohdg和尿样中所存在的干扰物的检测选择性结果图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，对本发明进行具体描述。

本发明涉及一种检测dna损伤标志物的稀土上转换荧光探针及其应用，以dna氧化损伤产物8-羟基脱氧鸟苷(8-ohdg)为标志物定量评价dna损伤程度。

实施例1

本发明中，利用已报道的溶剂热法制备微纳米上转换材料nayf4:er,yb。将ycl3、ybcl3、ercl3固体加入到5ml去离子水中，并加入柠檬酸钠和10ml去离子水混合搅拌均匀。再加入nacl、nh4f、油酸和乙二醇的混合液体，搅拌30min后放入反应釜中，在180℃下反应6h。离心收集下层沉淀，并用乙醇洗涤三次，最后经过干燥得到微纳米上转换材料nayf4:er,yb粉末。

本发明中，使用以下步骤对nayf4:er,yb进行表面氨基化修饰。将上述所得的微纳米上转换材料nayf4:er,yb粉末分散于异丙醇中，并加入聚乙烯吡络烷酮混合超声30min，依次加入蒸馏水和氨水，35℃下封口快速磁力搅拌15min后，逐滴加入异丙醇和正硅酸乙酯的混合溶液，室温下搅拌3h。再逐滴加入异丙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液继续搅拌2h，反应结束后离心收集沉淀物，并均匀分散在超纯水中，得到氨基化nayf4:er,yb溶液。氨基化nayf4:er,yb电镜扫描图如图1所示。

实施例2

使用荧光探针对8-ohdg检测标准曲线的建立

使用酸性缓冲溶液配制一定浓度的8-ohdg溶液与酸性品红溶液混合，再加入nh2-ucnps，取相同酸性缓冲溶液加入使总体积为3ml得到检测液。980nm激发下记录545nm处的荧光光谱数据，根据不同浓度8-ohdg的检测液与样品空白荧光强度差值(f-f0)不同，实现对8-ohdg的定量检测。

荧光光谱扫描参数为：激发波长为980nm，扫描速度为1200nm/min，激发和发射夹缝宽度均为5nm，pmt电压为700v。

图2a为上转换检测体系对不同浓度梯度8-ohdg的荧光响应曲线，图2b为上转换检测体系对不同浓度梯度8-ohdg的标准曲线，以f-f0为纵坐标，其中f和f0分别表示检测液和样品空白在545nm处的荧光强度。如图中所示，随8-ohdg浓度的增加，检测体系荧光恢复增强，这是由于酸性品红染料与nh2-ucnps存在荧光共振能量转移作用，导致nh2-ucnps荧光猝灭，而质子化的8-ohdg带正电，与nh2-ucnps共同竞争酸性品红表面负电位点。加入8-ohdg后，酸性品红与nh2-ucnps静电作用减弱，表现为荧光部分恢复，f-f0与8-ohdg浓度的负对数呈正相关，线性相关方程为△f＝66.27·log(c8-ohdg)+802.77，r2＝0.9946。

实施例3

研究检测体系各试剂加入顺序对体系灵敏度的影响

取1ml4mg/l酸性品红溶液与3×10-8mol/l8-ohdg溶液混合后，加入1ml1mg/ml氨基化nayf4:er,yb溶液，震荡混匀后使用相同缓冲溶液加入使总体积为3ml，得到待检测液1；取1ml酸性品红溶液与1ml1mg/ml氨基化nayf4:er,yb溶液混合后，加入3×10-8mol/l8-ohdg溶液，震荡混匀后取相同酸性缓冲溶液加入使总体积为3ml，得到待检测液2。980nm激发光下，使用荧光分光光度计测定545nm处检测液1和检测液2的荧光强度。加入顺序对体系灵敏度的影响如图3所示，结果表明，加入顺序为酸性品红—8-ohdg—nh2-ucnps时可得到更高的体系灵敏度。

实施例4

研究酸性品红与nh2-ucnps的浓度比对检测体系灵敏度的影响

取1ml一系列浓度的酸性品红溶液与8-ohdg混合，加入1ml1mg/ml氨基化nayf4:er,yb溶液，震荡混匀后使用缓冲溶液调节体系ph值并定容至5ml，得到检测液。980nm激发光下，使用荧光分光光度计测定545nm处检测液的荧光强度。从图4可知，随酸性品红与nh2-ucnps浓度比的升高，nh2-ucnps在545nm处的荧光猝灭愈加明显。与相同浓度比下样品空白作比较，以两者在545nm处荧光强度差值f-f0为纵坐标作图，表明酸性品红与nh2-ucnps浓度比为4:1(mg/l:mg/ml)时，体系荧光恢复值最大，可得到较好的灵敏度。

实施例5

研究ph值对检测体系灵敏度的影响

取4mg/l酸性品红溶液1ml与8-ohdg混合，加入1ml1mg/ml氨基化nayf4:er,yb溶液，震荡混匀后取相同酸性缓冲溶液加入使总体积为3ml得到检测液。980nm激发光下，使用荧光分光光度计测定545nm处检测液的荧光强度。体系的ph值对酸性品红-8-ohdg-nh2-ucnps检测体系的影响如图5所示，结果表明，ph＝2.34时更容易得到较高的荧光增强效果。

实施例6

研究该检测体系对8-ohdg的选择性

选择实际尿样中常见物质和金属离子进行选择性研究。取4mg/l酸性品红溶液1ml分别与尿素、尿酸、抗坏血酸、葡萄糖、肌酐、ca2+、zn2+、na+、k+、mg2+、al3+混合，再加入1ml1mg/ml氨基化nayf4:er,yb溶液，震荡混匀后取相同酸性缓冲溶液加入使总体积为3ml得到检测液。980nm激发光下，使用荧光分光光度计测定545nm处检测液的荧光强度，结果如图6所示。本方法对8-ohdg有较好的选择性，可应用于实际尿样中8-ohdg的检测。

以上仅就本发明的最佳实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构允许有变化。凡在本发明独立权利要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明保护范围内。

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