一种检测人IDH1基因突变的引物和探针、试剂盒和装置的制作方法

一种检测人idh1基因突变的引物和探针、试剂盒和装置
技术领域
[0001]
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人idh1基因突变的引物和探针、试剂盒和装置。


背景技术：

[0002]
异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，idh)在人体内可催化异柠檬酸盐氧化脱羧产生co
2
和α-酮戍二酸(α-ketoglutarate，α-kg)。人类idh由 5个基因编码共有3种类型：idh1、idh2和idh3，其中idh1基因位于染色体2q33，编码蛋白存在于胞浆和过氧化物酶体中，idh2与idh3存在于线粒体中。90％以上的idh1突变为idh1r132h(精氨酸被组氨酸替代)，其他少见突变类型均发生在r132残基，包括精氨酸被半胱氨酸代替(r132c)，被丝氨酸代替(r132s)，被甘氨酸代替(r132g)，被亮氨酸代替(r132l)。因此，idh的检测对胶质瘤的诊断具有重要意义。
[0003]
近年来，微滴式数字聚合酶链反应(droplet digital pcr，ddpcr)由于实现了超灵敏检测和绝对定量而受到越来越多的关注。微滴式数字pcr系统在传统的pcr扩增前对样品进行微滴化处理，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经pcr扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。
[0004]
目前，只有伯乐公司有检测idh1基因的数字pcr探针，且伯乐公司的 idh1基因突变检测探针有5种，故完成一个样品的检测需要5个加样孔。
[0005]
鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0006]
本发明的首要发明目的在于提出一种检测人idh1基因突变的引物和探针。
[0007]
本发明的第二发明目的在于提出一种检测人idh1基因突变的试剂盒。
[0008]
本发明的第三发明目的在于提出一种检测人idh1基因突变的装置。
[0009]
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
[0010]
本发明提出一种用于检测人idh1基因突变的微滴pcr试剂盒，所述试剂盒中含有idh1 ddpcr反应液；
[0011]
所述idh1 ddpcr反应液中含有用于检测idh1 132号密码子突变的引物和探针：由seq id no:1所示的上游引物，由seq id no:2所示的下游引物，由seq id no:3所示的野生型探针和由seq id no:4～seq id no:8所示的突变型探针。
[0012]
可选的，所述探针均带有荧光基团和淬灭基团，所述野生型探针与所述突变型探针的荧光基团不同；
[0013]
优选地，所述荧光基团选自fam、vic、hex、cy5和cy3，所述淬灭基团选自mgb、bqh1、tamara和bhq2；
[0014]
进一步优选的，所述野生型探针的荧光基团选自vic，所述野生型探针的淬灭基团选自mgb，所述突变型探针的荧光基团选自fam、所述突变型探针的淬灭基团选自mgb。
[0015]
可选的，seq id no:4所示的突变型探针用于检测idh1基因r132h型突变、seq id no:5所示的突变型探针用于检测idh1基因r132c型突变、seq id no:6所示的突变型探针用于检测idh1基因r132s型突变、seq id no:7所示的突变型探针用于检测idh1基因r132g型突变、seq id no:8所示的突变型探针用于检测idh1基因r132l型突变。
[0016]
可选的，引物和探针的浓度为0.1～5μm，优选的，引物的浓度为1.8μm，探针的浓度为0.4μm。
[0017]
可选的，所述试剂盒中还含有ddpcr mix3，所述ddpcr mix3中的主要成分包括dntps、kcl、tris-hcl、mgcl
2
、dtt和taq酶。
[0018]
可选的，所述试剂盒中还含有对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照的主要成分为工艺用水，所述阳性对照的主要成分为由 seq id no:9、seq id no:10所示的质粒混合液。
[0019]
可选的，所述微滴pcr试剂盒的待测样本选自石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、血浆和血清。
[0020]
本发明还涉及一种检测基因突变的装置，所述装置包括pcr混合液制备单元、数字pcr反应单元和信息处理单元；
[0021]
所述pcr混合液制备单元用于将待测dna模板与ddpcr反应液混合，制备得到ddpcr混合液；
[0022]
所述ddpcr反应液包括如前所述的idh1 ddpcr反应液。
[0023]
可选的，所述数字pcr反应单元配置用于将所述pcr混合液制作pcr微反应液滴，再进行pcr扩增反应；
[0024]
优选地，所述pcr扩增反应的反应条件为：93～96℃预变性8～15分钟； 93～96℃变性5～50秒，56～60℃延伸30-90秒，共进行30～40个循环，97～99℃保温8～10min，2～5℃终止反应；
[0025]
进一步优选地，所述pcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性15秒，58℃延伸30秒，共进行40个循环，98℃保温10min，4℃保温 5分钟终止反应。
[0026]
本发明还涉及一种用于检测人idh1基因突变的引物和探针，包括：由seq id no:1所示的上游引物，由seq id no:2所示的下游引物，由seq id no:3 所示的野生型探针和由seq id no:4～seq id no:8所示的突变型探针；
[0027]
优选的，所述探针均带有荧光基团和淬灭基团，所述野生型探针与所述突变型探针的荧光基团不同；
[0028]
进一步优选地，所述荧光基团选自fam、vic、hex、cy5和cy3，所述淬灭基团选自mgb、bqh1、tamara和bhq2；
[0029]
更进一步优选的，所述野生型探针的荧光基团选自vic，所述野生型探针的淬灭基团选自mgb，所述突变型探针的荧光基团选自fam、所述突变型探针的淬灭基团选自mgb。
[0030]
本发明的技术方案至少具有以下有益的效果：
[0031]
本发明的试剂盒采用微滴数字pcr技术，对人类的idh1 132号密码子的相关突变进行检测，可用于对胶质瘤患者石蜡包埋病理切片组织中或外周血游离dna中提取dna的
idh1132号密码子的5种突变进行检测，为胶质瘤患者选择肿瘤靶向药物治疗和监测提供参考，具有高特异性、准确性和高灵敏度，主要优势如下：
[0032]
1、idh1突变检测探针包含突变的5种类型，一个反应孔即可检测5种类型，节约成品，简化操作。
[0033]
2、高敏感度、高特异性：检测复杂背景下的靶标序列灵敏度可达0.001％，即突变基因组dna达到总dna的0.001％即可检出，而sanger测序法检测的敏感度约为10％。
[0034]
3、所需样本量少：200μl血浆、1ml全血、2-3片白片及纳克级活检组织，即可完成检测。
[0035]
4、分辨率高：能分辨出单个拷贝的差异，因而特别适合用于低丰度的拷贝数的检测。本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl人基因组dna背景下含 0.001％的相关突变。
[0036]
5、实验数据分析便捷：每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化。
附图说明
[0037]
图1为本发明实施例试剂盒的操作流程图；
[0038]
图2为本发明实施例试剂盒检测idh1基因r132h突变的检测敏感度实验结果；
[0039]
图3为本发明实施例试剂盒检测idh1基因r132s突变的检测敏感度实验结果；
[0040]
图4为本发明实施例试剂盒检测idh1基因r132g突变的检测敏感度实验结果；
[0041]
图5为本发明实施例试剂盒检测idh1基因r132c突变的检测敏感度实验结果；
[0042]
图6为本发明实施例试剂盒检测idh1基因r132l突变的检测敏感度实验结果。
[0043]
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
具体实施方式
[0044]
本发明实施例提出一种采用ddpcr技术的检测试剂盒，用于检测人idh1 基因突变，该试剂盒所适用的ddppcr系统包括微滴发生器和微滴分析仪及其相关的耗材。微滴发生器可将待测dna分区成20000个均匀的纳升级微滴。将微滴转移至96孔pcr板上，使用热循环仪进行pcr扩増dna，在每个微滴中 pcr反应都独立进行。扩增后采用微滴分析仪进行荧光读取，逐个分析样品中的每个微滴。微滴被吸入后，管路将分解乳化的微滴，并使它们依次通过一个双色光学检测系统。有荧光信号的微滴为阳性，没有荧光信号的微滴为阴性，计算阳性和阴性微滴的数量及阳性微滴的比例。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。
[0045]
本发明实施例的试剂盒含有idh1 ddpcr反应液，含有用于检测idh1 132 号密码子突变的引物和探针：由seq id no:1所示的上游引物，由seq id no:2所示的下游引物，由seq id no:3所示的野生型探针和由seq id no:4～seq id no:8所示的突变型探针；
[0046]
可选的，探针均带有荧光基团和淬灭基团，野生型探针与突变型探针的荧光基团不同。
[0047]
可选的，荧光基团选自fam、vic、hex、cy5和cy3；
[0048]
可选的，淬灭基团选自mgb、bqh1、tamara和bhq2。
[0049]
可选的，野生型探针的荧光基团选自vic，野生型探针的淬灭基团选自 mgb，突变
型探针的荧光基团选自fam、突变型探针的淬灭基团选自mgb。
[0050]
可选的，seq id no:4所示的突变型探针用于检测idh1基因r132h型突变、seq id no:5所示的突变型探针用于检测idh1基因r132c型突变、seq id no:6所示的突变型探针用于检测idh1基因r132s型突变、seq id no:7所示的突变型探针用于检测idh1基因r132g型突变、seq id no:8所示的突变型探针用于检测idh1基因r132l型突变。
[0051]
具体的，试剂盒中引物和探针的序列如表1所示：
[0052]
表1
[0053][0054][0055]
可选的，引物和探针的浓度为0.1～5μm；优选的，引物的浓度为1.2～2.5μm，更优选1.8μm，探针的浓度为0.2～0.6μm，更优选0.4μm。
[0056]
可选的，试剂盒中还含有ddpcr mix3，ddpcr mix3中的主要成分包括dntps、kcl、tris-hcl、mgcl
2
、dtt和taq酶；具体为：dntps(20～200μm)、 kcl(适量)、tris-hcl(适量)、mgcl
2
(1.0～4.0mm)、dtt(适量)、taq 酶。
[0057]
可选的，试剂盒中还含有对照品，对照品包括阴性对照和阳性对照，阴性对照的主要成分为工艺用水，阳性对照的主要成分为质粒混合液。
[0058]
其中，阳性对照中含有以下质粒：由seq id no:9所示的idh ddpcr反应液所用质粒idh1-wt、由seq id no:10所示的idh ddpcr反应液所用阳性质粒idh1-r132s。
[0059]
质粒的具体序列如表2所示：
[0060]
表2
[0061][0062]
可选的，微滴pcr试剂盒的待测样本选自石蜡包埋组织切片、穿刺组织、胸水、全血、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、血浆和血清。
[0063]
经检测，各准确性质控品在本申请试剂盒相应的反应液中，检测结果阳性符合率为100％。各特异性质控品在本申请试剂盒相应的反应液中，检测结果阴性符合率为100％。本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl的人基因组 dna的背景下含0.001％的基因相关突变。
[0064]
本发明实施例还提出一种检测基因突变的装置，包括pcr混合液制备单元、数字pcr反应单元和信息处理单元；pcr混合液制备单元用于将待测dna 模板与idh1 ddpcr反应液混合，制备得到ddpcr混合液。
[0065]
可选的，数字pcr反应单元配置用于将所述pcr混合液制作pcr微反应液滴，再进行pcr扩增反应。
[0066]
可选的，pcr扩增反应的反应条件为：93～96℃预变性8～15分钟；93～ 96℃变性5～50秒，56～60℃延伸30-90秒，共进行30～40个循环，97～99℃保温8～10min，2～5℃终止反应。
[0067]
可选的，所述pcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性10分钟；94℃变性15秒，58℃延伸30秒，共进行40个循环，98℃保温10min，4℃保温5分钟终止反应。
[0068]
本发明实施例试剂盒的操作流程图如图1所示，具体包括以下步骤：
[0069]
1、配制pcr反应的预混液；
[0070]
2、在微滴生成仪上进行微滴生成；
[0071]
3、将生成好的微滴放入pcr仪中进行扩增反应；
[0072]
4、在微滴读取仪上对微滴进行逐个读取。
[0073]
具体的，idh1基因突变检测操作步骤具体为：
[0074]
(1)扩增试剂准备及加样：
[0075]
a.从试剂盒中取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：4μl ddpcr+10μl ddpcr mix3，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管14μl的量，分装于各pcr管内；
[0076]
b.基因组dna模板浓度测定(qubit测定)好后，用水稀释至1.6ng/μl，取模板6μl至
数字pcr上样量为10ng，加至装有上述pcr预混液的pcr 管中；
[0077]
c.每个反应体系的总体积为20μl；
[0078]
d.将盖紧pcr管盖，振荡混匀20s以上，瞬时离心后进行微滴制备。
[0079]
(2)微滴生成：根据伯乐公司官方提供的qx200微滴生成仪或qx200 全自动微滴生成仪操作手册进行微滴生成。
[0080]
(3)封膜：微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。
[0081]
(4)pcr扩增：95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环； 98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，注意升降温速度≤2℃/s。
[0082]
(5)微滴读取：根据伯乐公司官方提供的qx200微滴读取仪操作手册进行微滴读取。
[0083]
实施例1
[0084]
一种检测人idh1基因突变的微滴pcr试剂盒，其组成如表3所示：
[0085]
表3：
[0086][0087]
微滴pcr试剂盒各组分的包装及含量如表4所示：
[0088]
表4
[0089][0090]
实施例2试剂盒分析性能评估：
[0091]
1、制备分析特异性质控品，具体制备方法如表5所示：
[0092]
表5
[0093]
编号标本种类idh1-n1idh1-132位点野生型的肺癌基因组dna，稀释至1000拷贝/μlidh1-n2idh1-132位点野生型的肠癌基因组dna，稀释至1000拷贝/μl
[0094]
2、制备准确性质控品，具体制备方法如表6所示：
[0095]
表6
[0096][0097]
3、制备精密度质控品，具体制备方法如表7所示：
[0098]
表7
[0099][0100]
4、制备检出限质控品具体制备方法如表8所示：
[0101]
表8
[0102][0103]
得到的实验结果如表9所示：
[0104]
表9
[0105][0106]
根据以上结果，各反应液特异性均为阴性，准确性、检出限均为阳性，精密度cv值≤5％。
[0107]
实施例3：
[0108]
采用ddpcr方法对idh1突变的不同类型(r132h、r132s、r132g、 r132c、r132l)进行敏感性检测。
[0109]
选取经sanger测序法验证的不同突变类型(r132h、r132s、r132g、 r132c、r132l)的idh1突变样本dna，使用阴性样本基因组进行梯度稀释，稀释后的突变百分比如图2～6所示，测定试剂盒的检测敏感度。
[0110]
得到的实验结果如图2～6所示，根据图2～6可以看出，对于不同突变类型的样本，在低至0.001％～0.1％的范围内，均能检出阳性扩增点。发现检测敏感度达0.001％。
[0111]
实施例4：
[0112]
选取2009-2018年在陆军军医大学就诊的80例胶质瘤患者，提取其石蜡包埋标本中的基因组dna，分别采用sanger测序、arms法和ddpcr法检测每个标本的idh1基因。
[0113]
得到实验结果如表10所示。
[0114]
表10
[0115] idh1基因突变sanger测序43arms4
ddpcr56
[0116]
80例患者的临床资料，包括组织学类型、who分级、用不同检测方法检测的idh1基因的突变结果如表11所示。
[0117]
表11
[0118]
[0119]
[0120][0121]
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

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