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您当前的位置： 肽酰精氨酸脱亚胺酶用于获得改良食品的用途的制作方法
2021-02-02 16:02:49|
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起点商标网 [0001]本发明涉及食品领域。
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：：[0002]在人口不断增长的世界中存在着增加的蛋白质需求。为了应对这种不断增长的蛋白质需求，需要着眼于蛋白质的更广泛应用。另外，期望寻找植物蛋白作为动物蛋白的替代物，因为认为植物是比动物更可持续的蛋白质来源。植物蛋白在食品中的使用部分地由于不良的可消化性、味道和营养价值而仍然受到限制。[0003]含有较少精制谷物和粮食豆类(grainlegumes)的饮食中的蛋白质的不良可消化性是由于其中存在在加工期间存在或形成的不太容易消化的蛋白质级分、高水平的不溶性纤维和/或高浓度的抗营养因子。已知饮食中的抗营养因子(antinutritionalfactor,anf)会负面地影响食品的蛋白质可消化性、氨基酸生物利用度和蛋白质品质(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。[0004]大豆和其他粮食豆类中高水平的胰蛋白酶抑制剂的存在已在大鼠和猪中显示导致了蛋白质可消化性的显著降低(高达50％)(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。基于这些抑制剂的抑制位点处的残基，这些抑制剂可以为赖氨酸或精氨酸型抑制剂。大豆是胰蛋白酶抑制剂的主要来源，占脱脂豆粕中蛋白质的约6％。存在两种主要类型的胰蛋白酶抑制剂，在反应位点处具有精氨酸的kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(ksti)和在抑制位点处具有赖氨酸的bowman-birk抑制剂(bbi)。[0005]大豆的湿热处理(100℃持续20分钟)使抑制剂的一部分失活，然而显著量的原始胰蛋白酶活性得以保持。完全破坏抑制活性所需的长时间加热会显著降低大豆产品的蛋白质可消化性和品质(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。据报道几种商业大豆饮料含有总抑制活性的高达约70％。此外，发现基于大豆的婴儿配方食品含有28％。生大豆中的胰蛋白酶抑制剂在易感动物中引起生长抑制和胰腺肿大。[0006]制作基于植物的蛋白饮料的另一个重要因素是所述饮料的味道和口感。植物蛋白具有不好的味道，例如苦味和加重的口感，即使在低蛋白质含量的情况下也如此。而且，许多植物蛋白饮料含有非常低量的蛋白质，从而使得它们是不那么营养和不那么美味的食物。[0007]wo2008/000714公开了一种蛋白质精氨酸脱亚氨酶以及该酶在具有增加量的瓜氨酸的食物产品的制备中的用途。[0008]wo2017/009100公开了一种改善植物蛋白(例如豌豆蛋白、大豆蛋白和稻米蛋白)的溶解度的方法，其中将所述植物蛋白与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起孵育。在与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起孵育后，植物蛋白(例如豌豆蛋白)的发泡能力降低。[0009]本领域中存在改善包含(植物)蛋白质的食物的特性的需要。附图说明[0010]图1：吸光度随时间推移的变化(如实施例1中所述的baee连续测定)与所述测定中的胰蛋白酶活性直接相关。样品“减pad”表示在抑制蛋白存在下的胰蛋白酶活性，而“加pad”表示在用pad酶预处理的抑制蛋白存在下测量的胰蛋白酶活性。箭头表示通过酶pad的作用胰蛋白酶抑制活性(tia)的降低程度。[0011]图2：未经酶处理(空心圆圈)和用pad酶处理过(黑色圆圈)的symphyd消化模型中随时间推移从rpi释放的nh2。箭头分别表示在5分钟时胃蛋白酶的添加点和在80分钟时胰酶的添加点。[0012]图3：如实施例4中所述对使用和不使用pad酶处理的豆浆进行的感官小组评定。黑色条形柱代表大豆饮品的感官方面，并且填充有图案的条形柱代表用pad酶处理过的大豆饮品的感官方面。属性“粉状-白垩质口感”代表粉状/白垩质(chalk)口感，“饱满度口感”表示饱满度口感，并且“粘稠口感”代表口中的稠度。[0013]图4：使用或不使用pad处理的2％油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性。■：未用pad处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；◆：用2upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；▲：用20upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；●：用60upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性。感官属性是涩味口感(i)、风味强度(ii)、甜味(iii)、苦味(iv)、甘草味(v)、苦余味(vi)，余味持续时长(vii)和涩余味(viii)。[0014]图5：与pad酶一起孵育的各种植物饮品的等电聚焦(ief)凝胶：泳道1—豌豆饮品(bolthousefarmunsweetened)；泳道2—与pad一起孵育的豌豆饮品(bolthousefarmunsweetened)；泳道3—大豆饮品(provamelunsweetened)；泳道4—与pad一起孵育的大豆饮品(provamelunsweetened)；泳道5—豌豆饮品(rippleunsweetened)；泳道6—与pad一起孵育的豌豆饮品(rippleunsweetened)；以及泳道7—pi标记。[0015]图6：pad酶在不同ph和温度下的相对稳定性。在进行活性测量之前，将ph7和4℃孵育时的酶活性设定为100％。三角形—37℃时的酶稳定性；圆圈表示如实施例7中所述在4℃时的酶稳定性。[0016]序列表[0017]seqidno:1为来自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)的肽酰精氨酸脱亚氨酶技术实现要素：[0018]本发明涉及一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法。[0019]本发明还涉及肽酰精氨酸脱亚氨酶(peptidylargininedeiminase,pad)用于改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。[0020]本发明还涉及一种包含肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)的营养补充剂。具体实施方式[0021]植物蛋白的不良可消化性部分是由于高水平的抗营养因子(anf)，例如胰蛋白酶抑制剂。由植物蛋白制备的饮品的口感通常被描述为不可接受的。在本发明之前，尚无可接受的解决方案可用于克服植物蛋白饮品的这些缺陷。通常，这同样适用于含蛋白质的食物。[0022]pad将蛋白质中的精氨酸残基脱亚氨成为瓜氨酸。对于其中精氨酸占据反应位点的胰蛋白酶抑制剂，pad作用会使该抑制剂对胰蛋白酶失去活性。糜蛋白酶(chymotrypsin)的蛋白酶抑制剂和α-淀粉酶抑制剂也以与胰蛋白酶抑制剂相似的方式有助于降低食物的可消化性。这些抑制剂中的几种已显示具有对抑制功能重要的关键精氨酸残基(gideonm.polya,atta-ur-rahman编辑，studiesinnaturalproductschemistry，第29卷，第567-641页)。[0023]所有蛋白酶抑制剂中的约10％在反应性p1位点处含有精氨酸(r)残基(在merops数据库中对于蛋白酶抑制剂找到的3300个序列中的309个序列)。在p1位点处具有“r”的胰蛋白酶抑制剂可在所有种类的植物蛋白(例如豆类、谷物、坚果和种子，如大豆、油菜籽、坚果、小麦、玉米、大麦、马铃薯、稻、燕麦、西红柿等)中找到，然而并非所有抑制活性均被发现为在不同物种内相等地分布。例如，马铃薯中约40％的蛋白质是蛋白酶抑制剂，其中存在许多不同类别的蛋白酶抑制剂(已鉴定出多于10种蛋白酶抑制剂)并且这些抑制剂的分布取决于马铃薯品种(pouvreaul.等人，j.agric.foodchem.,2001，第49卷，第2864-2874页)。[0024]先前已显示可以使用哺乳动物pad酶使kunits大豆胰蛋白酶抑制剂失活(h.takahara等人，1985,thejournalofbiologicalchemistry，第260卷，第14期，第8378-8383页)。然而，从未有人公开复杂蛋白质基质(例如大豆粉)中tia(胰蛋白酶抑制剂活性)的失活。为了使食物产品受益，在复杂食物基质中的pad活性是至关重要的。此外，哺乳动物pad对含精氨酸的蛋白质材料具有狭窄的选择性—并非所有含精氨酸残基的蛋白质都可以使用哺乳动物pad2酶进行修饰。有研究表明，在一个胰蛋白酶抑制反应位点处含有精氨酸残基的鸡蛋清卵类粘蛋白无法被哺乳动物pad酶修饰。相比之下，我们在这里表明微生物pad可降低鸡蛋清卵类粘蛋白中的胰蛋白酶抑制活性，从而使该酶适合用于含有蛋白酶抑制活性的多种蛋白质食物中。同样，先前的研究已表明，花生中的胰蛋白酶-糜蛋白酶抑制剂biii可以用哺乳动物pad酶进行修饰，然而，并非所有参与蛋白酶抑制活性的精氨酸残基都可以被修饰(tomofumikurokawa等人，j.biochem,1987，第101卷，第1361-1367页)。然而，这项研究着眼于酶对来自花生的纯化的花生biii蛋白酶抑制剂的效应。在本发明中，结果表明微生物pad可降低整个花生中的胰蛋白酶抑制活性，不仅仅包括biii胰蛋白酶抑制活性。在更复杂的食物(例如经加工的花生酱)中也可以看出本发明中的微生物酶pad的效应。[0025]令人惊讶地，本发明的发明人证明，使用pad可改善包含蛋白质的食物的感官和/或口感和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的不同方面。[0026]在本发明的各方面中的一个方面中，本发明涉及一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0027]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0028]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0029]优选地，本发明的方法改变了上述特性中的至少一种特性，即本发明的方法提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的甜味的方法。或者，本发明提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的甘草味的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的涩味的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的粉状/白垩质的方法。或者，本发明提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的饱满度的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的稠度的方法。本发明还提供了一种改变(优选地增加)包含蛋白质的食物的可消化性的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的蛋白酶抑制活性的方法。在另一个优选的实施方式中，本发明的方法改变了上述特性中的至少2种、3种或4种特性，例如用于改变包含蛋白质的食物的粉状/白垩质、饱满度和稠度的方法。[0030]如本文所用，术语“甜味”是指当吃富含糖的食物时最常被感知的基本味道。[0031]如本文所用的术语“甘草味”是指存在于光果甘草(glycyrrhizaglabra)或甜叶菊植物物种的甜根中的味觉/组分。[0032]如本文所用的术语“涩味”是指类似于由例如在许多水果中发现的单宁或由蛋白质尤其是在酸性环境中引起的干燥、敛口(puckering)的口感。[0033]如本文所用的术语“粉状/白垩质”是指产品在口腔中感觉呈粉状或粒状的程度。[0034]如本文所用的术语“饱满度”是指口腔中饱满圆润的感觉。[0035]如本文所用的术语“稠度”是指口腔中的坚实度，并且表示将产品推入舌头和上颚之间所需的力。[0036]如本文所用，术语“可消化性”是指被消化的能力，并且涉及相对于被消耗的食物量由身体所保留的食物量。蛋白质的可消化性直接涉及消化性蛋白酶(例如胃蛋白酶和胰肽酶)在生理相关条件下与所述蛋白质一起孵育时获得的水解程度。[0037]如本文所用的术语“蛋白酶抑制活性”是指抑制蛋白酶(有助于蛋白质分解的酶)的功能的活性(优选地蛋白质)。[0038]术语“改变”是指根据所针对的目标而增加或降低。例如，本发明提供了一种增加包含蛋白质的食物的可消化性的方法，所述方法包括：[0039]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0040]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0041]本发明还提供了一种降低包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度和/或稠度的方法，所述方法包括：[0042]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0043]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0044]本发明还提供了一种降低包含蛋白质的食物的蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括[0045]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0046]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0047]通过与区别仅在于蛋白质溶液未与pad一起孵育而其他方面完全相同的制备的食物进行比较，来确定上述特性中的任何特性是增加还是降低。[0048]术语“包含蛋白质的食物”是指这样的食物，所述食物包含蛋白质作为其组分中的一种组分或作为所添加的成分，即含蛋白质的食物。包含蛋白质的食物优选地包含至少0.1％的蛋白质。任何合适的蛋白质均可用于本发明的方法中。有利地，蛋白质包含蛋白质结合的精氨酸，例如至少1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％或至少6mol％。[0049]蛋白质溶液(或者：食物蛋白质成分)是包含蛋白质的液体蛋白质组合物。如果包含蛋白质的食物的可消化性被改变(优选地增加)，则蛋白质溶液包含蛋白酶抑制剂活性。在蛋白酶抑制活性被改变(优选地降低)的情况下，蛋白质溶液包含蛋白酶抑制剂活性。如本文所用，术语“蛋白酶抑制剂活性”是指添加到蛋白酶中而降低蛋白酶活性的肽。术语“蛋白质溶液”还包括并非所有组分都溶解的溶液，即术语“蛋白质溶液”还包括蛋白质悬浮液。[0050]“将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育”的步骤可以在任何合适的ph下以任何合适的时间和任何合适的酶浓度执行。技术人员将能够确定合适的酶量或合适的孵育温度或合适的孵育ph或合适的孵育时间，例如将蛋白质与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起在介于4与9之间的ph，例如介于5与8.5之间的ph，例如介于5.5与8之间的ph，例如介于6与7之间的ph，或介于6.2与6.8之间的ph，例如约6.5的ph下孵育。蛋白质与pad一起孵育的合适温度可介于20摄氏度与60摄氏度之间，例如介于30摄氏度与50摄氏度之间，或介于35摄氏度与45摄氏度之间。[0051]经pad处理的蛋白质溶液可例如为最终产品，例如但不限于蛋白质饮品。或者，经pad处理的蛋白质溶液是食物成分，所述食物成分随后可以被进一步加工成包含蛋白质的食物。[0052]如上所述，在本发明的方法中可以使用任何合适的蛋白质。在一个优选的方面中，本发明方法中的蛋白质是植物蛋白(plant/vegetableprotein)(所述术语在本文中可互换使用)。优选地，用于本发明的方法中的蛋白质溶液是包含植物蛋白(例如大豆蛋白、油菜籽蛋白、小麦蛋白、荞麦蛋白、玉米蛋白、大麦蛋白、马铃薯蛋白、稻米蛋白、燕麦蛋白、豌豆蛋白、(花生)坚果蛋白、羽扇豆蛋白、杏仁蛋白)的溶液，或者所述蛋白质是卵蛋白、乳蛋白、明胶蛋白或微生物蛋白。[0053]本发明的方法包括将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育的至少一个步骤。如上所述并且根据蛋白质溶液是食物成分还是最终的包含蛋白质的食物，本发明的方法任选地包括将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物的步骤。根据起始材料，在本发明的方法中可包括另外任选的物质。如果起始材料是粉状物质(flour)(例如但不限于植物蛋白粉)，则本发明的方法将包括溶解所述粉状物质以获得蛋白质溶液的步骤。粉状物质的溶解通常涉及向所述粉状物质中添加液体(例如水或缓冲液)，以及使粉状物质至少部分地溶解在所述液体中。取决于粉状物质的特性，可能需要将所述粉状物质与液体混合达一定量的时间，任选地使用一些热量以改善/加速溶解。或者，在水或合适的缓冲液中制备悬浮液。即，本发明方法的任选附加步骤是：包括溶解粉状物质以获得蛋白质溶液或由粉状物质制备悬浮液。[0054]术语蛋白质精氨酸脱亚氨酶和肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)在本文中可互换使用。蛋白质精氨酸脱亚氨酶或肽酰精氨酸脱亚氨酶属于将结合肽或蛋白质的精氨酸转化为结合肽或蛋白的瓜氨酸的酶(ec3.5.3.15)的家族。该过程被称为脱氨基或瓜氨酸化。在从精氨酸到瓜氨酸的反应中，精氨酸侧链的末端氮原子中的一个末端氮原子被氧取代。该反应使用一个水分子，并且产生氨作为副产物(http://en.wikipedia.org/wiki/citrullination)。精氨酸在中性ph下带正电，然而瓜氨酸不带电。令人惊讶地，发现其中至少一部分精氨酸已被转化为瓜氨酸并由此产生了带较少电荷的蛋白质显示出改良的甜度、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性。末端截短、糖基化、磷酸化(pohosphorylation)，以及通过切割去除前导序列(例如信号肽、前肽和/或前原肽)。[0062]seqidno:1的成熟多肽序列可包含或含有seqidno:1的氨基酸序列的氨基酸19、20、21、22、23、24至640，有利地，seqidno:1的成熟多肽序列包含或含有seqidno:1的氨基酸22至640，其中在seqidno:1中的位置1处的甲硫氨酸被计数为序数1。[0063]术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并含有多于五个氨基酸残基的分子。如本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且还可以指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。可任选地修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化等)多肽以增加官能性。在某些条件下在特定底物存在下表现出活性的多肽可称为酶。[0064]肽酰精氨酸脱亚氨酶或具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽可以通过本领域中已知的方法在任何合适的宿主生物中产生，例如在真菌曲霉属(aspergilli)(例如黑曲霉(aspergillusniger)或米曲霉(aspergillusoryzae))、木霉属(trichoderma)或酵母酵母属(saccharomyces)和克鲁维酵母属(kluyveromyces)中或在链霉菌属(streptomyces)或杆菌属(bacilli)的细菌中产生。一种在黑曲霉中表达具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽的合适方法例如在wo2008/000714的实施例3和4中公开，所述专利文献以引用方式包括在本文中。[0065]本文所用的术语“包含蛋白质的食物”是指任何类型的食物，只要所述食物至少包含蛋白质即可。术语食物是指固体食物和饮品。[0066]在本发明的各实施方式中的一个实施方式中，本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0067]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0068]任选地，将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是包含蛋白质的饮品，即旨在用于食用的液体。[0069]包含蛋白质的饮品可以是任何类型的饮料，但是在优选的方面中，包含蛋白质的饮品是植物蛋白饮品或发酵植物蛋白产品。合适的植物蛋白饮品的示例是大豆饮品、豌豆饮品、花生饮品、大麦饮品、稻米饮品、燕麦饮品、藜麦饮品、杏仁饮品、腰果饮品、椰子饮品、榛子饮品、大麻饮品、芝麻籽饮品、小麦饮品、马铃薯饮品或葵花籽饮品。合适的发酵植物蛋白产品的示例是发酵大豆产品、发酵豌豆产品、发酵花生产品、发酵大麦产品、发酵稻米产品、发酵燕麦产品、发酵藜麦产品、发酵杏仁产品、发酵腰果产品、发酵椰子产品、发酵榛子产品、发酵大麻产品、发酵芝麻籽饮品、发酵小麦产品、发酵马铃薯产品或发酵葵花籽产品。[0070]大豆蛋白通常用于制备婴儿(infant)饮品、较大婴儿(follow-on)饮品或幼儿(toddler)饮品。通过使用本发明的方法可以改善诸如甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性的特性。因此，本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0071]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0072]任选地，将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是包含蛋白质的饮品，其中所述饮品是婴儿饮品、较大婴儿饮品或幼儿饮品，并且其中所述蛋白质是大豆蛋白。[0073]所生产的包含蛋白质的饮品可以是使用或不使用附加蛋白质生产的饮品。蛋白质强化(植物)蛋白饮品提供了例如提高的营养价值的优点，但是由于例如粉状/白垩质、饱满度、稠度的不期望特性而通常被认为难以食用。用本发明的方法制备的蛋白质强化(植物)蛋白饮品具有改善的(降低的)粉状/白垩质、饱满度、稠度，因此本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0074]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0075]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是蛋白质强化的(植物)蛋白质饮品。蛋白质强化饮品的一个示例是用于老年人或(手术后)康复者增加其热量摄入的蛋白质强化饮品。或者，此类蛋白质强化饮品是药物或临床饮品或运动饮品。[0076]通过本发明的方法制备的包含蛋白质的饮品可具有中性或酸性ph。[0077]本发明还提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甘草味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。本发明的方法的上述特征同样适用于用途部分。[0078]由本文所述的方法中的任何方法直接获得的产品也在本发明的范围内。[0079]在另一方面，本发明提供了一种营养保健组合物，所述营养保健组合物包含肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)，优选地微生物肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)。更优选地，所述微生物肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)与seqidno:1具有至少80％的同一性，或与seqidno:1的成熟氨基酸序列具有至少80％的同一性。[0080]如本文所用的术语营养保健表示在营养和药物应用领域两者中的有用性。因此，该新颖营养保健组合物可用作食物和饮料的补充剂，以及用作肠内或肠胃外应用的药物制剂或药物，所述药物制剂或药物可为固体制剂(例如胶囊或片剂)或液体制剂(例如溶液或悬浮液)。如从前文所述可明显看出的，术语营养保健组合物还包括通过本文所述的方法中的任何方法获得的食物和饮品，以及补充剂组合物，例如膳食补充剂。[0081]如本文所用的术语膳食补充剂是指通过口腔摄取的产品，所述产品含有旨在补充膳食的“膳食成分”。这些产品中的“膳食成分”可包括：维生素、矿物质、中草药或其他植物药、氨基酸，以及诸如酶、器官组织、小腺和代谢产物之类的物质。膳食补充剂也可以是提取物或浓缩物，并且可以多种形式存在，例如片剂、胶囊剂、软胶囊、囊形片、液体或粉末散剂。它们也可为其他形式，例如条形，但是如果它们是其他形式，则膳食补充剂的标签上的信息通常将不会将所述产品表示为常规食物或餐食或膳食的唯一项。[0082]本发明将在下面的实施例中更详细地解释，所述实施例不限制本发明。[0083]实验部分[0084]材料[0085]肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达[0086]如在wo2008/000714的实施例3和4中所公开的那样进行seqidno:1的具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽的克隆和表达。[0087]肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)活性[0088]通过测量α-n-苯甲酰基-l-精氨酸-乙酯(baee)中瓜氨酸残基的形成来确定肽酰精氨酸脱亚氨酶活性。孵育混合物含有100mm的tris-hcl缓冲液(ph7.5)、5mm的cacl2、10mm的dtt、10mm的baee，最终体积为700μl。在55℃下执行孵育30分钟，并通过添加100μl8nhclo4终止反应。按照andknappe,(1968)anal.biochem.26,188的方法通过比色法来测定瓜氨酸。[0089]一单位的肽酰精氨酸脱亚氨酶表示1μmol形成的瓜氨酸/min/mg蛋白质。[0090]实施例1[0091]用pad酶处理过的蛋白质中胰蛋白酶抑制活性(tia)的降低[0092]将各种含有tia的蛋白质与pad一起孵育，并通过两种不同的测定来测量tia的降低。进行和不进行pad孵育的蛋白质的制备以及用于测量tia的测定如下所述。[0093]豆浆样品制备：用600μl自来水稀释来自本地商店的400μl商业大豆饮品(provamelunsweetened)。随后添加0.17u/mlpad，并将溶液在40℃(混匀仪，600rpm)下孵育2.5小时。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0094]大豆粉样品制备：将1克大豆与49g0.01nnaoh混合。用4nhcl将该悬浮液的ph调适至10。将悬浮液在环境温度下用磁力搅拌充分混合3小时。随后将样品以3200*g离心10分钟。将上清液(不包括含脂质的上部部分)再次以20817g离心10分钟。向150μl的所得上清液中添加0.04upad，并将溶液在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育30分钟。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0095]鸡蛋清卵类粘蛋白样品制备：将卵类粘蛋白(sigma)在100mmhepes、5mmcacl2、5mmdtt，ph7.2中溶解(0.25mg/ml)。向其中添加0.17u/mlpad并在37℃下孵育。用25μl0.2medta终止反应。[0096]油菜籽饼样品制备：[0097]向100mg油菜籽饼(从冷榨油菜籽油籽粕获得)中添加900μl的2％nacl和0.17单位的pad。将油菜籽在55℃下在混匀仪中以800rpm溶解30分钟。此后，将样品以20817g离心10分钟。将对照油菜籽饼样品在没有pad的情况下溶解。[0098]油菜籽蛋白分离物(rpi)样品制备：[0099]如专利wo2018/007492中所述从冷榨油菜籽油籽粕开始制备rpi。从该样品制备rpi的2％(w/v)溶液。随后添加0.17u/mlpad，并将溶液在40℃(混匀仪，600rpm)下孵育2.5小时。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0100]花生和花生酱样品制备：从本地商店购买花生(带壳)。除去壳，并将一份花生与四份水(w/w)混合。在本地商店购买花生酱(terrasana牌)，并与3份水(w/w)混合。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad或水(对照)，并在40℃下孵育2小时。随后将1份用2份10mm乙酸稀释。如下所述分析125μl(tia测量)。[0101]大麦样品制备[0102]将一克大麦在10ml水中混合(磁力搅拌)。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育90分钟。作为对照，添加水代替pad。[0103]荞麦粉和荞麦饮品样品制备：[0104]在混合下在水中制备从本地商店购买的荞麦粉的10％溶液。原样使用从本地商店购买的生物荞麦饮品(品牌名称isola)。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育100分钟。为了进行对照孵育，添加水代替pad。如下所述使用azocasein测定来测量胰蛋白酶抑制活性。[0105]羽扇豆样品制备[0106]从本地生产商获得羽扇豆种子，并将其进一步加工成粉在水中的10％悬浮液。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育100分钟。为了进行对照孵育，添加水代替pad。如下所述使用azocasein测定来测量胰蛋白酶抑制活性。[0107]tia测量[0108]使用baee测定进行tia测量[0109]在此使用的测定基本上如在sigma方案“用于胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法”(“assaymethodfortrypsininhibitoractivity”，https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin-inhibitor.html)中所述。将25μl1mg/ml胰蛋白酶在1mmhcl中的溶液(sigma；胰蛋白酶来自牛胰腺；15267单位/mg固体)添加到1.875ml1mmhcl中。随后将100μl如上所述制备的蛋白质样品(使用或不使用酶孵育)添加到反应混合物中。作为对照，在胰蛋白酶活性测量中添加100μl1mmhcl代替抑制剂。将这些溶液在环境温度下孵育5分钟。[0110]向2.7ml67mm磷酸钠ph7.6(25℃)中添加300μlbaee(sigma；na-苯甲酰基-l-精氨酸乙酯盐酸盐在同一缓冲液中的0.86mg/ml溶液)和100μl1mmhcl。在添加100μl的胰蛋白酶溶液后测定胰蛋白酶活性，并在253nm下监测反应。用含有100μl1mmhcl的空白溶液代替胰蛋白酶溶液校准分光光度计。反应进行20分钟，其中每分钟有3个数据点(图1)。[0111]253nm处的吸光度增加(线的斜率增加)表明baee被胰蛋白酶切割。当在底物baee添加之前将胰蛋白酶与蛋白质样品一起孵育时，在253nm处的吸光度会随时间推移而降低，这表明胰蛋白酶活性受到抑制。当在添加胰蛋白酶之前将蛋白质样品与pad一起孵育时，在253nm处的吸光度被(部分地)恢复，表明蛋白质样品对胰蛋白酶的抑制减弱。根据经过和没有经过pad处理的样品的斜率，可计算出pad对tia水平的降低。胰蛋白酶抑制(％)通过以下计算：100-(样品-样品背景)/(胰蛋白酶-空白)。[0112]使用偶氮酪蛋白测定进行tia测量[0113]使用以下文献中描述的测定来评定蛋白质材料中的tia水平：“复杂基质中胰蛋白酶抑制活性的定量测定”(“quantitativedeterminationoftrypsininhibitoryactivityincomplexmatrices”)，robine.j.spelbrink等人；theopenfoodsciencejournal,2011,5,42-46。简而言之，将125μl蛋白质样品(或125μl10mm乙酸作为空白)与25μl的0.35mg/ml胰蛋白酶在1mm盐酸中的溶液混合。通过在ph8.5下的100mmtris、5mm氯化钙中添加30mg/ml的偶氮酪蛋白来开始反应。对于背景信号，胰蛋白酶被1mmhcl代替。在37℃下30分钟后，将样品用150μl15％tca猝灭。通过在4℃下以15000*g离心10分钟，去除未水解的蛋白质材料和其他不溶物。取100μl转移到96孔微量滴定板中，并与100μl1.5mnaoh混合。测量在450nm处的吸光度。胰蛋白酶抑制(％)通过以下计算：100-(样品-样品背景)/(胰蛋白酶-空白)。[0114]在表1中，显示了通过baee或偶氮酪蛋白测定对上述蛋白质测量的tia减少：[0115]表1：用pad处理过的蛋白质中的tia减少[0116]蛋白质来源使用pad处理的tia减少，％大豆饮料a33鸡卵类粘蛋白a25油菜籽饼a88油菜籽蛋白分离物(rpi)a71荞麦粉b71荞麦饮品b46花生b78花生酱b76大麦种子b90羽扇豆种子b61[0117](a)—使用baee测定测量的tia；(b)—使用偶氮酪蛋白测定测量的tia[0118]实施例2[0119]使用国际标准方法对大豆饮品和大豆粉中的tia进行定量[0120]由eurofinlabco使用用于测量胰蛋白酶抑制活性的国际标准方法(en-iso14902:2001)来测量用pad进行酶处理之前和之后的大豆粉和大豆饮品的胰蛋白酶抑制活性。[0121]大豆饮品和大豆粉的酶处理：[0122]将从本地商店购买的大豆饮品(provamelunsweetened)：300g在水浴中与0.04upad/g大豆饮品一起在45℃下孵育(磁力搅拌)90分钟。作为对照，将大豆饮品在没有任何添加的情况下进行孵育。随后将样品在-20℃下存储过夜。此后将样品冻干。[0123]大豆粉：在0.01mnaoh溶液中制备原料大豆粉的10％悬浮液(w/w)。将ph调节至ph10。随后将悬浮液在环境温度下混合3小时(磁力搅拌)。此后，将悬浮液分成两等份(200g)，并移至45℃的水浴中。在15分钟后，向一份中添加0.05upad/g大豆粉悬浮液，并孵育30分钟。随后将样品在-20℃下存储过夜。此后将样品冻干。[0124]tia测量的结果显示在下表2中。[0125]表2：在pad酶孵育之前和之后，对大豆饮品和大豆粉中tia水平的定量。[0126][0127]实施例3[0128]使用体外模型的提高油菜籽蛋白的可消化性[0129]用pad处理油菜籽蛋白样品：如在专利wo2018/007492中所述制备油菜籽蛋白分离物(rpi)。向500ml水中的10％rpi中添加43upad。将该悬浮液在40-45℃下孵育3小时。随后将样品冷冻并冻干。[0130]在nizo食品研究中心(nizofoodresearchcenter)，使用如在he,tao&giuseppin,marco.(2013).slowandfastdietaryproteinsdifferentiallymodulatepostprandialmetabolism.internationaljournaloffoodsciencesandnutrition.65.10.3109/09637486.2013.866639中所述的symphyd平台测量体外可消化性。[0131]用pad处理过的rpi和rpi的蛋白质消化的体外模型结果在图2中示出。[0132]所释放的氨增加(通过opa方法测量)表明了蛋白质样品的较高可消化性。与未处理的样品相比，在用pad处理过的rpi的消化结束时观察到了可消化性的多于20％的提高。[0133]实施例4[0134]用pad处理过的大豆饮品的改善口感[0135]将大豆饮品与pad一起孵育[0136]大豆饮品provamelunsweetened：将1000ml(4*250ml)与0.27u/mlupad一起在水浴中(以40rpm振荡)在45℃下孵育4小时。作为对照，将大豆饮品在没有任何添加的情况下进行孵育。随后，将样品用微波加热至65℃，并在该温度下保持5分钟以使pad酶失活。此后，将样品在冰水中冷却。然后对这些样品进行感官小组评定。由小组(n＝12)借助于如在meilgaardm.、civillegv.、carrbt.2007.sensoryevaluationtechniques.，第4版，bocaraton,fl.crcpress.中所述的定量描述分析(quantitativedescriptiveanalysis，qda)评估样品的与测试中的产品相关的属性。在测试期间，样品是根据最佳平衡的设计提供的，并一式两份地在eyequestion中以0-100非结构化线标度进行评分。使用方差分析(anova)分析数据，以发现各个样品之间的显著差异。p<0.05的差异被认为是显著的。感官小组评定的结果如图3中所示。对于经酶处理的饮品，观察到了关于属性(例如在口腔中的粉状、饱满度和稠度)的口感显著降低。[0137]实施例5[0138]对用pad酶处理过的油菜籽蛋白的感官评定[0139]将每个样品在自来水中制成1000ml2％蛋白粉悬浮液(校正了蛋白质含量的植物蛋白粉)，并用4mh2so4将ph调节至ph6.5。[0140]在不使用pad酶和使用以不同酶剂量添加的pad酶的情况下，将悬浮液在45℃下孵育2小时。通过将材料在65℃加热保持5分钟的时间，来使酶失活。由感官小组(n＝13)借助于描述性分析(descriptiveanalysis，qda)对样品的与测试产品相关的属性进行评估。在测试期间，样品是根据最佳平衡的设计提供的，并一式两份地在eyequestion中以0-100非结构化线标度进行评分。使用方差分析(anova)分析数据，以发现各个样品之间的显著差异。p<0.05的差异被认为是显著的(图4)。通过用pad酶处理rpi，所测试的所有感官属性(例如甜味、甘草味、涩味、苦味、余味持续时长(如附图图例中所描述的))都随着pad添加量的增加而降低。[0141]实施例6[0142]用pad处理过的豌豆和大豆蛋白饮品中的ief降低[0143]将样品用h2o稀释四倍。随后，将样品用ief样品缓冲液稀释至1:1。将10μl的所述样品施加到novextmph3-7ief蛋白凝胶上。总运行时间为2.5小时(根据invitrogen方案)。图5示出了在pad处理后大豆饮品和豌豆饮品的pi降低。这些蛋白质的pi降低与pad酶对这些蛋白质的活性一致，所述pad酶活性降低了所述蛋白质上的正电荷数量。在用pad处理过的杏仁粉中测量到了杏仁蛋白的等电点的相似降低(数据未显示)。这些蛋白质的pi偏移至更偏酸性的值，使得这些蛋白质在中性饮料配方中具有更好的溶解度。[0144]实施例7[0145]pad酶在酸性ph下的稳定性[0146]在两种温度(在冰上于4℃下和在水浴中于37℃下)在3至7的ph范围内孵育40分钟后，评估pad酶的稳定性。对于ph3至5，将pad样品在100mm柠檬酸缓冲液中稀释6倍，并通过添加1n氢氧化钠提高ph。对于高于5的ph，将酶在50mm磷酸钾缓冲液中稀释。如wo2017/009100a1中所述测量酶活性。图6示出了此实验的结果。在此实验中pad酶在ph7时具有最大活性，然而在ph4时，在37℃下进行酶孵育40分钟时，约50％的活性得以保留，这表明所述酶可以在与哺乳动物的胃中发现的相似的条件下具有活性。当前第1页1 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：：[0002]在人口不断增长的世界中存在着增加的蛋白质需求。为了应对这种不断增长的蛋白质需求，需要着眼于蛋白质的更广泛应用。另外，期望寻找植物蛋白作为动物蛋白的替代物，因为认为植物是比动物更可持续的蛋白质来源。植物蛋白在食品中的使用部分地由于不良的可消化性、味道和营养价值而仍然受到限制。[0003]含有较少精制谷物和粮食豆类(grainlegumes)的饮食中的蛋白质的不良可消化性是由于其中存在在加工期间存在或形成的不太容易消化的蛋白质级分、高水平的不溶性纤维和/或高浓度的抗营养因子。已知饮食中的抗营养因子(antinutritionalfactor,anf)会负面地影响食品的蛋白质可消化性、氨基酸生物利用度和蛋白质品质(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。[0004]大豆和其他粮食豆类中高水平的胰蛋白酶抑制剂的存在已在大鼠和猪中显示导致了蛋白质可消化性的显著降低(高达50％)(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。基于这些抑制剂的抑制位点处的残基，这些抑制剂可以为赖氨酸或精氨酸型抑制剂。大豆是胰蛋白酶抑制剂的主要来源，占脱脂豆粕中蛋白质的约6％。存在两种主要类型的胰蛋白酶抑制剂，在反应位点处具有精氨酸的kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(ksti)和在抑制位点处具有赖氨酸的bowman-birk抑制剂(bbi)。[0005]大豆的湿热处理(100℃持续20分钟)使抑制剂的一部分失活，然而显著量的原始胰蛋白酶活性得以保持。完全破坏抑制活性所需的长时间加热会显著降低大豆产品的蛋白质可消化性和品质(g.sarwargilani等人，britishjournalofnutrition(2012),108,s315-s332)。据报道几种商业大豆饮料含有总抑制活性的高达约70％。此外，发现基于大豆的婴儿配方食品含有28％。生大豆中的胰蛋白酶抑制剂在易感动物中引起生长抑制和胰腺肿大。[0006]制作基于植物的蛋白饮料的另一个重要因素是所述饮料的味道和口感。植物蛋白具有不好的味道，例如苦味和加重的口感，即使在低蛋白质含量的情况下也如此。而且，许多植物蛋白饮料含有非常低量的蛋白质，从而使得它们是不那么营养和不那么美味的食物。[0007]wo2008/000714公开了一种蛋白质精氨酸脱亚氨酶以及该酶在具有增加量的瓜氨酸的食物产品的制备中的用途。[0008]wo2017/009100公开了一种改善植物蛋白(例如豌豆蛋白、大豆蛋白和稻米蛋白)的溶解度的方法，其中将所述植物蛋白与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起孵育。在与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起孵育后，植物蛋白(例如豌豆蛋白)的发泡能力降低。[0009]本领域中存在改善包含(植物)蛋白质的食物的特性的需要。附图说明[0010]图1：吸光度随时间推移的变化(如实施例1中所述的baee连续测定)与所述测定中的胰蛋白酶活性直接相关。样品“减pad”表示在抑制蛋白存在下的胰蛋白酶活性，而“加pad”表示在用pad酶预处理的抑制蛋白存在下测量的胰蛋白酶活性。箭头表示通过酶pad的作用胰蛋白酶抑制活性(tia)的降低程度。[0011]图2：未经酶处理(空心圆圈)和用pad酶处理过(黑色圆圈)的symphyd消化模型中随时间推移从rpi释放的nh2。箭头分别表示在5分钟时胃蛋白酶的添加点和在80分钟时胰酶的添加点。[0012]图3：如实施例4中所述对使用和不使用pad酶处理的豆浆进行的感官小组评定。黑色条形柱代表大豆饮品的感官方面，并且填充有图案的条形柱代表用pad酶处理过的大豆饮品的感官方面。属性“粉状-白垩质口感”代表粉状/白垩质(chalk)口感，“饱满度口感”表示饱满度口感，并且“粘稠口感”代表口中的稠度。[0013]图4：使用或不使用pad处理的2％油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性。■：未用pad处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；◆：用2upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；▲：用20upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性；●：用60upad/l处理的油菜籽蛋白分离物溶液的感官属性。感官属性是涩味口感(i)、风味强度(ii)、甜味(iii)、苦味(iv)、甘草味(v)、苦余味(vi)，余味持续时长(vii)和涩余味(viii)。[0014]图5：与pad酶一起孵育的各种植物饮品的等电聚焦(ief)凝胶：泳道1—豌豆饮品(bolthousefarmunsweetened)；泳道2—与pad一起孵育的豌豆饮品(bolthousefarmunsweetened)；泳道3—大豆饮品(provamelunsweetened)；泳道4—与pad一起孵育的大豆饮品(provamelunsweetened)；泳道5—豌豆饮品(rippleunsweetened)；泳道6—与pad一起孵育的豌豆饮品(rippleunsweetened)；以及泳道7—pi标记。[0015]图6：pad酶在不同ph和温度下的相对稳定性。在进行活性测量之前，将ph7和4℃孵育时的酶活性设定为100％。三角形—37℃时的酶稳定性；圆圈表示如实施例7中所述在4℃时的酶稳定性。[0016]序列表[0017]seqidno:1为来自禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)的肽酰精氨酸脱亚氨酶技术实现要素：[0018]本发明涉及一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法。[0019]本发明还涉及肽酰精氨酸脱亚氨酶(peptidylargininedeiminase,pad)用于改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。[0020]本发明还涉及一种包含肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)的营养补充剂。具体实施方式[0021]植物蛋白的不良可消化性部分是由于高水平的抗营养因子(anf)，例如胰蛋白酶抑制剂。由植物蛋白制备的饮品的口感通常被描述为不可接受的。在本发明之前，尚无可接受的解决方案可用于克服植物蛋白饮品的这些缺陷。通常，这同样适用于含蛋白质的食物。[0022]pad将蛋白质中的精氨酸残基脱亚氨成为瓜氨酸。对于其中精氨酸占据反应位点的胰蛋白酶抑制剂，pad作用会使该抑制剂对胰蛋白酶失去活性。糜蛋白酶(chymotrypsin)的蛋白酶抑制剂和α-淀粉酶抑制剂也以与胰蛋白酶抑制剂相似的方式有助于降低食物的可消化性。这些抑制剂中的几种已显示具有对抑制功能重要的关键精氨酸残基(gideonm.polya,atta-ur-rahman编辑，studiesinnaturalproductschemistry，第29卷，第567-641页)。[0023]所有蛋白酶抑制剂中的约10％在反应性p1位点处含有精氨酸(r)残基(在merops数据库中对于蛋白酶抑制剂找到的3300个序列中的309个序列)。在p1位点处具有“r”的胰蛋白酶抑制剂可在所有种类的植物蛋白(例如豆类、谷物、坚果和种子，如大豆、油菜籽、坚果、小麦、玉米、大麦、马铃薯、稻、燕麦、西红柿等)中找到，然而并非所有抑制活性均被发现为在不同物种内相等地分布。例如，马铃薯中约40％的蛋白质是蛋白酶抑制剂，其中存在许多不同类别的蛋白酶抑制剂(已鉴定出多于10种蛋白酶抑制剂)并且这些抑制剂的分布取决于马铃薯品种(pouvreaul.等人，j.agric.foodchem.,2001，第49卷，第2864-2874页)。[0024]先前已显示可以使用哺乳动物pad酶使kunits大豆胰蛋白酶抑制剂失活(h.takahara等人，1985,thejournalofbiologicalchemistry，第260卷，第14期，第8378-8383页)。然而，从未有人公开复杂蛋白质基质(例如大豆粉)中tia(胰蛋白酶抑制剂活性)的失活。为了使食物产品受益，在复杂食物基质中的pad活性是至关重要的。此外，哺乳动物pad对含精氨酸的蛋白质材料具有狭窄的选择性—并非所有含精氨酸残基的蛋白质都可以使用哺乳动物pad2酶进行修饰。有研究表明，在一个胰蛋白酶抑制反应位点处含有精氨酸残基的鸡蛋清卵类粘蛋白无法被哺乳动物pad酶修饰。相比之下，我们在这里表明微生物pad可降低鸡蛋清卵类粘蛋白中的胰蛋白酶抑制活性，从而使该酶适合用于含有蛋白酶抑制活性的多种蛋白质食物中。同样，先前的研究已表明，花生中的胰蛋白酶-糜蛋白酶抑制剂biii可以用哺乳动物pad酶进行修饰，然而，并非所有参与蛋白酶抑制活性的精氨酸残基都可以被修饰(tomofumikurokawa等人，j.biochem,1987，第101卷，第1361-1367页)。然而，这项研究着眼于酶对来自花生的纯化的花生biii蛋白酶抑制剂的效应。在本发明中，结果表明微生物pad可降低整个花生中的胰蛋白酶抑制活性，不仅仅包括biii胰蛋白酶抑制活性。在更复杂的食物(例如经加工的花生酱)中也可以看出本发明中的微生物酶pad的效应。[0025]令人惊讶地，本发明的发明人证明，使用pad可改善包含蛋白质的食物的感官和/或口感和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的不同方面。[0026]在本发明的各方面中的一个方面中，本发明涉及一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0027]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0028]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0029]优选地，本发明的方法改变了上述特性中的至少一种特性，即本发明的方法提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的甜味的方法。或者，本发明提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的甘草味的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的涩味的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的粉状/白垩质的方法。或者，本发明提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的饱满度的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的稠度的方法。本发明还提供了一种改变(优选地增加)包含蛋白质的食物的可消化性的方法。本发明还提供了一种改变(优选地降低)包含蛋白质的食物的蛋白酶抑制活性的方法。在另一个优选的实施方式中，本发明的方法改变了上述特性中的至少2种、3种或4种特性，例如用于改变包含蛋白质的食物的粉状/白垩质、饱满度和稠度的方法。[0030]如本文所用，术语“甜味”是指当吃富含糖的食物时最常被感知的基本味道。[0031]如本文所用的术语“甘草味”是指存在于光果甘草(glycyrrhizaglabra)或甜叶菊植物物种的甜根中的味觉/组分。[0032]如本文所用的术语“涩味”是指类似于由例如在许多水果中发现的单宁或由蛋白质尤其是在酸性环境中引起的干燥、敛口(puckering)的口感。[0033]如本文所用的术语“粉状/白垩质”是指产品在口腔中感觉呈粉状或粒状的程度。[0034]如本文所用的术语“饱满度”是指口腔中饱满圆润的感觉。[0035]如本文所用的术语“稠度”是指口腔中的坚实度，并且表示将产品推入舌头和上颚之间所需的力。[0036]如本文所用，术语“可消化性”是指被消化的能力，并且涉及相对于被消耗的食物量由身体所保留的食物量。蛋白质的可消化性直接涉及消化性蛋白酶(例如胃蛋白酶和胰肽酶)在生理相关条件下与所述蛋白质一起孵育时获得的水解程度。[0037]如本文所用的术语“蛋白酶抑制活性”是指抑制蛋白酶(有助于蛋白质分解的酶)的功能的活性(优选地蛋白质)。[0038]术语“改变”是指根据所针对的目标而增加或降低。例如，本发明提供了一种增加包含蛋白质的食物的可消化性的方法，所述方法包括：[0039]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0040]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0041]本发明还提供了一种降低包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度和/或稠度的方法，所述方法包括：[0042]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0043]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0044]本发明还提供了一种降低包含蛋白质的食物的蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括[0045]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0046]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物。[0047]通过与区别仅在于蛋白质溶液未与pad一起孵育而其他方面完全相同的制备的食物进行比较，来确定上述特性中的任何特性是增加还是降低。[0048]术语“包含蛋白质的食物”是指这样的食物，所述食物包含蛋白质作为其组分中的一种组分或作为所添加的成分，即含蛋白质的食物。包含蛋白质的食物优选地包含至少0.1％的蛋白质。任何合适的蛋白质均可用于本发明的方法中。有利地，蛋白质包含蛋白质结合的精氨酸，例如至少1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％或至少6mol％。[0049]蛋白质溶液(或者：食物蛋白质成分)是包含蛋白质的液体蛋白质组合物。如果包含蛋白质的食物的可消化性被改变(优选地增加)，则蛋白质溶液包含蛋白酶抑制剂活性。在蛋白酶抑制活性被改变(优选地降低)的情况下，蛋白质溶液包含蛋白酶抑制剂活性。如本文所用，术语“蛋白酶抑制剂活性”是指添加到蛋白酶中而降低蛋白酶活性的肽。术语“蛋白质溶液”还包括并非所有组分都溶解的溶液，即术语“蛋白质溶液”还包括蛋白质悬浮液。[0050]“将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育”的步骤可以在任何合适的ph下以任何合适的时间和任何合适的酶浓度执行。技术人员将能够确定合适的酶量或合适的孵育温度或合适的孵育ph或合适的孵育时间，例如将蛋白质与肽酰精氨酸脱亚氨酶一起在介于4与9之间的ph，例如介于5与8.5之间的ph，例如介于5.5与8之间的ph，例如介于6与7之间的ph，或介于6.2与6.8之间的ph，例如约6.5的ph下孵育。蛋白质与pad一起孵育的合适温度可介于20摄氏度与60摄氏度之间，例如介于30摄氏度与50摄氏度之间，或介于35摄氏度与45摄氏度之间。[0051]经pad处理的蛋白质溶液可例如为最终产品，例如但不限于蛋白质饮品。或者，经pad处理的蛋白质溶液是食物成分，所述食物成分随后可以被进一步加工成包含蛋白质的食物。[0052]如上所述，在本发明的方法中可以使用任何合适的蛋白质。在一个优选的方面中，本发明方法中的蛋白质是植物蛋白(plant/vegetableprotein)(所述术语在本文中可互换使用)。优选地，用于本发明的方法中的蛋白质溶液是包含植物蛋白(例如大豆蛋白、油菜籽蛋白、小麦蛋白、荞麦蛋白、玉米蛋白、大麦蛋白、马铃薯蛋白、稻米蛋白、燕麦蛋白、豌豆蛋白、(花生)坚果蛋白、羽扇豆蛋白、杏仁蛋白)的溶液，或者所述蛋白质是卵蛋白、乳蛋白、明胶蛋白或微生物蛋白。[0053]本发明的方法包括将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育的至少一个步骤。如上所述并且根据蛋白质溶液是食物成分还是最终的包含蛋白质的食物，本发明的方法任选地包括将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物的步骤。根据起始材料，在本发明的方法中可包括另外任选的物质。如果起始材料是粉状物质(flour)(例如但不限于植物蛋白粉)，则本发明的方法将包括溶解所述粉状物质以获得蛋白质溶液的步骤。粉状物质的溶解通常涉及向所述粉状物质中添加液体(例如水或缓冲液)，以及使粉状物质至少部分地溶解在所述液体中。取决于粉状物质的特性，可能需要将所述粉状物质与液体混合达一定量的时间，任选地使用一些热量以改善/加速溶解。或者，在水或合适的缓冲液中制备悬浮液。即，本发明方法的任选附加步骤是：包括溶解粉状物质以获得蛋白质溶液或由粉状物质制备悬浮液。[0054]术语蛋白质精氨酸脱亚氨酶和肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)在本文中可互换使用。蛋白质精氨酸脱亚氨酶或肽酰精氨酸脱亚氨酶属于将结合肽或蛋白质的精氨酸转化为结合肽或蛋白的瓜氨酸的酶(ec3.5.3.15)的家族。该过程被称为脱氨基或瓜氨酸化。在从精氨酸到瓜氨酸的反应中，精氨酸侧链的末端氮原子中的一个末端氮原子被氧取代。该反应使用一个水分子，并且产生氨作为副产物(http://en.wikipedia.org/wiki/citrullination)。精氨酸在中性ph下带正电，然而瓜氨酸不带电。令人惊讶地，发现其中至少一部分精氨酸已被转化为瓜氨酸并由此产生了带较少电荷的蛋白质显示出改良的甜度、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性。末端截短、糖基化、磷酸化(pohosphorylation)，以及通过切割去除前导序列(例如信号肽、前肽和/或前原肽)。[0062]seqidno:1的成熟多肽序列可包含或含有seqidno:1的氨基酸序列的氨基酸19、20、21、22、23、24至640，有利地，seqidno:1的成熟多肽序列包含或含有seqidno:1的氨基酸22至640，其中在seqidno:1中的位置1处的甲硫氨酸被计数为序数1。[0063]术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并含有多于五个氨基酸残基的分子。如本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且还可以指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。可任选地修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化等)多肽以增加官能性。在某些条件下在特定底物存在下表现出活性的多肽可称为酶。[0064]肽酰精氨酸脱亚氨酶或具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽可以通过本领域中已知的方法在任何合适的宿主生物中产生，例如在真菌曲霉属(aspergilli)(例如黑曲霉(aspergillusniger)或米曲霉(aspergillusoryzae))、木霉属(trichoderma)或酵母酵母属(saccharomyces)和克鲁维酵母属(kluyveromyces)中或在链霉菌属(streptomyces)或杆菌属(bacilli)的细菌中产生。一种在黑曲霉中表达具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽的合适方法例如在wo2008/000714的实施例3和4中公开，所述专利文献以引用方式包括在本文中。[0065]本文所用的术语“包含蛋白质的食物”是指任何类型的食物，只要所述食物至少包含蛋白质即可。术语食物是指固体食物和饮品。[0066]在本发明的各实施方式中的一个实施方式中，本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0067]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0068]任选地，将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是包含蛋白质的饮品，即旨在用于食用的液体。[0069]包含蛋白质的饮品可以是任何类型的饮料，但是在优选的方面中，包含蛋白质的饮品是植物蛋白饮品或发酵植物蛋白产品。合适的植物蛋白饮品的示例是大豆饮品、豌豆饮品、花生饮品、大麦饮品、稻米饮品、燕麦饮品、藜麦饮品、杏仁饮品、腰果饮品、椰子饮品、榛子饮品、大麻饮品、芝麻籽饮品、小麦饮品、马铃薯饮品或葵花籽饮品。合适的发酵植物蛋白产品的示例是发酵大豆产品、发酵豌豆产品、发酵花生产品、发酵大麦产品、发酵稻米产品、发酵燕麦产品、发酵藜麦产品、发酵杏仁产品、发酵腰果产品、发酵椰子产品、发酵榛子产品、发酵大麻产品、发酵芝麻籽饮品、发酵小麦产品、发酵马铃薯产品或发酵葵花籽产品。[0070]大豆蛋白通常用于制备婴儿(infant)饮品、较大婴儿(follow-on)饮品或幼儿(toddler)饮品。通过使用本发明的方法可以改善诸如甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性的特性。因此，本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0071]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0072]任选地，将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是包含蛋白质的饮品，其中所述饮品是婴儿饮品、较大婴儿饮品或幼儿饮品，并且其中所述蛋白质是大豆蛋白。[0073]所生产的包含蛋白质的饮品可以是使用或不使用附加蛋白质生产的饮品。蛋白质强化(植物)蛋白饮品提供了例如提高的营养价值的优点，但是由于例如粉状/白垩质、饱满度、稠度的不期望特性而通常被认为难以食用。用本发明的方法制备的蛋白质强化(植物)蛋白饮品具有改善的(降低的)粉状/白垩质、饱满度、稠度，因此本发明提供了一种改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的方法，所述方法包括：[0074]将蛋白质溶液与肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)一起孵育，以及[0075]任选地将所述经pad处理的蛋白质溶液加工成包含蛋白质的食物，其中所述包含蛋白质的食物是蛋白质强化的(植物)蛋白质饮品。蛋白质强化饮品的一个示例是用于老年人或(手术后)康复者增加其热量摄入的蛋白质强化饮品。或者，此类蛋白质强化饮品是药物或临床饮品或运动饮品。[0076]通过本发明的方法制备的包含蛋白质的饮品可具有中性或酸性ph。[0077]本发明还提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甜味、甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甘草味、涩味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的甘草味、粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。优选地，本发明提供了肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)用于改变包含蛋白质的食物的粉状/白垩质、饱满度、稠度和/或可消化性和/或蛋白酶抑制活性的用途。本发明的方法的上述特征同样适用于用途部分。[0078]由本文所述的方法中的任何方法直接获得的产品也在本发明的范围内。[0079]在另一方面，本发明提供了一种营养保健组合物，所述营养保健组合物包含肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)，优选地微生物肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)。更优选地，所述微生物肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)与seqidno:1具有至少80％的同一性，或与seqidno:1的成熟氨基酸序列具有至少80％的同一性。[0080]如本文所用的术语营养保健表示在营养和药物应用领域两者中的有用性。因此，该新颖营养保健组合物可用作食物和饮料的补充剂，以及用作肠内或肠胃外应用的药物制剂或药物，所述药物制剂或药物可为固体制剂(例如胶囊或片剂)或液体制剂(例如溶液或悬浮液)。如从前文所述可明显看出的，术语营养保健组合物还包括通过本文所述的方法中的任何方法获得的食物和饮品，以及补充剂组合物，例如膳食补充剂。[0081]如本文所用的术语膳食补充剂是指通过口腔摄取的产品，所述产品含有旨在补充膳食的“膳食成分”。这些产品中的“膳食成分”可包括：维生素、矿物质、中草药或其他植物药、氨基酸，以及诸如酶、器官组织、小腺和代谢产物之类的物质。膳食补充剂也可以是提取物或浓缩物，并且可以多种形式存在，例如片剂、胶囊剂、软胶囊、囊形片、液体或粉末散剂。它们也可为其他形式，例如条形，但是如果它们是其他形式，则膳食补充剂的标签上的信息通常将不会将所述产品表示为常规食物或餐食或膳食的唯一项。[0082]本发明将在下面的实施例中更详细地解释，所述实施例不限制本发明。[0083]实验部分[0084]材料[0085]肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达[0086]如在wo2008/000714的实施例3和4中所公开的那样进行seqidno:1的具有肽酰精氨酸脱亚氨酶活性的多肽的克隆和表达。[0087]肽酰精氨酸脱亚氨酶(pad)活性[0088]通过测量α-n-苯甲酰基-l-精氨酸-乙酯(baee)中瓜氨酸残基的形成来确定肽酰精氨酸脱亚氨酶活性。孵育混合物含有100mm的tris-hcl缓冲液(ph7.5)、5mm的cacl2、10mm的dtt、10mm的baee，最终体积为700μl。在55℃下执行孵育30分钟，并通过添加100μl8nhclo4终止反应。按照andknappe,(1968)anal.biochem.26,188的方法通过比色法来测定瓜氨酸。[0089]一单位的肽酰精氨酸脱亚氨酶表示1μmol形成的瓜氨酸/min/mg蛋白质。[0090]实施例1[0091]用pad酶处理过的蛋白质中胰蛋白酶抑制活性(tia)的降低[0092]将各种含有tia的蛋白质与pad一起孵育，并通过两种不同的测定来测量tia的降低。进行和不进行pad孵育的蛋白质的制备以及用于测量tia的测定如下所述。[0093]豆浆样品制备：用600μl自来水稀释来自本地商店的400μl商业大豆饮品(provamelunsweetened)。随后添加0.17u/mlpad，并将溶液在40℃(混匀仪，600rpm)下孵育2.5小时。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0094]大豆粉样品制备：将1克大豆与49g0.01nnaoh混合。用4nhcl将该悬浮液的ph调适至10。将悬浮液在环境温度下用磁力搅拌充分混合3小时。随后将样品以3200*g离心10分钟。将上清液(不包括含脂质的上部部分)再次以20817g离心10分钟。向150μl的所得上清液中添加0.04upad，并将溶液在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育30分钟。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0095]鸡蛋清卵类粘蛋白样品制备：将卵类粘蛋白(sigma)在100mmhepes、5mmcacl2、5mmdtt，ph7.2中溶解(0.25mg/ml)。向其中添加0.17u/mlpad并在37℃下孵育。用25μl0.2medta终止反应。[0096]油菜籽饼样品制备：[0097]向100mg油菜籽饼(从冷榨油菜籽油籽粕获得)中添加900μl的2％nacl和0.17单位的pad。将油菜籽在55℃下在混匀仪中以800rpm溶解30分钟。此后，将样品以20817g离心10分钟。将对照油菜籽饼样品在没有pad的情况下溶解。[0098]油菜籽蛋白分离物(rpi)样品制备：[0099]如专利wo2018/007492中所述从冷榨油菜籽油籽粕开始制备rpi。从该样品制备rpi的2％(w/v)溶液。随后添加0.17u/mlpad，并将溶液在40℃(混匀仪，600rpm)下孵育2.5小时。将对照样品与代替pad的相同体积的水一起孵育。[0100]花生和花生酱样品制备：从本地商店购买花生(带壳)。除去壳，并将一份花生与四份水(w/w)混合。在本地商店购买花生酱(terrasana牌)，并与3份水(w/w)混合。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad或水(对照)，并在40℃下孵育2小时。随后将1份用2份10mm乙酸稀释。如下所述分析125μl(tia测量)。[0101]大麦样品制备[0102]将一克大麦在10ml水中混合(磁力搅拌)。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育90分钟。作为对照，添加水代替pad。[0103]荞麦粉和荞麦饮品样品制备：[0104]在混合下在水中制备从本地商店购买的荞麦粉的10％溶液。原样使用从本地商店购买的生物荞麦饮品(品牌名称isola)。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育100分钟。为了进行对照孵育，添加水代替pad。如下所述使用azocasein测定来测量胰蛋白酶抑制活性。[0105]羽扇豆样品制备[0106]从本地生产商获得羽扇豆种子，并将其进一步加工成粉在水中的10％悬浮液。向500μl的该悬浮液中添加0.4upad，并在45℃(混匀仪，600rpm)下孵育100分钟。为了进行对照孵育，添加水代替pad。如下所述使用azocasein测定来测量胰蛋白酶抑制活性。[0107]tia测量[0108]使用baee测定进行tia测量[0109]在此使用的测定基本上如在sigma方案“用于胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法”(“assaymethodfortrypsininhibitoractivity”，https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-trypsin-inhibitor.html)中所述。将25μl1mg/ml胰蛋白酶在1mmhcl中的溶液(sigma；胰蛋白酶来自牛胰腺；15267单位/mg固体)添加到1.875ml1mmhcl中。随后将100μl如上所述制备的蛋白质样品(使用或不使用酶孵育)添加到反应混合物中。作为对照，在胰蛋白酶活性测量中添加100μl1mmhcl代替抑制剂。将这些溶液在环境温度下孵育5分钟。[0110]向2.7ml67mm磷酸钠ph7.6(25℃)中添加300μlbaee(sigma；na-苯甲酰基-l-精氨酸乙酯盐酸盐在同一缓冲液中的0.86mg/ml溶液)和100μl1mmhcl。在添加100μl的胰蛋白酶溶液后测定胰蛋白酶活性，并在253nm下监测反应。用含有100μl1mmhcl的空白溶液代替胰蛋白酶溶液校准分光光度计。反应进行20分钟，其中每分钟有3个数据点(图1)。[0111]253nm处的吸光度增加(线的斜率增加)表明baee被胰蛋白酶切割。当在底物baee添加之前将胰蛋白酶与蛋白质样品一起孵育时，在253nm处的吸光度会随时间推移而降低，这表明胰蛋白酶活性受到抑制。当在添加胰蛋白酶之前将蛋白质样品与pad一起孵育时，在253nm处的吸光度被(部分地)恢复，表明蛋白质样品对胰蛋白酶的抑制减弱。根据经过和没有经过pad处理的样品的斜率，可计算出pad对tia水平的降低。胰蛋白酶抑制(％)通过以下计算：100-(样品-样品背景)/(胰蛋白酶-空白)。[0112]使用偶氮酪蛋白测定进行tia测量[0113]使用以下文献中描述的测定来评定蛋白质材料中的tia水平：“复杂基质中胰蛋白酶抑制活性的定量测定”(“quantitativedeterminationoftrypsininhibitoryactivityincomplexmatrices”)，robine.j.spelbrink等人；theopenfoodsciencejournal,2011,5,42-46。简而言之，将125μl蛋白质样品(或125μl10mm乙酸作为空白)与25μl的0.35mg/ml胰蛋白酶在1mm盐酸中的溶液混合。通过在ph8.5下的100mmtris、5mm氯化钙中添加30mg/ml的偶氮酪蛋白来开始反应。对于背景信号，胰蛋白酶被1mmhcl代替。在37℃下30分钟后，将样品用150μl15％tca猝灭。通过在4℃下以15000*g离心10分钟，去除未水解的蛋白质材料和其他不溶物。取100μl转移到96孔微量滴定板中，并与100μl1.5mnaoh混合。测量在450nm处的吸光度。胰蛋白酶抑制(％)通过以下计算：100-(样品-样品背景)/(胰蛋白酶-空白)。[0114]在表1中，显示了通过baee或偶氮酪蛋白测定对上述蛋白质测量的tia减少：[0115]表1：用pad处理过的蛋白质中的tia减少[0116]蛋白质来源使用pad处理的tia减少，％大豆饮料a33鸡卵类粘蛋白a25油菜籽饼a88油菜籽蛋白分离物(rpi)a71荞麦粉b71荞麦饮品b46花生b78花生酱b76大麦种子b90羽扇豆种子b61[0117](a)—使用baee测定测量的tia；(b)—使用偶氮酪蛋白测定测量的tia[0118]实施例2[0119]使用国际标准方法对大豆饮品和大豆粉中的tia进行定量[0120]由eurofinlabco使用用于测量胰蛋白酶抑制活性的国际标准方法(en-iso14902:2001)来测量用pad进行酶处理之前和之后的大豆粉和大豆饮品的胰蛋白酶抑制活性。[0121]大豆饮品和大豆粉的酶处理：[0122]将从本地商店购买的大豆饮品(provamelunsweetened)：300g在水浴中与0.04upad/g大豆饮品一起在45℃下孵育(磁力搅拌)90分钟。作为对照，将大豆饮品在没有任何添加的情况下进行孵育。随后将样品在-20℃下存储过夜。此后将样品冻干。[0123]大豆粉：在0.01mnaoh溶液中制备原料大豆粉的10％悬浮液(w/w)。将ph调节至ph10。随后将悬浮液在环境温度下混合3小时(磁力搅拌)。此后，将悬浮液分成两等份(200g)，并移至45℃的水浴中。在15分钟后，向一份中添加0.05upad/g大豆粉悬浮液，并孵育30分钟。随后将样品在-20℃下存储过夜。此后将样品冻干。[0124]tia测量的结果显示在下表2中。[0125]表2：在pad酶孵育之前和之后，对大豆饮品和大豆粉中tia水平的定量。[0126][0127]实施例3[0128]使用体外模型的提高油菜籽蛋白的可消化性[0129]用pad处理油菜籽蛋白样品：如在专利wo2018/007492中所述制备油菜籽蛋白分离物(rpi)。向500ml水中的10％rpi中添加43upad。将该悬浮液在40-45℃下孵育3小时。随后将样品冷冻并冻干。[0130]在nizo食品研究中心(nizofoodresearchcenter)，使用如在he,tao&giuseppin,marco.(2013).slowandfastdietaryproteinsdifferentiallymodulatepostprandialmetabolism.internationaljournaloffoodsciencesandnutrition.65.10.3109/09637486.2013.866639中所述的symphyd平台测量体外可消化性。[0131]用pad处理过的rpi和rpi的蛋白质消化的体外模型结果在图2中示出。[0132]所释放的氨增加(通过opa方法测量)表明了蛋白质样品的较高可消化性。与未处理的样品相比，在用pad处理过的rpi的消化结束时观察到了可消化性的多于20％的提高。[0133]实施例4[0134]用pad处理过的大豆饮品的改善口感[0135]将大豆饮品与pad一起孵育[0136]大豆饮品provamelunsweetened：将1000ml(4*250ml)与0.27u/mlupad一起在水浴中(以40rpm振荡)在45℃下孵育4小时。作为对照，将大豆饮品在没有任何添加的情况下进行孵育。随后，将样品用微波加热至65℃，并在该温度下保持5分钟以使pad酶失活。此后，将样品在冰水中冷却。然后对这些样品进行感官小组评定。由小组(n＝12)借助于如在meilgaardm.、civillegv.、carrbt.2007.sensoryevaluationtechniques.，第4版，bocaraton,fl.crcpress.中所述的定量描述分析(quantitativedescriptiveanalysis，qda)评估样品的与测试中的产品相关的属性。在测试期间，样品是根据最佳平衡的设计提供的，并一式两份地在eyequestion中以0-100非结构化线标度进行评分。使用方差分析(anova)分析数据，以发现各个样品之间的显著差异。p<0.05的差异被认为是显著的。感官小组评定的结果如图3中所示。对于经酶处理的饮品，观察到了关于属性(例如在口腔中的粉状、饱满度和稠度)的口感显著降低。[0137]实施例5[0138]对用pad酶处理过的油菜籽蛋白的感官评定[0139]将每个样品在自来水中制成1000ml2％蛋白粉悬浮液(校正了蛋白质含量的植物蛋白粉)，并用4mh2so4将ph调节至ph6.5。[0140]在不使用pad酶和使用以不同酶剂量添加的pad酶的情况下，将悬浮液在45℃下孵育2小时。通过将材料在65℃加热保持5分钟的时间，来使酶失活。由感官小组(n＝13)借助于描述性分析(descriptiveanalysis，qda)对样品的与测试产品相关的属性进行评估。在测试期间，样品是根据最佳平衡的设计提供的，并一式两份地在eyequestion中以0-100非结构化线标度进行评分。使用方差分析(anova)分析数据，以发现各个样品之间的显著差异。p<0.05的差异被认为是显著的(图4)。通过用pad酶处理rpi，所测试的所有感官属性(例如甜味、甘草味、涩味、苦味、余味持续时长(如附图图例中所描述的))都随着pad添加量的增加而降低。[0141]实施例6[0142]用pad处理过的豌豆和大豆蛋白饮品中的ief降低[0143]将样品用h2o稀释四倍。随后，将样品用ief样品缓冲液稀释至1:1。将10μl的所述样品施加到novextmph3-7ief蛋白凝胶上。总运行时间为2.5小时(根据invitrogen方案)。图5示出了在pad处理后大豆饮品和豌豆饮品的pi降低。这些蛋白质的pi降低与pad酶对这些蛋白质的活性一致，所述pad酶活性降低了所述蛋白质上的正电荷数量。在用pad处理过的杏仁粉中测量到了杏仁蛋白的等电点的相似降低(数据未显示)。这些蛋白质的pi偏移至更偏酸性的值，使得这些蛋白质在中性饮料配方中具有更好的溶解度。[0144]实施例7[0145]pad酶在酸性ph下的稳定性[0146]在两种温度(在冰上于4℃下和在水浴中于37℃下)在3至7的ph范围内孵育40分钟后，评估pad酶的稳定性。对于ph3至5，将pad样品在100mm柠檬酸缓冲液中稀释6倍，并通过添加1n氢氧化钠提高ph。对于高于5的ph，将酶在50mm磷酸钾缓冲液中稀释。如wo2017/009100a1中所述测量酶活性。图6示出了此实验的结果。在此实验中pad酶在ph7时具有最大活性，然而在ph4时，在37℃下进行酶孵育40分钟时，约50％的活性得以保留，这表明所述酶可以在与哺乳动物的胃中发现的相似的条件下具有活性。当前第1页1 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