一种调控水稻白叶枯病抗性的MYB21基因及其应用的制作方法

一种调控水稻白叶枯病抗性的myb21基因及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于水稻抗病领域，具体涉及一种调控水稻白叶枯病抗性的myb21基因及其应用。


背景技术：

[0002]
水稻白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种(xanthomonas oryzae pv. oryzae,xoo)引起的，是水稻生产中普遍发生、危害严重的一种毁灭性细菌病害，其流行范围已遍及全世界，在我国的华中、华东、尤其是华南稻区，经常暴发成灾，严重时可使水稻减产50％。白叶枯病的病原菌可在土壤、杂草、秸秆等上越冬，在水稻生长季节通过水孔或者伤口侵入，在稻株维管束内危害，阻塞维管束，导致植物发病。其病症往往是叶尖出现病斑，随后病斑变黄和扩展，最后病斑覆盖整个叶片。如果该病发生在抽穗期，则会造成不完熟或者不育的谷粒，造成产量降低，同时稻米品质下降。由于该病病原菌在维管束内危害，尚缺乏安全和高效的内吸杀菌剂；加之病原菌的入侵方式，台风、暴雨等造成的损伤和洪涝为其暴发流行创造了有利条件，使得该病往往发病急、传播快，难以控制。目前，普遍认为选育抗病品种是防治白叶枯病非常经济有效的措施。
[0003]
水稻的抗病性分为两大类，一类是由主效抗病基因(r基因)控制的质量抗性，一类是由数量性状位点(qtl)控制的数量抗性。目前，超过40个与水稻白叶枯病相关的r基因已经报道，其中有11个基因(xa1、xa3/xa26、xa4、xa5、xa10、xa13、xa21、xa23、xa25、 xa27、xa41)已经被克隆，个别基因例如xa3、xa4、xa23等已经被成功应用于白叶枯病的抗性应用中。然而，r基因所赋予的抗病性由于强的选择压力和病原体的快速进化，通常只对xoo物种的某些菌株有效。而由qtl介导的数量抗性，由于其影响的病原体群的广度和非特异性，在抗病育种中具有持久有效性。因此，利用qtl在某种程度上可以更好的防治和调控白叶枯病。迄今为止，在不同环境中已经鉴定到70多个与白叶枯病相关的qtl，但由于qtl复杂的遗传控制和未知的功能基因，这些qtl在水稻中的应用非常有限。因此，qtl基因的克隆是有效利用数量抗性进行水稻白叶枯病防治和调控的前提。


技术实现要素：

[0004]
本发明的第一个目的是提供调控水稻白叶枯病抗性的基因myb21。
[0005]
本发明对320份水稻种质抗白叶枯病iv型菌的表型进行了鉴定，结合320份水稻种质的测序数据，利用全基因组关联分析鉴定到1个与白叶枯病抗性相关的主效qtl(qbbr11-4) (图1)，再根据qbbr11-4定位的区间位置，找到了28个预测的蛋白。筛选到11个与抗病有关的基因。通过基因差异表达试验，只有myb21在抗病和感病材料中的表达存在差异(图 3)，在感病材料中的表达较高，而在抗病材料中的表达较低。本发明以模式材料日本晴和感病材料p91孕穗期叶片为材料，提取其总rna，再将rna反转录成cdna，以该逆转录产物为模板设计引物进行pcr扩增。采用pcr产物直接纯化的方法回收目的片段。该目标片段和过量表达载体pox用hind iii和bamh i内切酶，37℃酶切6小时，酶切后连接，再转入大肠杆菌
dh5α中，挑取阳性白色克隆，提取质粒，测序分析，该序列全长975个碱基，其序列如seq id no.1所示，包含1个开放阅读框，即seq id no.1的58-915位碱基所示，编码蛋白具有285个氨基酸残基，其序列如seq id no.2所示。由此构建myb21 的过量表达载体。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，把过量表达载体导入日本晴。转基因植株经pcr及定量pcr鉴定，证明目标基因已经转化到水稻中，并且实现目标基因的表达量提高。转基因阳性植株进行自交纯合，得到纯合阳性转基因株系。把纯合株系和野生型水稻种子发芽，用盆栽长到3叶期，然后移栽到土里，待孕穗期进行白叶枯病iv型菌接种。采用剪叶接种的方法，每个株系剪叶50片以上，两周后调查结果。结果显示与野生型植株相比较，myb21过表达纯合株的病斑长度显著增加。这表明myb21在水稻白叶枯病中发挥着调控作用。
[0006]
本发明的调控水稻白叶枯病抗性的基因myb21，其核苷酸序列如seq id no.1的 58-915位碱基所示。
[0007]
本发明的第二个目的是提供调控水稻白叶枯病抗性的蛋白，其氨基酸序列如seq idno.2所示。
[0008]
本发明的第三个目的是提供调控水稻白叶枯病抗性的基因myb21在水稻的基因遗传工程育种中的应用。
[0009]
本发明的第四个目的是提供调控水稻白叶枯病抗性的基因myb21在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。如敲除降低调控水稻白叶枯病抗性的基因myb21，使其表达量缺少或减少，从而提高水稻白叶枯病抗性。
[0010]
本发明有益效果如下
[0011]
1.本发明首次证明了水稻基因myb21是水稻白叶枯病的功能基因，该基因在感病材料中表达较高，而在抗病材料中的表达较低。因此，myb21基因的克隆和生物学功能验证对于水稻白叶枯病抗性的分子机制研究有重要的参考意义。
[0012]
2.本发明提供了利用ubiquitin启动子过表达myb21基因的水稻转化载体。该载体转化水稻后能大幅提高myb21的表达量。过量表达myb21的转基因材料病斑长度增加。因此，本发明通过ubiquitin启动子过表达myb21的技术可以应用于水稻的基因遗传工程育种，并能够应用于生产实践中，调控水稻的白叶枯病抗性，从而保障目前水稻病害频发的气候条件下的水稻生产安全。
附图说明：
[0013]
图1：a.320份水稻种质白叶枯病全基因组关联的曼哈顿图；b.qq plot图；c.qbbr11-4在 11号染色体上的具体位置；
[0014]
图2是过量表达载体pox的载体图谱；
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图3：a.myb21基因在抗病材料和感病材料接种白叶枯病菌后的表达；b.myb21基因在抗病和感病材料中的本底表达(未接种白叶枯病菌)；p91品种名称为“八十日”，p172为“飞来占”，p241为“早禾糯”，3个品种接种白叶枯病iv型菌后感病9级，(病斑长度/叶片长度)*100％＝100％；；l52为“七澳占1”，抗病3级，(病斑长度/叶片长度)*100％＝10.7％； l55为“矮黑糯”，抗病1级，(病斑长度/叶片长度)*100％＝3.9％；p76为“苏占”，抗病3级， (病斑长度/叶片长度)*100％＝7.2％；
[0016]
图4是转基因植株中myb21表达水平；
[0017]
图5：a是过量表达myb21使水稻植株叶片的病斑长度显著增加，b中的两颗星表示与对照(野生日本晴)相比存在极显著差异。
具体实施方式：
[0018]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0019]
实施例1：
[0020]
1.myb21基因的克隆及过表达载体的构建
[0021]
取模式水稻材料日本晴或感病材料p91(品种名称为“八十日”，接种白叶枯病iv型菌后感病9级，(病斑长度/叶片长度)*100％＝100％；)孕穗期的叶片，用trizol reagent提取叶片总rna，采用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总rna的纯度及量，取1μg的总rna做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为primescript，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物：f，atcggcaatttcattcggta； r，ctgccttccttgatgtctctcta，进行pcr扩增，pcr所用的聚合酶为kod fx (toyobo公司)。反应体系为50ul，按照kod fx的说明书配制pcr反应体系。反应条件为：94℃5min；94℃30sec，57℃30sec，68℃80sec，35个循环；68℃10min。pcr扩增获得约858bp的片段。采用pcr产物直接纯化的方法回收该片段后，用hind iii和bamh i对pcr产物片段和过量表达载体pox(主要是将pcambia1300的camv35s启动子更换为 ubiquitin启动子，具体载体图如图2所示)分别进行双酶切，酶切后分别回收目标片段和载体片段，用t4连接酶(neb公司)16℃连接过夜。取全部连接产物，用电击法转化到大肠杆菌dh5α中，转化产物涂布卡那霉素抗性的lb固体培养基。37℃培养过夜，挑6个单克隆进行提取质粒，酶切鉴定，选择两个阳性克隆(即myb21基因过量表达载体)进行测序，测序分析发现，该序列全长975个碱基，其序列如seq id no.1所示，包含1个开放阅读框，即seq id no.1的58-915位碱基，编码蛋白具有285个氨基酸残基，其序列如 seq id no.2所示。
[0022]
2、水稻品种p91、p172、p241、l52、l55、p76的叶片自然生长至孕穗期进行接种(以未接种白叶枯病iv型菌的水稻品种p91、p172、p241、l52、l55、p76作为本底对照)，采用的白叶枯病菌株为白叶枯病iv型菌。用剪刀在白叶枯病iv型菌菌液 (3
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cfu/ml)中蘸取菌液，剪去叶尖2～3cm，蘸1次剪1片叶，每个株系剪50 片叶以上，然后在接种后0、12、24、48小时取叶片进行荧光定量pcr，检测目标基因myb21的表达量。
[0023]
荧光定量pcr鉴定myb21基因在植株中表达量的程序如下：取植株孕穗期(或接种后0、12、24、48h后)的叶片进行总rna提取，采用的试剂为trizol reagent，根据该试剂的说明书的步骤进行，并用甲醛变性凝胶电泳和紫外分光光度计检测总 rna的纯度及量，取1μg的总rna做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为 primescript(takara公司)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物为模板，采用引物11g45740-f和11g45740-r引物对检测myb21基因的表达情况；采用水稻管家基因ef1α基因的表达作为内参，检测引物为ef1α-f和ef1α-r引物对。
[0024]
11g45740-f，ctccgagcatggtgactagc；
[0025]
11g45740-r，cttgcacccaaccgttaagc；
[0026]
ef1α-f，tttcactcttggtgtgaagcagat；
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ef1α-r，gacttccttcacgatttcatcgtaa。
[0028]
结果证明，myb21基因在接种后表达上调；未接种时，myb21基因在感病材料中表达较高，而在抗病材料中的表达较低(图3)。
[0029]
3.采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法分别将myb21基因过量表达载体转入日本晴和感病材料p91中。转化原代(t0代)通过pcr及定量pcr检测，从dna水平和rna水平鉴定阳性转化植株。阳性植株自交得到转基因1代(t1代)株系，每个株系选择5株经pcr检测为阳性的植株繁种，得到t2代植株，t2代株系再进行pcr检测，找到来源于不同t0代植株的t2代纯合株系各2个，即日本晴myb21过量表达株系2个和感病材料p91 myb21过量表达株系2个。
[0030]
取4个株系的孕穗期的叶片进行荧光定量pcr，检测目标基因myb21的表达量，以野生型结果为对照，检测方法参考步骤2。结果如图4所示，4个过量表达的转基因株系相对于野生型(nip)，myb21的表达量都大幅度提高20-35倍(图4)。
[0031]
4.myb21转基因植株白叶枯病抗性鉴定
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把上述纯合的4个过量表达转基因t
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代株系(日本晴myb21过量表达株系2个和感病材料p91 myb21过量表达株系2个)和野生型日本晴种子在32℃发芽，2天后将幼芽分别移至装有泥土的塑料盘中播种，待其长到3叶期时将幼苗移栽到水泥池中，每个株系至少种24株。自然生长至孕穗期进行接种。采用的白叶枯病菌株为白叶枯病iv型菌。用剪刀在白叶枯病iv型菌菌液(3
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cfu/ml)中蘸取菌液，剪去叶尖2～3cm，蘸1次剪1片叶，每个株系剪50片叶以上，两周后调查病斑长度。结果表明，myb21基因过量表达株叶片的病斑长度显著增加(图5)。

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