来源于水稻的蛋白质的用途的制作方法

[0001]
本发明涉及来源于水稻的蛋白质的用途，特别涉及来源于水稻的蛋白质在调控植物株高和/或粒型中的应用。


背景技术：

[0002]
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。随着耕地面积的减少、人口的迅速增长，提高水稻的产量对解决粮食安全危机具有重要的意义。因此，利用现代生物学技术培育更高产量的作物品种仍是当前育种工作的主要目标。
[0003]
水稻产量是由多种因素共同影响的复杂农艺性状，其构成因子主要包括株高、穗粒数、抽穗期、结实率、分蘖数和千粒重等。水稻的植株高度是受节间纵向伸长所影响的重要株型指标，决定着水稻的抗倒伏与生物学产量，并作用于水稻谷物产量，第二次绿色革命就是通过降低水稻高度，提高抗倒伏性而达到高产的目的。水稻节间形态是节间居间分生组织细胞分裂和细胞纵向伸长共同作用的结果，其中任何一个因素受到影响，都可能引起植株矮化表型的产生。另外，植物激素、转录因子、细胞壁合成、光合产物合成及转运、细胞周期、微管及微丝的排列等相关基因都参与调控水稻茎秆的生长发育，其中植物激素的调控起着非常重要的作用。水稻粒型是粒重的决定因子，包括粒长、粒宽、粒厚和长宽比四个要素，受细胞增殖和细胞伸长影响；同时粒型也是水稻品质的重要决定因素。它在遗传上属于数量性状，受多基因的共同控制。截止目前，已有超过400个与水稻粒型相关的主效基因和数量性状位点(quantitative trait locus，qtl)被初步定位，其中60多个基因和qtl被图位克隆。因此，挖掘与水稻株高和粒型相关的基因，利用基因工程技术改良水稻性状，对提高水稻产量和外观品质具有重要意义。
[0004]
现阶段已有不少株高和粒型相关基因的报道，但真正运用到生产上的并不多，究其原因是水稻株高和粒型是受多基因调控的复杂性状，而目前对其研究主要是集中在单个基因的克隆，对他们之间复杂的调控网络还不清楚。因此，对于水稻株高和粒型的研究需要挖掘更多新的株高和粒型相关基因，分析相关基因之间相互作用及其调控网络，深入探究调控株高和粒型的分子机制，为水稻分子育种提供理论依据。


技术实现要素：

[0005]
本发明的一个目的是提供dsg2蛋白的新用途。
[0006]
本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质为dsg2蛋白，来源于水稻(oryzasativa l.)，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)的蛋白质：
[0007]
(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008]
(a2)在序列表中序列2所示的氨基酸序列的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
[0009]
(a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
[0010]
(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
[0011]
其中，序列表中序列2由810个氨基酸残基组成。
[0012]
标签具体如表1所示。
[0013]
表1标签的序列
[0014]
标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedlha9ypydvpdya
[0015]
本发明蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0016]
本发明提供了上述蛋白质在调控植物株高和/或粒型中的应用。
[0017]
本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。
[0018]
本发明提供了与上述蛋白质相关的生物材料在调控植物株高和/或粒型中的应用。
[0019]
所述与上述蛋白质相关的生物材料为下述b1)-b10)中的任一种：
[0020]
b1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
[0021]
b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
[0022]
b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；
[0023]
b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；
[0024]
b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；
[0025]
b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；
[0026]
b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；
[0027]
b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；
[0028]
b9)含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
[0029]
b10)含有b2)所述表达盒的转基因细胞系。
[0030]
上述应用中，b1)所述核酸分子为如下(c1)-(c4)中任一所示：
[0031]
(c1)编码序列是序列表中序列1的第2528-4960位所示的dna分子；
[0032]
(c2)序列表中序列1所示的dna分子；
[0033]
(c3)与(c1)或(c2)限定的dna分子序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性，且编码权利要求1中所述的蛋白质的dna分子；
[0034]
(c4)在严格条件下与(c1)或(c2)或(c3)限定的dna分子杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的dna分子。
[0035]
其中，序列表中序列1由5355个核苷酸组成，编码序列由2433个核苷酸组成。
[0036]
所述严格条件是在2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次
5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
[0037]
上述应用中，所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白质的重组载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0038]
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0039]
上述应用中，所述调控为如下(i)和/或(ii)：
[0040]
(i)提高或降低植物株高；
[0041]
(ii)提高或降低植物籽粒大小。
[0042]
本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料的新用途。
[0043]
本发明提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在培育株高变矮和/或籽粒变小的转基因植物中的应用。
[0044]
本发明还提供了上述蛋白质或与上述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。
[0045]
本发明还有一个目的是提供一种培育株高变矮和/或籽粒变小的转基因植物的方法。
[0046]
本发明提供的培育株高变矮和/或籽粒变小转基因植物的方法，包括抑制受体植物中上述蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物比受体植物的株高变矮和/或籽粒变小。
[0047]
上述方法中，所述抑制受体植物中上述蛋白质的表达量和/或活性的方法为通过对所述受体植物中上述蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默来实现的。
[0048]
上述方法中，所述抑制受体植物中上述蛋白质的活性和/或含量的方法是利用crispr方法对所述受体植物中上述蛋白质的编码基因进行敲除来实现的。
[0049]
上述方法中，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列1第2528-4960位所示的dna分子。
[0050]
上述方法中，所述crispr方法中的靶序列如序列表中序列1第2645-2667位。
[0051]
上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为稻属植物。所述稻属植物可为水稻，具体为水稻tp309。
[0052]
本发明利用水稻tp309的组织培养中自然突变而获得的株高矮化和籽粒变小的突变体，获得了可控制水稻株高和粒型的基因dsg2。进一步通过构建dsg2基因组互补实验和crispr/cas9基因编辑实验证实了dsg2及其编码基因在控制水稻株高和粒型中发挥重要作
用。本发明不仅为进一步阐明调控水稻株高和粒型的分子机理提供基础，也为水稻育种提供新的基因资源。
附图说明
[0053]
图1为突变体dsg2与水稻tp309表型图。
[0054]
图2为突变体dsg2与水稻tp309茎节电镜观察；其中，a为水稻tp309和突变体dsg2的茎秆长度比较结果；b为扫描电镜下水稻tp309茎秆细胞纵切图；c为扫描电镜下突变体dsg2茎秆细胞纵切图；d为石蜡切片水稻tp309茎秆细胞纵切图；e为石蜡切片突变体dsg2茎秆细胞纵切图。
[0055]
图3为突变体dsg2与水稻tp309颖壳扫描电镜观察。
[0056]
图4为t
3
代互补突变体转基因植株、t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株、突变体dsg2和水稻tp309的株高的表型图。
[0057]
图5为t
3
代互补突变体转基因植株、t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株、突变体dsg2和水稻tp309的粒型的表型图。
具体实施方式
[0058]
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业涂径得到。
[0059]
下述实施例中的，水稻tp309(也称为野生型水稻)，记载在如下文献：chen，x.，hao，l.，pan，j.，zheng，x.，jiang，g.，jin，y.，gu，z.，qian，q.，zhai，w.，and ma，b.(2012).spl5，a cell death and defense-related gene，encodes a putative splicing factor 3b subunit 3(sf3b3)in rice.mol breed30，939-949。由中国科学院遗传与发育生物学研究所江光怀研究员保存。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
[0060]
下述实施例中的，籼稻mh63记载在如下文献：zhao，j.y.，liu，p.c.，li，c.r.，wang，y.y.，guo，l.q.，jiang，g.h.，and zhai，w.x.(2017).lmm5.1and lmm5.4，two eukaryotic translation elongation factor 1a-like gene family members，negatively affect cell death and disease resistance in rice.j genet genomics44，107-118。由中国科学院遗传与发育生物学研究所江光怀研究员保存。公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
[0061]
下述实施例中的载体pcambia1300购自camia公司，澳大利亚。
[0062]
下述实施例中的载体pcambia1300-pyao-cas9购自上海柯雷生物科技有限公司，货号kl-zl1639。
[0063]
下述实施例中的农杆菌eha105和eha105/psoup购自camia公司，澳大利亚。
[0064]
本发明中所用到的培养基的组分和配比如下：
[0065]
诱导培养基：用于诱导tp309产生愈伤组织。4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，2.0g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，调ph至5.8后
加入3.8g/l的植物凝胶。
[0066]
共培养培养基：4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，100μm/l乙酰丁香酮，调ph至5.2后加入3.8g/l的植物凝胶。
[0067]
筛选培养基：用于转化后筛选抗性愈伤组织。4.4g/l的ms基础培养基，2mg/l的2，4-d，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，调ph至5.8后加入3.8g/l的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的潮霉素b(终浓度50mg/l)和羧苄青霉素(终浓度400mg/l)。
[0068]
分化培养基：用于筛选后抗性愈伤组织的再分化。4.4g/l的ms基础培养基，30g/l的山梨醇，0.5g/l的水解酪蛋白，0.5g/l的脯氨酸，0.5g/l的谷氨酰胺，18.35mg/l的铁盐(乙二胺四乙酸铁钠盐)，10ml(100
×
)的b5有机溶液，0.1g/l的肌醇，调ph至5.8后加入3.5g/l的植物凝胶。倒培养基前，加入无菌的kt(终浓度0.2mg/l)、naa(终浓度0.1mg/l)、6-ba(终浓度2mg/l)和潮霉素b(终浓度40mg/l)。
[0069]
生根培养基：2.2g/l的ms基础培养基，30g/l的蔗糖，0.5g/l的水解酪蛋白，调ph至5.8后加入3.2g/l的植物凝胶。
[0070]
实施例1水稻株高和粒型相关基因的发现
[0071]
一、水稻株高和粒型突变体的获得
[0072]
在水稻tp309组织培养过程中自然突变获得了水稻矮杆小粒突变体dwarf and small grain 2(简称dsg2或突变体dsg2)，突变体dsg2和水稻tp309的表型如图1所示，突变体dsg2(图中以“dsg2”表示)相对于水稻tp309(图中以“tp309”表示)表现为株高矮化和籽粒变小。经多代自交，其性状可稳定遗传。
[0073]
进一步对茎秆和籽粒进行观察，结果均表明相比水稻tp309，突变体dsg2每节茎秆长度、茎秆细胞长度和颖壳外表皮细胞长度均明显缩短。具体方法和结果如下：
[0074]
一)对茎秆进行石蜡切片细胞学形态观察：
[0075]
(1)材料的固定：在抽穗期选取突变体dsg2和水稻tp309植株穗下第二节间的相同部位横切成段，截取的组织块不宜太大以便固定剂穿透，通常以5mm
×
5mm
×
2mm或10mm
×
10mm
×
2mm为宜。将切取的组织块用生理盐水冲洗后，立即投入faa固定液(对于幼嫩的组织，50％乙醇∶福尔马林∶冰醋酸＝18∶1∶1，对于相对成熟的组织可将50％乙醇换为70％乙醇中固定，抽真空5min，重复三次使材料完全下沉，转入4℃冰箱过夜。
[0076]
(2)材料的脱水：依次用30％乙醇、50％(40％乙醇和10％正丁醇)乙醇溶液、70％(50％乙醇和20％正丁醇)乙醇溶液、85％(50％乙醇和35％正丁醇)乙醇溶液、95％(40％乙醇和55％正丁醇)乙醇溶液脱水处理1h(置于摇床上80-100rpm震荡洗脱)。随后在含25％乙醇和75％正丁醇的溶液中加入1％的藏红，80-100rpm过夜处理。
[0077]
(3)材料的透明：将上述染色的材料用100％的正丁醇清洗，每次洗脱3h，重复3次。然后用100％正丁醇过夜置换，洗脱和置换均进行80-100rpm震荡。
[0078]
(4)浸蜡处理：倒掉上述置换液，加入新的正丁醇(10ml左右)，将正丁醇和材料预热至65℃，然后加入和正丁醇等体积的液体石蜡，混合均匀后置于60℃烘箱中使正丁醇完全挥发，直至只剩下液体石蜡(需要2天左右的时间)。
[0079]
(5)材料的包埋：将铁盒放在已经加热的温台上，先倒入适量石蜡，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于铁盒底部，待材料能固定在盒中且角度正确，再扣上白盖、滴蜡。放置
于冷冻台，使盒中待包埋的材料迅速凝固。待石蜡完全凝固(约30min)后即可取出，4℃保存备用。
[0080]
(6)切片：将蜡块从包埋盒中取出，调整刀片与石蜡切片约成15度的夹角，调整厚度调节器为8-10μm，将蜡块切成蜡带。
[0081]
(7)制片：蜡带约20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑断，避免卷曲，平放在蜡带盒上。用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻片上并滴一滴双蒸水，置于显微镜下观察切片是否良好。选择制作良好的切片，放置于37℃预热的展片台上，待蜡片受热伸展摊平后，置于37℃恒温箱过夜烘干。
[0082]
(8)脱蜡复水处理：将烘干的石蜡切片浸入二甲苯中，脱蜡处理30min，随后转入1∶1的二甲苯∶无水乙醇溶液中处理10min，再依次转入100％、95％、85％、70％、50％、30％的酒精溶液中处理10min，最后用蒸馏水处理10min。
[0083]
(9)染色与清洗：将脱好蜡的载玻片浸入含有1％的甲苯胺蓝水溶液中，染色5min。根据自己需要的染色程度调整染色时间，确认染色完成后用蒸馏水冲洗，去除表面浮色。
[0084]
(10)观察：若不需要永久封藏切片，待片子干燥后，在染好色的切片上滴一滴无菌水，盖好盖玻片，在显微镜下观察照相。
[0085]
结果如图2中a所示，相比水稻tp309，突变体dsg2每节茎秆长度都缩短；如图2中b、c、d和e所示，相比水稻tp309，突变体dsg2茎秆细胞长度明显缩短。
[0086]
二)对成熟种子颖壳进行扫描电镜观察
[0087]
对于颖壳的观察，选取灌浆饱满但未脱水变黄的籽粒，置于烘箱中干燥。经二氧化碳临界点干燥后镀金，之后用扫描电子显微镜观察内外稃的细胞大小和并统计细胞的数目。
[0088]
结果如图3所示，相比水稻tp309，突变体dsg2颖壳表面光滑，无表皮毛；突变体dsg2颖壳外表皮细胞长度明显缩短。
[0089]
二、水稻株高和粒型相关基因的获得
[0090]
通过构建水稻tp309与籼稻mh63杂交群体，利用图位克隆的方法，将该基因初步定位于2号染色体着丝粒附近，约557kb的区段内。由于该区段靠近着丝粒，交换概率低，很难将其范围继续缩小。因此，接下来结合mutantmap测序分析，最终在该区段内发现，一个存在有义点突的基因，该基因单碱基突变导致其翻译得提前终止。遗传互补和敲除实验证明，该候选基因是控制水稻株高和粒型的基因。本发明克隆了来自水稻tp309中的该基因，命名为dsg2基因，所述dsg2基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示的dna分子。
[0091]
提取水稻tp309的总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，用dsg2-cds-f和dsg2-cds-r为引物进行pcr扩增，得到2433bp的dsg2基因的编码区序列，所述dsg2基因的编码区序列的核苷酸序列如序列表中序列1的第2528-4960位所示的dna分子，，将其编码的蛋白命名为dsg2，dsg2，的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0092]
其中，引物如下：
[0093]
dsg2-cds-f：5
′-
atgtcgacggccgccaaggag-3
′
[0094]
dsg2-cds-r：5
′-
ttacactgaggagcgctccaa-3
′
。
[0095]
实施例2dsg2基因的功能验证
[0096]
一、互补载体转基因植株的获得
[0097]
为验证dsg2在水稻株高和粒型调控中的作用，通过在突变体dsg2中进行dsg2基因组互补实验进行功能验证。
[0098]
一)、互补载体的构建
[0099]
1、提取水稻tp309两周大幼苗的基因组dna。
[0100]
2、以步骤1的dna为模板，用dsg2-coml-f和dsg2-coml-r组成的引物对进行pcr扩增，得到如序列表中序列1的第1-5302位所示的大小为5302bp的扩增产物片段a(seq正向)。
[0101]
其中，引物对为：
[0102]
dsg2-com1-f：5
′-
cactccatacattgcggggt-3
′
[0103]
dsg2-com1-r：5
′-
acattcttcccgctttcggt-3
′
[0104]
3、以步骤2中的片段a为模板，用dsg2-com2-f和dsg2-com2-r组成的引物对进行pcr扩增，得到5334bp的扩增产物片段b(seq正向)。
[0105]
其中，引物对为：
[0106]
dsg2-com2-f：5
′-
acgacggccagtgccacactccatacattgcggggt-3
′
[0107]
dsg2-com2-r：5
′-
tgaccacccggggatcacattcttcccgctttcggt-3
′
[0108]
(下划线部分为与载体pcambia1300同源的序列)
[0109]
4、用限制性内切酶sal i和bam hi酶切表达载体pcambia1300，回收约10kb大小的载体骨架。
[0110]
5、将步骤3中的得到的片段b通过同源重组定向克隆的方法连接到步骤4回收的载体骨架上，得到了重组质粒pdsg2：：dsg2。
[0111]
6、重组质粒pdsg2：：dsg2的测序结果表明，其包含dsg2基因完整的2433bp编码区序列(序列1第2528-4960位)，以及起始密码子上游2527bp的非编码区序列(序列1第1-2527位)和终止密码子下游342bp的非编码区序列(序列1第4961-5302位)。
[0112]
二)、t
0
代植株的获得
[0113]
1、将重组质粒pdsg2：：dsg2通过电击转化的方法分别导入到根癌农杆菌eha105中，得到重组农杆菌。
[0114]
2、用含150μm乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1中的重组农杆菌稀释至od
600
在0.1-0.2之间，得到侵染液。
[0115]
3、挑选淡黄色、形状规则、颗粒状的预培养的突变体dsg2的愈伤组织于50ml无菌的三角瓶中，加入步骤2中的侵染液浸泡15-20min，倒出侵染液并用无菌滤纸吸干残余菌液，然后愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。
[0116]
4、挑选步骤3中无菌、颜色鲜亮的颗粒状愈伤组织，将其放置于筛选培养基中，30℃黑暗培养2-3周。将长出的新的愈伤颗粒放置于新的筛选培养基上，继续培养2-3周，进行第二次筛选。
[0117]
5、经过两次筛选的抗性愈伤会产生新的愈伤颗粒，从每个独立的胚性愈伤中挑选3颗到分化培养基上，每皿放置5个区域；30℃光照条件下(16h光照/8h黑暗)，培养3-4周至幼苗长出。
[0118]
6、将步骤5中的幼苗转移到生根培养基中，30℃光照培养(16h光照/8h黑暗)3-4周，练苗后移栽至转基因试验田，得到t
0
代植株。
[0119]
三)、转基因植株的鉴定
[0120]
分别提取上述t
0
代植株幼苗的基因组dna和3株突变体dsg2幼苗的基因组dna，采用hpt-f和hpt-r组成的引物对进行pcr鉴定，有73株t
0
代植株幼苗中得到目的条带为845bp大小的特异性条带，pcr鉴定中扩增得到目的条带的植株即为互补载体转基因植株，共得到73株互补载体转基因植株。3株突变体dsg2幼苗中均没有得到扩增产物。
[0121]
其中，所述引物如下：
[0122]
hpt-f：5
′-
taggagggcgtggatatgtc-3
′
[0123]
hpt-r：5
′-
tacacagccatcggtccaga-3
′
；
[0124]
二、dsg2基因敲除后的转基因植物的获得
[0125]
为验证dsg2在水稻株高和粒型调控中的作用，通过在水稻tp309中进行dsg2基因敲除实验进行功能验证。
[0126]
一)、基因敲除载体的构建
[0127]
1、以rgap数据库(rice genome annotation project)公布的dsg2基因的编码区序列为参考，利用crispr靶位点设计网站(http：//www.rgenome.net/cas-designer/)选取了dsg2基因敲除的靶位点序列，序列为：gccaaggcggtcaagggcaaggg(序列1的第2645-2667位)，其中，下划线部分为pam(protospacer adjacent motif)序列，分别设计靶位点引物ko-f和ko-r。
[0128]
引物序列如下：
[0129]
ko-f：5
′-
ggcagccaaggcggtcaagggcaa-3
′
[0130]
ko-r：5
′-
aaacttgcccttgaccgccttggc-3
′
[0131]
2、合成靶位点引物序列，稀释成10μm备用。
[0132]
3、探针退火：在反应体系中加入ko-f和ko-r各10μl，加入1μl t4 pnk酶和5μl t4连接酶缓冲液，用ddh
2
o定容到50μl；在37℃孵育1h后，加入2.5μl 1m的nacl，95℃反应5s，自然退火2-3h，得到退火探针。
[0133]
4、载体酶切：用bsa i限制性内切酶在37℃酶切pcambia1300-pyao-cas9载体4h，65℃孵育20min使bsa i失活，胶回收酶切载体片段。
[0134]
5、将上述退火探针与酶切载体片段用t4连接酶连接1h，而后转化大肠杆菌dh5α；进行菌落pcr鉴定并送测序，将测序正确的dsg2基因敲除载体命名为pdsg2-ko。
[0135]
二)、t
0
代植株的获得
[0136]
1、将pdsg2-ko通过电击转化的方法分别导入到根癌农杆菌eha105/psoup中，得到重组农杆菌。
[0137]
2、用含150μm乙酰丁香酮的悬浮培养液将步骤1中的重组农杆菌稀释至od
600
在0.1-0.2之间，得到侵染液。
[0138]
3、挑选淡黄色、形状规则、颗粒状的预培养水稻tp309愈伤组织于50ml无菌的三角瓶中，加入步骤2中的侵染液浸泡15-20min，倒出侵染液并用无菌滤纸吸干残余菌液，然后愈伤组织转移到共培养培养基上，23℃黑暗条件下共培养48h。
[0139]
4、挑选步骤3中无菌、颜色鲜亮的颗粒状愈伤组织，将其放置于筛选培养基中，30℃黑暗培养2-3周。将长出的新的愈伤颗粒放置于新的筛选培养基上，继续培养2-3周，进行第二次筛选。
[0140]
5、经过两次筛选的抗性愈伤会产生新的愈伤颗粒，从每个独立的胚性愈伤中挑选
3颗到分化培养基上，每皿放置5个区域；30℃光照条件下(16h光照/8h黑暗)，培养3-4周至幼苗长出。
[0141]
6、将步骤5中的幼苗转移到生根培养基中，30℃光照培养(16h光照/8h黑暗)3-4周，练苗后移栽至转基因试验田，得到t
0
代植株。
[0142]
三)转基因植株的鉴定
[0143]
1、提取上述t
0
代植株幼苗的基因组dna，采用hpt-f和hpt-r组成的引物对进行pcr鉴定，目的条带为845bp大小的特异性条带，pcr鉴定中扩增得到目的条带的植株即为转基因阳性植株。
[0144]
其中，所述引物如下：
[0145]
hpt-f：5
′-
taggagggcgtggatatgtc-3
′
[0146]
hpt-r：5
′-
tacacagccatcggtccaga-3
′
[0147]
2、将步骤1中鉴定为转基因阳性植株的基因组dna，采用dsg2-f和dsg2-r组成的引物对进行pcr扩增，将扩增片段回收后进行测序分析(测序由北京擎科生物科技有限公司完成)。
[0148]
其中，所述引物如下：
[0149]
dsg2-f：5
′-
tacggcgggattggattagc-3
′
[0150]
dsg2-r：5
′-
ggttggaggcggagaagacg-3
′
[0151]
3、将步骤2中的测序结果与水稻tp309中dsg2基因的序列进行比对，进一步确认靶位点序列发生错义突变/插入/缺失的植株即为dsg2基因敲除后的转基因植株，共得到20株dsg2基因敲除后的转基因植株。其中18株发生插入突变，2株发生碱基替换。具体结果如下：
[0152]
7株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸t，6株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸a，2株在序列表中序列1第2663位-第2669位插入7个核苷酸gcctgtc，1株在序列表中序列1第2662位和2663位插入两个核苷酸gt，1株在序列表中序列1第2662位插入一个核苷酸g，1株在序列表中序列1第2662位发生点突变由c变成a，1株在序列表中序列1第2662位和2663位发生点突变由ca变成ac。
[0153]
三、转基因植株的表型分析
[0154]
t
0
代转基因植株种子进行种植，植株自交得到t
1
代种子，再连续种植两次后植株即为t
3
代植株，通过该方法，获得t
3
代互补载体转基因植株和t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株。
[0155]
将30株t
3
代互补载体转基因植株、30株t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株、30株突变体dsg2和30株水稻tp309定植于大田，在平行条件下培养，观察整个生长期内植株的表型。结果表明，30株t
3
代互补载体转基因植株的株高为113+1.42(平均值
±
标准差)，粒长为7.21
±
0.04(平均值
±
标准差)；30株t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株的株高为73.2
±
1.68(平均值
±
标准差)，粒长为5.85
±
0.02(平均值
±
标准差)；30株突变体dsg2的株高为77.1
±
1.77(平均值
±
标准差)，粒长为5.91
±
0.03(平均值
±
标准差)；30株水稻tp309的株高为117
±
1.16(平均值
±
标准差)，粒长为7.18+0.02(平均值
±
标准差)。
[0156]
t
3
代互补载体转基因植株(图中以“com-1”表示)的株高和粒型得以恢复，与水稻tp309(图中以“tp309”表示)一致(图4和图5所示)。
[0157]
与水稻tp309相比，t
3
代dsg2基因敲除后的转基因植株(图中以“ko-l”表示)表现
出了与突变体dsg2(图中以“dsg2”表示)类似的表型特征，即株高变矮和籽粒变小(图4和图5所示)。
[0158]
上述结果表明，dsg2基因参与调控水稻株高和粒型。
[0159]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

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