PR3、MPO、GBM融合蛋白及其构建方法、应用与流程

pr3、mpo、gbm融合蛋白及其构建方法、应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及pr3、mpo、gbm融合蛋白及其构建方法、应用。


背景技术：

[0002]
anca(抗中性粒细胞胞浆抗体)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分作为靶抗原的抗体，会引发原发性系统性血管炎，又称anca相关血管炎，此病主要累及中小血管。韦格纳氏肉芽肿、急性进行性肾小球肾炎、多动脉炎、溃疡性结肠炎和原发性硬化性胆管炎等原发性系统性小血管炎的发病与anca密切相关，同时对anca的检测也可大大提高肾血管炎的早期诊断率。抗pr3(蛋白酶3)抗体、抗mpo(髓过氧化物酶)抗体和抗gbm(肾小球基底膜)抗体的检测已成为高敏感性、高特异性的血清学检测项目。
[0003]
pr3(蛋白酶3)是中性粒细胞胞浆嗜天青颗粒中的一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为29kda。pr3能降解多种细胞外基质如弹性蛋白、血红蛋白、iv型胶原等。此外，pr3能够通过组织蛋白酶g促进血小板活化，并使c1抑制剂失活。
[0004]
mpo(髓过氧化物酶)是粒细胞分化过程中合成的一种血红素蛋白，是中性粒细胞的主要组成成分。mpo作为单链前体产生，随后被切割成轻链和重链。成熟mpo是由2条轻链和2条重链组成的四聚体。这种酶能产生对中性粒细胞的杀微生物活性至关重要的低盐酸。
[0005]
gbm(肾小球基底膜)是肾脏肾小球的基底膜层。gbm是血管内皮细胞及足细胞基底层的结合，主要由-型胶原、层粘连蛋白、内联蛋白和渗滤素组成。
[0006]
目前anca三项的抗原均为单一抗原，在体外诊断试剂研发过程中无法实现同时检测，检测灵敏度和特异性较差，导致试剂成本过高、检测过程繁琐、患者疾病漏检错检、竞争力缺乏等不足。


技术实现要素：

[0007]
本发明目的在于提供pr3、mpo、gbm融合蛋白，该融合蛋白能提高检测试剂盒的灵敏度和特异性，以减少漏检和错检。
[0008]
此外，本发明还提供上述pr3、mpo、gbm融合蛋白的构建方法、应用。
[0009]
本发明通过下述技术方案实现：
[0010]
pr3、mpo、gbm融合蛋白，pr3、mpo、gbm融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0011]
pr3、mpo、gbm融合蛋白能够用于anca三项抗体的同时检测，有助于提高检测试剂盒的灵敏度和准确度。
[0012]
pr3、mpo、gbm融合蛋白包括依次连接的pr3蛋白区段、mpo蛋白区段和gbm蛋白区段，pr3蛋白区段具有如seq id no.1所示的核苷酸序列表达，mpo蛋白区段具有如seq id no.2所示的核苷酸序列表达，gbm蛋白区段具有如seq id no.3所示的核苷酸序列表达。
[0013]
一种编码pr3、mpo、gbm融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.5所
示。
[0014]
pr3、mpo、gbm融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：
[0015]
s1、重组全基因合成序列：依次连接pr3、mpo、gbm蛋白区段的核苷酸序列获得目的基因；
[0016]
s2、构建重组质粒：将步骤s1中获得的重组全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；
[0017]
s3、一次转染：将步骤s2中的重组质粒转染宿主细胞，获得重组杆粒；
[0018]
s4、二次转染：将步骤s3中的重组杆粒再次转染宿主细胞，获得第一代的杆状病毒；
[0019]
s5、表达：将步骤s4中的第一代的杆状病毒进行表达；
[0020]
s6、获得融合蛋白：将步骤s5中表达得到的细胞培养物进行筛选、纯化，获得融合蛋白。
[0021]
优选地，所述步骤s1重组全基因合成序列过程中包含一个单位的pr3蛋白区段的核苷酸序列、一个单位的mpo蛋白区段的核苷酸序列和一个单位的gbm蛋白区段的核苷酸序列。
[0022]
优选地，所述步骤s1中重组全基因合成序列中还包括柔性肽基因序列、真核kozak序列、蜂毒信号肽序列和his标签序列。
[0023]
优选地，所述步骤s1重组全基因合成序列中，真核kozak序列、蜂毒信号肽序列、pr3蛋白区段的核苷酸序列、柔性肽基因序列、mpo蛋白区段的核苷酸序列、柔性肽基因序列、gbm蛋白区段的核苷酸序列和标签序列依次相连。
[0024]
优选地，所述步骤s2构建重组质粒中的表达载体包括昆虫细胞表达载体和/或杆状病毒表达载体。
[0025]
优选地，所述步骤s3一次转染时的宿主细胞包括大肠杆菌宿主和/或动物性细胞宿主。
[0026]
pr3、mpo、gbm融合蛋白在试剂盒、疫苗或诊断抗原中的应用。
[0027]
本发明的融合蛋白，是通过在融合蛋白基因序列c端加入his标签序列后构建至pfastbac1质粒载体中，然后制备一种含有pr3、mpo、gbm基因序列的重组质粒；重组质粒转化大肠杆菌dh10 bac，获得重组杆粒；将重组杆粒转染昆虫细胞后分泌表达而得的融合蛋白；his标签序列纯化获得anca三项融合蛋白。
[0028]
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
[0029]
1、本发明只需要一次表达就能制备得到一种pr3、mpo、gbm三种蛋白的融合蛋白，表达过程简单，降低成本与时间。
[0030]
2、使用本发明所述pr3、mpo、gbm融合蛋白制备检测试剂盒能提高检测试剂盒的灵敏度、正确性和特异性，减少漏检和错检。
[0031]
3、用本发明所述pr3、mpo、gbm融合蛋白制备检测试剂盒能够降低反复检测成本，有利于病人节省成本。
附图说明
[0032]
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部
分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
[0033]
图1为实施例1中融合蛋白表达载体的多克隆位点示意图；
[0034]
图2为阳性克隆菌落测序结果与目标序列对比结果。
[0035]
图3为纯化蛋白鉴定结果图。
具体实施方式
[0036]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
[0037]
实施例1：
[0038]
融合基因(目的基因)的全基因序列的合成：
[0039]
s1、依次连接pr3、mpo、gbm蛋白区段的核苷酸序列，根据genbank所公开的序列信息，在连接两个基因片段之间去掉终止密码子和起始密码子，并加入5个氨基酸残基(ggggs)的柔性肽基因序列(linker序列)；在n端加入蜂毒信号肽序列，c端加入6*his标签序列；在序列上游加入限制性核酸内切酶位点bamh i，在其下游则加入ecor i酶切位点,全基因合成。全基因合成时各序列之间的排列顺序为：真核kozak-信号肽-pr3-linker-mpo-linker-gbm-6*his，目的基因(融合基因)的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0040]
如图1所示，多克隆位点，是载体上含有的一个人工合成的dna片段，其上含有多个单一酶切位点，是外源dna的插入部位，具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点。
[0041]
实施例2：
[0042]
含有融合基因的重组质粒构建：
[0043]
2.1将实施例1中获得的全基因序列和质粒载体pfastbac 1进行bamh i、ecor i双酶切，试剂盒回收酶切产物，将酶切产物通过t4连接酶连接。
[0044]
2.2连接产物(重组质粒)转化感受态大肠杆菌dh5α，体积不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟；将管放入42℃水浴，定时60秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒；每管加入400μl lb培养基,37℃缓摇60分钟，低速离心2分钟，去上清，留约100μl培养基在离心管内，重悬菌体，用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀。
[0045]
2.3将平板倒置于37℃恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行测序鉴定，结果如图2，发现除了两端测序在开始出现正常误差外，融合蛋白测序结果与目标完全一致。
[0046]
实施例3：
[0047]
融合蛋白的表达
[0048]
3.1将实施例2中获得的重组质粒转化至大肠杆菌dh10 bac感受态细胞，体积不超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴30分钟。
[0049]
3.2将管放入42℃水浴，定时90秒热休克，快速将管转移到冰浴120秒；每管加入800μl lb培养基，37℃，缓摇4小时，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；用玻璃铺菌器将30μl菌液在抗性kan+gent+tet琼脂板上铺匀；将平板倒置于37℃恒温培养箱中，30-48小时后可出现蓝白斑菌落。
[0050]
3.3挑取阳性白斑单菌落接入5ml抗性lb，缓摇12-16h，取菌液进行pcr鉴定，结果显示杆粒重组基因正确。将重组杆粒经转染试剂转染昆虫细胞，3-5天后收取细胞上清液作为第一代杆状病毒。用第一代杆状病毒感染昆虫细胞48-96小时后，获得第二代病毒，用于融合蛋白的表达。pr3、mpo、gbm融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。
[0051]
3.4第二代病毒以moi值为10感染密度为2
×
10
6
/ml的昆虫细胞sf9，继续培养72小时后，收集细胞培养物。
[0052]
实施例4：
[0053]
融合蛋白纯化
[0054]
4.1取实施例3中的细胞培养物在5000g离心力下离心20分钟收集细胞培养上清；同时取未转染重组杆粒的细胞培养物，进行相同的操作作为空白对照。
[0055]
4.2细胞培养上清与1ml用平衡缓冲液平衡好的ni-nta resin孵育过夜，次日，弃上清，加入适量平衡缓冲液重悬填料，将填料转移到自流柱里。
[0056]
4.3依次用冲洗缓冲液1(50mm tris-hcl ph8.0；500mm nacl)洗10个柱体积；冲洗缓冲液2(50mm tris-hcl ph8.0；500mm nacl；20mm咪唑)洗10个柱体积；冲洗缓冲液3(50mm tris-hcl ph8.0；500mm nacl；250mm咪唑)洗5个柱体积。
[0057]
4.4洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，1
×
pbs透析纯化后目的蛋白保存在-80℃。
[0058]
4.5sds-page电泳检测表达蛋白纯度及浓度，如图3所示，m:protein marker，从上至下分别为110kda、80kda、60kda、50kda、40kda和35kda；1：细胞培养上清，除了各种杂蛋白之外，在57kda处出现了大量的目标蛋白；2-3：空白对照，只出现了杂蛋白，未产生目标蛋白；4：纯化后目的蛋白，大小为57kda。
[0059]
实施例5：
[0060]
pr3、mpo和gbm融合蛋白在诊断anca相关血管炎方面的应用
[0061]
使用pr3、mpo和gbm融合蛋白作为抗原检测受试者anca三项自身抗体的磁微粒化学发光法：
[0062]
采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清、血浆和全血样本中anca的浓度。
[0063]
将r1、待测样本、m磁微粒以及r2混合孵育5min；样本中anca的不同位点分别与磁珠上的anca抗体和碱性磷酸酶标记anca结合，形成固相抗体-抗原-抗体夹心复合物，通过洗涤，未被结合的酶标抗体以及其它物质被去除。加入化学发光底物3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)，发光底物在碱性磷酸酶的催化下发射出光子，所产生的光子数与样本中抗原浓度成正比。
[0064][0065]
检验方法如下：
[0066]
5.1首次启用新试剂盒前，将其小心颠倒多次，确保磁珠混匀，不要倒转已打开的试剂盒。
[0067]
5.2校准品/质控品检测前均需平衡至室温。
[0068]
5.3将试剂瓶放入仪器试剂仓，仪器扫描试剂瓶的条形码或手工输入条形码信息。
[0069]
5.4校准品置于仪器样本仓。通过仪器扫描校准品二维码，启动校准程序，仪器将自动完成校准。
[0070]
5.5质控品/待检样本置于仪器样本仓，按仪器操作指南设定质控品/待检样本信息后，启动运行程序，仪器自动完成测定。
[0071]
5.6试验结果的计算
[0072]
仪器根据待检样本的测定rlu，通过工作曲线计算浓度。
[0073]
5.7结果判定：浓度大于或等于20.0ru/ml可判定为阳性,且值越大阳性越强。
[0074]
实验结果见表1和2。表1是阴性样本的结果，其中阴性样本是健康者血清。表2是阳性样本的结果，其中阳性样本是经确诊为原发性系统性血管炎患者的血清。
[0075]
表1阴性样本的结果
[0076][0077]
表2阳性样本的结果
[0078][0079]
由实验结果可见，利用本发明的pr3、mpo和gbm融合蛋白做抗原，能够区分阴性样品和不同程度的阳性样品，可以分辨原发性系统性血管炎的患者。
[0080]
实施例6：
[0081]
临床检测应用
[0082]
采用实施例5的方法分别检测原发性系统性血管炎患者、非原发性系统性血管炎患者、其他疾病患者及正常人血清。对于30例临床原发性系统性血管炎患者，10例结节性动脉炎患者，10例其他疾病患者，以及40例正常人血清的检测结果见表3。
[0083]
同时采用pr3、mpo和gbm作为对照。
[0084]
表3本发明融合蛋白与pr3、mpo和gbm对受试者检测结果的比较
[0085][0086][0087]
结果显示，采用本发明融合蛋白对于原发性系统性血管炎患者的检出率为96.67％，对于非原发性系统性血管炎患者、其他疾病患者及正常人血清的检出率均为0.00％。结果表明，本发明融合蛋白对原发性系统性血管炎检测的敏感性有显著提高，特异性也很好。
[0088]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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