玉米ZmD11基因及其在调控植物品质中的应用的制作方法

玉米zmd11基因及其在调控植物品质中的应用
[0001]
技术领域
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本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种玉米zmd11基因及其在调控植物品质中的应用。
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背景技术：

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玉米是粮、饲、能源、工业原料兼用的高产作物，是我国第二大粮食作物。随着国民经济的增长和人民生活水平的提高，人们在追求高产稳产的同时，对品质也提出了更高的标准。籽粒垩白度、淀粉及蛋白质含量是影响籽粒品质的关键因素（li et al., 2013， kong et al., 2018）。传统育种表型选择效率低，工作量大，存在较大的局限性。基因工程技术的发展为加速选育产量高、品质优的玉米提供了新思路。然而，目前应用于玉米品质遗传改良的基因很少。
[0005]
油菜素内酯（brassinosteroids, brs）是一种新型的植物内源激素，在促进作物生长和提高作物产量上发挥着重要作用。osd11是水稻中br生物合成途径的关键基因，影响水稻株高、穗型和籽粒大小等多个农艺性状，利用分子手段操控该基因的表达，能够在不影响其它优良农艺性状的条件下提高籽粒大小和单株产量（tanabe et al., 2005; wu et al., 2016）。目前，尚未发现玉米zmd11基因的功能研究和应用的相关报道。因此，克隆玉米中的zmd11基因，解析其生物学功能，挖掘其在提高玉米产量和品质上的应用潜力，为分子设计育种提供有效的基因资源和理论基础。
[0006]


技术实现要素：

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针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种玉米zmd11基因，并将目的基因转入玉米和水稻中，显著提高籽粒中总淀粉和蛋白含量，同时降低直链淀粉含量，最终提高籽粒品质。
[0008]
为实现以上目的，本发明提供的玉米zmd11基因，采用如下技术方案：一种玉米zmd11基因，其cds序列如seq id no.1所示，具体如下：atgatgatgatgatggcgggggagcacgtgctggccgctctggccaccctgcttctggcctcgctcctgaccctggtgctgaaccacttcctgcccttgcttctgaaccccaaggcccccaggggaagcttcgggtggccgctcctcggcgagacgctcaggttcctcacgccgcacgcctccaacacgctgggcggcttcctcgaggatcactgctccaggtatgggcgggtgttcaagtcccacctgttctgcaccccgacggtggtgtcctgcgaccaggacctcaaccacttcatcctgcagaacgaggagcggctgttccagtgcagctacccgaggccgatccatggcatcctgggcaagtcctccatgctcgtcgtcctgggcgaggaccacaagcgcctcaggaacctcgccctcgccctcgtcacctccaccaagctcaagcccagctacctaggcgacatcgagaagatcgcgctgcacgtcgtcggcgcatggcgacggcacggcggcgtcagggtcgtcgcattctgcgaggaggcaagaaagttcgcattcagtgtgatagtgaagcaggtgctggggctgtcgccagaggagccggtcactgcaaggatactcgaggact
tcctggccttcatgaagggcctcatctccttccccctctacatcccagggaccccatatgccaaggctgtccgggcgagagagaggatatccagcactgtgaagggcatcatcaaggagcggaggagcgctgggtcatggaacaagcagggcgacttccttgacgtgctgctgtcaagcaacgagctatctgacgaggagaaagtgagctttgtgctggactccctgctgggagggtatgagaccacctcgctcctcatctccatggtcgtttatttccttggccagtctgctcaagatctggacctggttaagagggagcacgacagcataagatccaacaaaggcaaggaggagtgcttgacttcagaagactacaagaagatggaatatacccaacaagtcatcaacgaggcgctgagatgcggcaacatcgtcaagttcgtccaccggaaggcgctgaaagacgtcaaatacaaagagtatctgattccatctggctggaaggtcctaccggtcttcactgccgttcatctgaacccctcacttcatggagacgcgcagcagtttcagccctgtaggtgggagggcacaagccaagggacaagcaagaggtttacaccgttcggtggtggcccccggctctgcccaggatcagagctcgctaaagtggagactgctttcttcctccatcaccttgtcctcaattatagatggagaattgatggcgatgacattccaatggcatacccgtatgtggagtttcagagaggtctgccaatagaaatcgagccaacgtcccctgaatcttga所述玉米zmd11基因，其蛋白序列如seq id no.2所示，具体如下：mmmmmagehvlaalatlllaslltlvlnhflplllnpkaprgsfgwpllgetlrfltphasntlggfledhcsrygrvfkshlfctptvvscdqdlnhfilqneerlfqcsyprpihgilgkssmlvvlgedhkrlrnlalalvtstklkpsylgdiekialhvvgawrrhggvrvvafceearkfafsvivkqvlglspeepvtariledflafmkglisfplyipgtpyakavrarerisstvkgiikerrsagswnkqgdfldvllssnelsdeekvsfvldsllggyettsllismvvyflgqsaqdldlvkrehdsirsnkgkeecltsedykkmeytqqvinealrcgnivkfvhrkalkdvkykeylipsgwkvlpvftavhlnpslhgdaqqfqpcrwegtsqgtskrftpfgggprlcpgselakvetafflhhlvlnyrwridgddipmaypyvefqrglpieieptspes本发明还提供了上述方案所述的玉米zmd11基因在调控植物品质中的应用。
[0009]
本发明首次提供了一种玉米zmd11基因，是一个新的调控籽粒品质的基因，能够参与调控籽粒中的垩白、淀粉及蛋白质的形成，显著提高籽粒中总淀粉和蛋白含量，同时降低直链淀粉含量，最终极大地提升籽粒品质；本发明玉米zmd11基因应用于调控植物品质，可以为玉米品质遗传改良提供基因资源和策略。
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附图说明
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图1为本发明实施例2中t
2
代转基因株系中zmd11基因的表达水平分析。图1a为利用荧光定量pcr检测转基因水稻中zmd11基因的相对表达量，其中转基因受体材料为水稻籼稻品种特青（简称tq），tq-oer#1、#2、#3为三个独立的转基因株系。图1b为利用荧光定量pcr检测转基因玉米中zmd11基因的相对表达量，其中转基因受体材料为玉米自交品种b104，b104-oer#1、#2、#3为三个独立的转基因株系。
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图2为本发明实施例3中t
2
代转基因水稻籽粒表型比较；图3为本发明实施例3中t
2
代转基因水稻籽粒品质鉴定结果，其中，a为水稻籽粒的垩白率，b为水稻籽粒的总淀粉含量，c为水稻籽粒的直链淀粉含量，d为水稻籽粒的总蛋白质含量，误差线为标准误差，显著性分析依照t检验（*p < 0.05，**p < 0.01）；图4为本发明实施例4中t
2
代转基因玉米籽粒表型比较；图5为本发明实施例4中t
2
代转基因玉米籽粒品质鉴定结果，其中，a为玉米籽粒的总淀粉含量，b为玉米籽粒的直链淀粉含量，c为玉米籽粒的总蛋白质含量，误差线为标准误差，
显著性分析依照t检验（*p < 0.05，**p < 0.01）。
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具体实施方式
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下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0015]
下列实例中所采用的实验方法若无具体说明，均为常规方法。
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实施例1玉米zmd11基因克隆、载体构建和遗传转化本发明所述的玉米zmd11基因是以水稻osd11的蛋白序列为参考，通过生物信息学分析，结合pcr扩增测序验证，从玉米测序品种b73中克隆zmd11基因。以玉米b73的cdna为模板进行扩增，回收目的片段分别与载体进行同源重组连接反应，通过菌落pcr和测序验证最终获得阳性克隆载体，pubi::zmd11（转化水稻）和p35s::zmd11（转化玉米）。利用农杆菌介导法，分别转化水稻受体材料特青（简称tq）和玉米受体材料b104，筛选阳性转基因株系并对其t
2
代转基因株系进行品质性状鉴定。
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实施例2t
2
代转基因植株中zmd11基因的表达水平分析筛选t
2
代阳性转基因植株，利用takara total rna试剂盒分别提取rna，以oligo (dt) 为引物反转录合成cdna。利用荧光定量pcr检测转基因水稻和玉米中zmd11基因的相对表达量，每个株系做3个重复，取平均值。结果显示，相对于受体材料，转基因阳性株系中zmd11基因的表达量均显著升高（图1）。其中，本发明中所述转基因植株的rna是指将水稻/玉米植株叶片分离提取后获得。
[0018]
实施例3对t
2
代转基因水稻进行品质鉴定，包括对植株籽粒垩白率、总淀粉含量、直链淀粉含量及总蛋白质含量进行测定。
[0019]
水稻籽粒垩白率分析：准备充分完成后熟作用的种子（种子收获后储存三个月以上）200粒以上置于灯板（上方为玻璃板，下方为观片灯）上，目测挑选样品中有阴影的米粒并记录数量即为该样品的垩白数量，重复三次，利用excel 2016计算垩白率（垩白率（%）=有垩白米粒数（粒）/测量样品总数（粒）*100%）并分析数据。数据分析结果表明，与野生型相比，过表达zmd11的水稻籽粒垩白率显著降低（图2和图3a）。
[0020]
籽粒总淀粉含量分析：根据gb 5009.9-2016食品安全国家标准，进行总淀粉的测定。利用excel 2016对结果进行分析。结果表明，过表达zmd11的转基因水稻籽粒中总淀粉含量均显著高于野生型（图3b）。
[0021]
籽粒直链淀粉含量分析：根据gb 7648-87进行水稻籽粒直链淀粉测定。利用excel 2016对结果进行分析。结果表明，与野生型相比，转基因的水稻籽粒中直链淀粉含量显著降低（图3c）。
[0022]
籽粒总蛋白质含量分析：根据gb 5009.5-2016 食品安全国家标准，进行蛋白质含
量的测定。利用excel 2016对结果进行分析。结果发现，转基因的水稻籽粒中总蛋白质的含量均高于野生型（图3d）。
[0023]
实施例4对t
2
代转基因玉米进行品质鉴定，包括对植株总淀粉含量、直链淀粉含量及总蛋白质含量进行测定。
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如图4所示，为t
2
代转基因玉米籽粒表型品质鉴定结果。
[0025]
籽粒总淀粉含量分析：根据gb 5009.9-2016食品安全国家标准，进行总淀粉的测定。利用excel 2016对结果进行分析。结果表明，过表达zmd11的转基因玉米籽粒中总淀粉含量均显著高于野生型（图5a）。
[0026]
籽粒直链淀粉含量分析：根据gb 7648-87进行水稻籽粒直链淀粉测定。利用excel 2016对结果进行分析。结果表明，与野生型相比，转基因的玉米籽粒中直链淀粉含量显著降低（图5b）。
[0027]
籽粒总蛋白质含量分析：根据gb 5009.5-2016 食品安全国家标准，进行蛋白质含量的测定。利用excel 2016对测定结果进行分析。结果发现，转基因的玉米籽粒中总蛋白质的含量均高于野生型（图5c）。
[0028]
实施例2结合实施例3、4中转基因水稻及玉米籽粒的品质鉴定结果表明，籽粒中垩白率的降低、淀粉及蛋白质含量的提升与zmd11基因表达量的增加有关。通过对过表达zmd11基因的水稻和玉米进行品质鉴定，发现其淀粉和蛋白质含量均显著提升，直链淀粉含量均显著减少，且稻米垩白率显著降低。结合基因的表达水平与品质鉴定结果比较分析证明，玉米zmd11基因参与调控籽粒中的垩白、淀粉及蛋白质的形成，极大地提升了籽粒品质。本发明利用分子手段精确调控玉米zmd11基因的表达，以促进内源br的合成，从而创制高产优质新品系。
[0029]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

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