一种谷胱甘肽硫转移酶保护的金-银纳米簇的制备方法及其在土霉素检测中的应用与流程

2021-02-02 16:02:07|

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本发明涉及金-银纳米簇合成技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽硫转移酶保护的金-银纳米簇的制备方法及其在土霉素检测中的应用。

背景技术：

谷胱甘肽硫转移酶是一类可与细胞质或细胞膜结合的多功能酶家族，存在于所有生物中，可溶性谷胱甘肽硫转移酶广泛分布于全身，在肝脏、肾脏、大脑等都起着重要作用。它催化还原谷胱甘肽，生成多种亲电性物质，从而保护细胞免受药物、内源性过氧化物自由基和有毒代谢物等有毒化学物质的侵害，许多内源性化合物如前列腺素和类固醇的代谢也与谷胱甘肽结合反应有关。因此，谷胱甘肽硫转移酶的主要生物学功能是防御通过正常代谢过程产生的还原性和毒性亲电性物质。

小尺寸(<2.2nm)的金属纳米团簇在有适当配体保护时通常表现出较强的荧光，同时蛋白保护的金属纳米簇在有适当配体时表现出强烈荧光，金属纳米簇一般不会显著改变蛋白的二级结构和生物功能，具有独特的光物理特性、尺寸小、低毒性和优异的生物相容性等优点，是应用于生物和医学领域的理想荧光材料。

土霉素是一种常用的广谱抗菌药，但具有在骨内积聚，造成水土污染等缺点，而传统检测方式耗时，选择性低，因而急需一种方便快捷高效的检测方法，谷胱甘肽硫转移酶可保护细胞免受有毒化学物质侵害，但目前为止没有直接的方法来确认它与四环素之间的相互作用，因此，开发荧光传感等新技术就显得至关重要。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明提供了一种谷胱甘肽硫转移酶保护的金-银纳米簇的制备方法及其在土霉素检测中的应用，以谷胱甘肽硫转移酶为保护剂和还原剂，采用改进的一步加热法制备金-银纳米簇，具有独特的光物理特性、超小的尺寸、低毒性和优异的生物相容性；检测土霉素方法快速简单、检测灵敏度好。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种谷胱甘肽硫转移酶保护的金-银纳米簇的制备方法，具体步骤如下：

第一步、通过大肠杆菌表达谷胱甘肽硫转移酶，产物通过谷胱甘肽亲和层析柱及快速蛋白液相色谱进行分离和纯化，得到谷胱甘肽硫转移酶溶液，待后续使用；

第二步、将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为5.0-20.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌；

第三步、10秒后加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节至3-11；

第四步、当上述溶液颜色由淡黄色变为无色时，加入20μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液进行反应；

第五步、用分子截留量为8000-14000da的透析袋在磷酸缓冲溶液中透析24小时，去除多余的反应物，使蛋白的二级结构尽可能的恢复到天然状态，得到激发波长为395nm，发射波长为653nm的荧光金-银纳米簇；

第六步，将上述产品在温度为4℃下储存。

优选地，所述步骤(二)中，氯金酸水溶液的浓度为10mm，谷胱甘肽转移酶溶液的浓度为10.0mg/ml。

优选地，所述步骤(四)中，反应条件：反应温度为50-90℃，反应时间为1小时，金离子和银离子摩尔比为6:1，谷胱甘肽硫转移酶、氯金酸和硝酸银混合溶液的ph为11。

优选地，所述步骤(四)中，反应条件：反应温度为70℃，反应时间为1小时，金离子和银离子摩尔比为6:1，谷胱甘肽硫转移酶、氯金酸和硝酸银混合溶液的ph为11。

本发明提高产物的发光性能，包括以下步骤：

本发明首先在37℃条件下合成谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇，观察荧光光谱，此时几乎观察不到产物发光；因此为了使蛋白完全变性并暴露谷胱甘肽硫转移酶中的络氨酸或色氨酸残基，分别将反应温度提高到50、60、70、80和90℃；如图2所示，较高的反应温度得到产物的荧光更强，在70℃时发光强度最强，因此选择70℃作为制备谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的最佳反应温度。

如图3所示，在反应温度为70℃时，在不同的反应时间下监测产物荧光，荧光强度随着时间增加逐渐减弱，最佳反应时间为1小时。通过比较含有不同摩尔比的金/银离子的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的荧光强度，如图4所示，可发现当金离子和银离子摩尔比为6:1时，可得到荧光强度最强的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇。为了改善产品的发光特性，本发明通过改变混合物中谷胱甘肽硫转移酶的浓度来实现，如图5所示，5mg/ml谷胱甘肽硫转移酶显示微弱荧光，当谷胱甘肽硫转移酶的浓度为10mg/ml时发光强度增加。如图6所示，在添加银离子之前，用氢氧化钠调节谷胱甘肽硫转移酶和氯金酸混合液的ph至11以改善谷胱甘肽硫转移酶的还原力。

因此，本发明合成谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的最佳反应条件为反应温度70℃，反应时间1小时，金离子和银离子摩尔比为6:1，溶液ph为11，以及溶液浓度分别为10mm氯金酸和10mg/ml谷胱甘肽硫转移酶的混合溶液。

本发明还提供了一种谷胱甘肽硫转移酶保护的金-银纳米簇在土霉素检测中的应用，包括体外检测四环素和细胞水平监测土霉素的适用性。

如图7所示，当四环素不存在时，浓度为0.2mg/ml的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇在390nm激发波长下，在653nm处有微弱的荧光发射峰。随着四环素浓度的不断增加，谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的荧光强度随之增强并在512nm处出现一个新的发射峰。另外，将四环素加入谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液中，在白色光下比色图像中显示出轻微的变化(如图8所示)，而紫外光下荧光强度明显增加，并且谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇和四环素的混合溶液的荧光由红光蓝移至绿光(如图9所示)。进一步监测谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇在细胞水平对土霉素的特异性响应，在405nm激发波长下，hepg2细胞的激光共聚焦扫描显微镜照片显示弱红光；加入80μm土霉素并培养4小时后，荧光从红光增强并蓝移为绿光，如图10所示。这些结果表明，谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇是一种良好的用于检测溶液中及细胞内四环素的荧光传感器。

本发明有益效果：

1、本发明以谷胱甘肽硫转移酶为保护剂和还原剂，采用改进的一步加热法制备金-银纳米簇。

2、本发明制备的金-银纳米簇作为一种有效的环境友好型荧光探针可用于检测溶液和活细胞中的土霉素，具有独特的光物理特性、超小的尺寸、低毒性和优异的生物相容性。

3、本发明检测土霉素的方法快速简单、检测灵敏度好，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。

附图说明

图1是本发明谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液的激发波长和发射波长的示意图；

图2是本发明不同温度时的荧光强度的示意图；

图3是本发明不同反应时间的荧光强度的示意图；

图4是本发明不同金/银摩尔比的荧光强度的示意图；

图5是本发明不同浓度的谷胱甘肽硫转移酶的荧光强度比较示意图；

图6是本发明溶液ph对荧光强度的影响示意图；

图7是本发明在不同四环素浓度下谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液的荧光光谱示意图；

图8是本发明加入不同浓度的四环素后谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液的日光比色照片示意图；

图9是本发明加入不同浓度的四环素后谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液在365nm发射波长紫外灯下的荧光照片示意图；

图10是本发明谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的细胞成像照片(图a-c)以及加入土

霉素后的细胞成像照片示意图(图d-f)。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明的技术方案进行说明。

参照图1-图10，(一)谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇的合成与优化

实施例一：金离子与银离子比例的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入30μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例二：金离子与银离子比例的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入20μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例三：金离子与银离子比例的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入15μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例四：金离子与银离子比例的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入12μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例五：实施例一、实施例二、实施例三、实施例四得到的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇，通过荧光光谱仪检测在395nm激发波长下产物的发光情况。

实施例六：谷胱甘肽硫转移酶浓度的优化；首先将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为5.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入20μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例七：谷胱甘肽硫转移酶浓度的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入20μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例八：谷胱甘肽硫转移酶浓度的优化；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为20.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调节到11。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入20μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例九：实施例六、实施例七、实施例八得到的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇，在395nm激发波长下产生荧光，通过比较其荧光强度，如图5所示，可以发现，当谷胱甘肽硫转移酶水溶液的浓度为10mg/ml时，荧光强度最高。

实施例十：反应溶液ph调控；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调至酸性(～3)。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入30μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例十一：反应溶液ph调控；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调至中性(～7)。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入30μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例十二：反应溶液ph调控；将120μl浓度为10mm的氯金酸水溶液、500μl浓度为10.0mg/ml的谷胱甘肽转移酶水溶液和320μl的超纯水溶液混合并搅拌。10秒后，加入40μl浓度为1m的氢氧化钠溶液，将ph值调至强碱性(～11)。溶液在1分钟内由淡黄色变为无色，然后加入30μl的浓度为10mm的硝酸银水溶液，快速加热至70℃，反应1小时。

实施例十三：实施例十、实施例十一、实施例十二得到的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇，通过荧光光谱仪检测在395nm激发波长下产物的发光情况。

(二)谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇作为荧光探针检测土霉素

实施例十四：利用谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇作为荧光探针体外检测四环素；合成的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇在395nm的激发波长下，在653nm处有红光发射峰。将0-80μm不同浓度的四环素溶液加入0.2mg/ml的谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇溶液中，混合均匀且静置15分钟后，利用荧光光谱仪检测混合溶液的荧光光谱。

实施例十五：探究谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇在细胞水平监测土霉素的适用性，以hepg2细胞为例，在37℃条件下，将细胞与谷胱甘肽硫转移酶-金-银纳米簇(终浓度为0.2mg/ml)共同孵育24小时后，在405nm激发波长下，通过激光共聚焦扫描显微镜观察hepg2细胞的发光情况；进一步加入终浓度为80μm的土霉素溶液，继续培养4小时，再利用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞发光情况。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

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