无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法与流程

[0001]
本发明涉及细胞培养领域，尤其是无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法。


背景技术：

[0002]
间质干细胞最初在骨髓中被发现，随后在多种组织中，包括皮下脂肪组织也被证实含有间质干细胞，其中脂肪组织是间质干细胞的丰富来源，且相对较容易获得，可适用于组织工程和再生医学应用。许多文献证明该脂肪来源的间质干细胞(adipose derived stromal cells,adscs)的多能性，其具有分化成软骨、硬骨和脂肪细胞的潜力。
[0003]
rodbell等学者在1960年代开创了传统，且同时也是最被广为使用的从脂肪组织中分离基质血管部份(stromal vascular fraction,svf)，并在体外培养扩增间质干细胞的方法，该方法最初是用于分离脂肪组织中的脂肪细胞(adipocytes)。此方法是先切碎大鼠的脂肪垫(fat pad)，并洗去大部分的血液细胞后，再加入胶原蛋白水解酶(collagenase)以进行组织分解作用，而后再利用离心的方式，将成熟的脂肪细胞群与基质血管部分的沉淀物进行分离，再将基质血管部分培养扩增以得到脂肪间质干细胞。基质血管部分是一种异质的细胞群(heterogenous cell population)，其中包含血液细胞(blood cells)、血液干细胞(hematopoietic stem cells)、纤维母细胞(fibroblasts)、周边细胞(pericytes)、内皮细胞(endothelial cells)、脂肪前驱细胞(pre-adipocytes)、及间质干细胞(adscs)等不同的细胞种类，尔后再以红血球溶解缓冲溶液(rbc lysis buffer)作用，以裂解并除去基质血管部分中的红细胞；因此，可基于间质干细胞具有粘附到细胞培养皿表面的能力，从中分离与扩增脂肪间质干细胞。
[0004]
新兴的再生医学领域需要可靠的干细胞来源。脂肪组织已被证明可作为成体多能性干细胞的丰富来源且相对容易取得，符合组织工程和再生医学应用的性质。目前的基质血管部分的分离方式需要使用胶原蛋白酶，其浓度范围为0.075-0.1％；其中，胶原蛋白水解酶是来自溶组织梭菌(clostridiumhistolyticum)，该酵素的分解效率是依据酵素的质量和浓度而有不同，例如粗萃取(crude extract)或纯化(purified)，以及有无并用其他蛋白水解酶如中性蛋白水解酶(dispase)或嗜热菌蛋白水解酶(thermolysin)。但胶原蛋白水解酶的来源及其残留，皆会对未来于临床应用时造成安全上的疑虑，因此目前美国食品药品监督管理局(food and drug adminis-tration,fda)并未核准该种利用胶原蛋白酶产出脂肪间质干细胞于临床的应用。
[0005]
综合上面所述，开发一种实用且不使用酵素即可进行脂肪间质干细胞的培养，又能同时提高脂肪间质干细胞扩增率的方法，着实有其必要性。


技术实现要素：

[0006]
缘此，本发明的一目的在提供一种无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞(adipose-derived stromal cells,adscs)的方法，包含以下步骤：a.收集一脂肪组织；b.以一脂溶性组合物(lippodissolve composition)溶解该脂肪组织中的成熟脂肪，其中该
脂溶性组合物不含有酵素；c.离心以将该经溶解成熟脂肪的脂肪组织中固态与液态的部分分离；d.将该脂肪组织中固态的部分分成一外植体片；e.将该外植体片进行一干燥步骤；f.使该外植体片浸于一脂肪间质干细胞培养基中，成为一外植体培养组合物(explant culture composition)并进行培养；以及g.从该外植体培养组合物中得到目标的脂肪间质干细胞，且步骤b的该脂溶性组合物不含有酵素。
[0007]
在本发明的一实施例中，该步骤g中所得的脂肪间质干细胞保留其原始的细胞特性。
[0008]
在本发明的又一实施例中，该步骤a的脂肪组织是取自一个体的皮下(subcutaneous)、内脏脂肪垫(visceral fat pad)、或脂肪抽吸物(lipoaspirate)。
[0009]
在本发明的又一实施例中，该步骤f的该外植体培养组合物包含一间质干细胞组合物(stromal cell composition)，且该间质干细胞组合物包含源自哺乳类动物的脂肪组织的间质干细胞群；且该间质干细胞群包含一血液细胞(blood cells)、一血液干细胞(hematopoietic stem cells)、一纤维母细胞(fibroblasts)、一周边细胞(pericytes)、一内皮细胞(endothelial cells)、一脂肪前驱细胞(pre-adipocytes)、脂肪细胞(adipocytes)、及/或一间质干细胞(adscs)。
[0010]
在本发明的又一实施例中，该步骤b的脂溶性组合物包含一生理食盐水、以及一能溶解脂肪组织的脂溶性材料；且以该脂溶性组合物溶解该脂肪组织中的成熟脂肪的反应时间为5-10分钟；其中，该脂溶性组合物中该生理食盐水浓度为99％、且该能溶解脂肪组织的脂溶性材料浓度为1％；且该能溶解脂肪组织的脂溶性材料是为必需磷脂(phospholipid essential)、及/或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)；且该必需磷脂或该磷脂酰胆碱在该脂溶性材料中的浓度是为40-60mg/ml，其中浓度较佳为50mg/ml。
[0011]
在本发明的又一实施例中，该步骤d的外植体片是将该脂肪组织中固态的部分剪碎成为一直径约5至10毫米的组织块；并以适当间距置于细胞培养皿内；该步骤e的干燥步骤是将该外植体片干燥20-30分钟；且该步骤f的脂肪间质干细胞培养基包含89-97％的αmem、2-10％的人血小板裂解物(human platelet lysate,hpl)、及1％的抗生素。
[0012]
本发明所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，其中该间质干细胞是由脂肪组织中提取，间质干细胞具有贴附培养皿生长的特征，然而脂肪组织中过多的脂肪分子，会阻碍该些间质干细胞的贴附，因此本发明使用天然存在于人体中的接口活性剂，以皂化并溶解脂肪组织中的成熟脂肪，使得脂肪组织中的间质干细胞能够直接暴露于培养皿上，并增加该间质干细胞与培养皿的接触面积，以达到较佳的贴附率及细胞培养产出率。
[0013]
本发明所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，能够在离体培养的环境下获得相当数量的脂肪间质干细胞，且相较于传统的方法，亦较为容易、安全、快速、便宜、且更有效，并且更加符合细胞组织优良操作规范(good tissue practice)，使得本发明无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法更能有效地应用于未来组织工程和再生医学。
[0014]
以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
[0015]
图1是为本发明的脂肪组织的外植体培养的照片；
[0016]
图2是为本发明的脂肪组织的外植体的脂肪间质干细胞生长的照片；
[0017]
图3是为本发明的方法获得的间质细胞总产量的柱形图。
具体实施方式
[0018]
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
[0019]
使用excel软件进行统计分析。数据以平均值
±
标准偏差(sd)表示。
[0020]
本发明提供一种无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，其中该间质干细胞是由脂肪组织中提取，间质干细胞具有贴附培养皿生长的特征，然而脂肪组织中过多的脂肪分子，会阻碍该些间质干细胞的贴附，因此本发明使用天然存在于人体中的接口活性剂，例如必需磷脂或该磷脂酰胆碱，以皂化并溶解脂肪组织周边的成熟脂肪，使得脂肪组织中的间质干细胞能够直接暴露于培养皿上，并增加该间质干细胞与培养皿的接触面积，以达到较佳的贴附率及培养率；且因为是使用天然存在于人体中的接口活性剂，能够较贴近生理环境以减少溶解脂肪的过程中，对间质干细胞造成伤害。
[0021]
同时，传统习知从脂肪组织分离间质干细胞的方法，需要使用胶原蛋白水解酶(collagenase)以分离成熟脂肪细胞，然而酵素对细胞的伤害目前尚不清楚，例如酵素的来源及其残留，皆会对未来于临床应用时造成安全上的疑虑；因此，本发明提供一种实用而不使用胶原蛋白水解酶的分离及培养脂肪间质干细胞的方法，能够直接又有效地减少使用酵素对间质干细胞所造成的安全上的疑虑，又能同时达到提升细胞培养产出率的目的。
[0022]
如本文中所使用的，用语「脂溶性组合物」意为包含：99％的生理食盐水、及1％能溶解脂肪组织的脂溶性材料的组合物；其中，该能溶解脂肪组织的脂溶性材料可为，但不限于必需磷脂(phospholipid essential)/及或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)，且该必需磷脂或该磷脂酰胆碱在该脂溶性材料中的浓度是40-60mg/ml，其中浓度较佳为50mg/ml。
[0023]
如本文中所使用的，用语「天然存在于人体中的界面活性剂」可为，但不限于必需磷脂或磷脂酰胆碱；其中，磷酰胆碱为人体内胆碱(choline)的内源性的储存形式。
[0024]
本发明中使用含有磷脂酰胆碱的脂溶性组合物(lippodissolve composition)去除脂肪组织中的成熟脂肪，能够增加脂肪组织的外植体与培养皿表面的接触面积及贴附率，因而增高脂肪组织内部的间质干细胞的暴露、迁移与细胞培养的产出率。
[0025]
如本文中所使用的，用语「外植体培养(explant culture)」意为避开胶原蛋白水解酶对间质干细胞所可能造成的伤害及其残留在其中的可能性，以最大化间质干细胞的存活率的体外培养方法；其中，该外植体培养的方法保留了脂肪组织团块内的细胞互动及细胞外基质，此种方法同时有利于重现并保留间质干细胞于原始组织中原本的特性(recapitulate in-vivo characteristics of the original tissues)，例如其与细胞外基质(extracellular matrix,ecm)以及细胞-细胞间的相互作用(cell-cell interaction)等，使得所培养出来的间质干细胞较为健康且更容易实际应用于人体中。
[0026]
本发明所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，能够在离体培养的环境下获得相当数量的脂肪间质干细胞，且相较于传统的方法，亦较为容易、安全、快速、便
宜、且更有效，并且更加符合细胞组织优良操作规范(good tissue practice)，使得本发明无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法更能有效地应用于未来组织工程和再生医学。
[0027]
以下将详细说明本发明无酵素前处理与扩增脂肪间质干细胞的详细方法、传统的由脂肪组织分离及扩增脂肪间质干细胞方法与本发明的方法的效果的比较测试；以证实本发明的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，相较于传统的方法，能够直接又有效地减少使用酵素对间质干细胞所造成的安全上的疑虑、最大化间质干细胞于体外培养的产出率、且更加符合细胞组织优良操作规范，以使得本发明的方法能更有效地应用于未来组织工程和再生医学领域。
[0028]
实施例1本发明的无酵素前处理与扩增脂肪间质干细胞的方法
[0029]
本发明的一实施例为以无酵素前处理与扩增脂肪间质干细胞的方法；以下操作步骤除了离心步骤在离心机中、细胞培养步骤在细胞培养箱中以外，均在生物安全操作柜(biosafety cabinet)中进行。首先，从一个体的皮下(subcutaneous)、内脏脂肪垫(visceral fat pad)、或脂肪抽吸物(lipoaspirate)获得10ml的脂肪组织，其中该个体包含哺乳动物；接着，将该脂肪组织以1％的脂溶性组合物在室温下作用5-10分钟；其中，该脂溶性组合物中含有99％的生理食盐水、及1％的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)，该磷脂酰胆碱为人体中天然存在的界面活性剂，能够温和的溶解脂肪组织中的成熟脂肪，并将部份溶解的脂肪组织进行温和的离心以使脂肪组织的固态与液态的部份分离，其中该温和离心的条件为室温、离心力300
×
g、持续离心10分钟；接着，将该已分解的脂肪离心沉淀物以无菌解剖剪刀剪碎成直径约5-10毫米的外植体片，再将该外植体片以无菌镊子移至组织培养皿上待其干燥后，以适量的脂肪间质干细胞培养基轻轻覆盖于该外植体上，使该外植体片部分浸泡在该脂肪间质干细胞培养基中，并在37℃与含有5％的co
2
的培养箱中进行细胞培养，其中该脂肪间质干细胞培养基中含有89-97％的alpha-minimum essential media(αmem，购自hyclone，编号sh30265)、2-10％的人血小板裂解物(human platelet lysate,hpl)、及1％的抗生素，抗生素较佳为青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)；其中，αmem的浓度较佳为94％，且人血小板裂解物的浓度较佳为5％；接着，于培养10天后，以显微镜观察由该外植体中脂肪间质干细胞的生长状态；并以死细胞染色剂(trypan blue)搭配细胞计数板(hemocytometer)计算活细胞总数的方法，测定本发明的方法所得到的间质细胞总数量。
[0030]
另外，本实施例亦与传统的由脂肪组织分离及扩增脂肪间质干细胞方法作比较，即以胶原蛋白水解酶作用的传统方法；其中，该方法为将10ml的脂肪组织以1500rpm在室温下离心10分钟，滤掉血液成份后，加入新鲜配置的等体积0.1％的胶原蛋白酶(collagenase)，并在37℃震荡水浴槽中作用60分钟以分解脂肪组织后，于室温以3000rpm离心10分钟后，除去上清液，以取得浓缩的基质血管部份(stromal vascular fracture,svf)，接着使用生理实验水打散并清洗svf后，再度离心得到svf，接着加入红血球裂解液(rbc lysis solution)，在室温下于震荡水浴槽中作用10分钟以除去红血球，再度离心后，利用孔径为70μm的细胞过滤器(cell strainer)将svf中的未能分解的脂肪组织过滤后，于37℃含有5％的co
2
的培养箱中进行细胞培养，并同样以死细胞染色剂搭配细胞计数板计算活细胞总数的方法，测定该传统方法所得到的间质细胞总数量。
[0031]
本发明的脂肪组织的外植体培养方法如图1所示，其中可看出以无菌解剖剪刀剪
碎成直径约5-10毫米的外植体片均匀的分布在含有脂肪间质干细胞培养基的培养皿中的状态；本发明的脂肪组织的外植体中脂肪间质干细胞的生长情况如图2所示，其中可看出许多由左侧外植体中向右侧所生长的脂肪间质干细胞；本发明非酵素处里的脂肪组织中具有较多脂肪间质细胞产量的结果如图3所示，其中可看出同样从10ml的胸部皮下脂肪组织中，以本发明无酵素处理的方法培养10天后，可得到5.42x10
7
个间质细胞的总产量，相较于传统使用酵素处里的方法，可以提高约28倍的间质细胞总产量；此些结果显示，本发明所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，能够在离体培养的环境下扩增相当数量的脂肪间质干细胞。
[0032]
其中，传统酵素培养法需先以胶原蛋白酶处理后以分离出svf，再以svf来培养出脂肪干细胞，其成分与本发明培养方法中外植体片相比，少了大部分的脂肪细胞及血液细胞；而本发明以无酵素前处理与扩增脂肪间质干细胞的方法中，以外植体片进行间质干细胞的扩增，其中保留了脂肪组织团块内的细胞互动及细胞外基质，此种方法能重现并保留间质干细胞于原始组织中原本的特性，使得所培养出来的间质干细胞较为健康且更容易实际应用于人体中；且，其中使用天然存在于人体中的接口活性剂，能温和地去除脂肪组织中的成熟脂肪，以增加脂肪组织中细胞与培养皿表面的接触面积及贴附率，因而能在保留间质干细胞原始特性的同时，增高脂肪组织内部的间质干细胞的暴露、迁移与细胞培养的产出率，使得间质干细胞的产出率比原方法更高。
[0033]
综上所述，本发明所提供的无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法，能够在离体培养的环境下获得相当数量的脂肪间质干细胞，且相较于传统的方法，亦较为容易、安全、快速、便宜、且更有效，并且更加符合细胞组织优良操作规范(good tissue practice)，使得本发明无酵素前处理与培养脂肪间质干细胞的方法更能有效地应用于未来组织工程和再生医学。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除