副干酪乳杆菌及副干酪乳杆菌用于制备去除醣化终产物的组合物的用途的制作方法

[0001]
本发明涉及一种副干酪乳杆菌，特别是关于一种副干酪乳杆菌tci708 (lactobacillus paracaseitci708)及其用于制备去除醣化终产物的组合物的用途。


背景技术：

[0002]
醣化终产物(advanced glycation end products,ages)是糖与蛋白质相互聚合并经过不可逆反应后产生的不可还原的物质。
[0003]
研究发现醣化终产物会改变及影响蛋白质的正常功能。举例来说，醣化终产物会与其他蛋白质连成大分子，从而降低蛋白质被代谢的机会。此外，醣化终产物也会使dna产生移位现象，造成dna损伤，从而影响dna正常功能。
[0004]
醣化终产物除了于人体内自行生成外，亦充斥于日常饮食中。除了影响肌肤外，醣化终产物会通过肠道吸收而影响人体全身器官。并且，在病理学及流行病学的研究亦指出醣化终产物可影响人体内的任何组织和器官。
[0005]
研究发现，肌肤的胶原网络被醣化终产物破坏，从而导致肌肤老化现象发生(如皱纹、松弛、暗沉、干燥)。并且，醣化终产物更与白内障、动脉硬化、骨质疏松等疾病相关。
[0006]
此外，醣化终产物更与代谢症候群相关。动物实验发现小鼠在高剂量醣化终产物下的高脂饮食6周后，体重会比一般高脂饮食组体重增加比例高出 19％。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明提供一种副干酪乳杆菌及其用于制备去除醣化终产物 (advanced glycation end products,ages)的组合物的用途。
[0008]
在一些实施例中，一种副干酪乳杆菌tci708(lactobacillus paracaseitci708)，且此副干酪乳杆菌tci708保藏于dsmz德国微生物保藏中心 (german collection of microorganisms and cell cultures，dsmz)(保藏号为：dsm33482)。
[0009]
在一些实施例中，一种副干酪乳杆菌tci708(lactobacillus paracaseitci708)用于制备去除醣化终产物的组合物的用途，其中副干酪乳杆菌 tci708保藏于德国国家菌种保藏中心(保藏号为：dsm33482)。
[0010]
综上所述，任一实施例的副干酪乳杆菌tci708是保藏于dsmz德国微生物保藏中心(保藏号为：dsm33482)。并且，副干酪乳杆菌tci708具有耐胃酸胆盐的功能。因此，副干酪乳杆菌tci708于胃模拟环境的存活率为95％，且于肠道模拟环境的存活率为99％。在一些实施例中，副干酪乳杆菌tci708可用以去除醣化终产物。因此，在一些实施例中，副干酪乳杆菌tci708可用于制备去除醣化终产物的组合物，且组合物为医药组合物或食品组合物。
附图说明
[0011]
图1是副干酪乳杆菌tci708于肠胃模拟环境中的存活力实验的结果图；
(16srdna)进行序列比对后可知，此分离菌株的16srdna序列与副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)相似性在98.49％至98.86％(如表1所示)。因此，将此分离菌株命名为副干酪乳杆菌tci708。
[0033]
表1
[0034]
副干酪乳酸菌亚种相似度lactobacillus paracasei amvdudb598.86％lactobacillus paracasei strain lp0298.59％lactobacillus paracasei strain nj98.49％lactobacillus paracasei strain hbuas5428798.49％lactobacillus paracasei strain srcm10329998.49％lactobacillus paracasei strain hbuas5333298.49％
[0035]
实验二：耐胃酸胆盐试验
[0036]
为进一步确认副干酪乳杆菌tci70的于生物体消化道的酸碱耐受性，将副干酪乳杆菌tci708以人工胃液(ph 3)及人工肠液(ph 7)进行测试。实验组为人工胃液实验组及人工肠液实验组，其中人工胃液为0.2摩尔浓度(m)氯化钾(kcl,型号sigma-aldrich p9333)且ph值为3。人工肠液为0.2m氯化钾(kcl，型号sigma-aldrich p9333)及0.3重量％的牛胆盐(购自difco
tm
oxgall，型号212820)且ph值为7。并且，以氯化钾缓冲液作为控制组，其中氯化钾缓冲液为0.2m氯化钾(kcl，型号sigma
-ꢀ
aldrich p9333)且ph值为7。
[0037]
首先，将副干酪乳杆菌tci708冻菌取相对于培养基10体积％的菌量培养于乳酸菌mrs培养基(bd difco
tm
lactobacilli mrs broth，型号 df0881-17-5)中，并于37℃下培养16小时，以活化副干酪乳杆菌 tci708。接着，取相对于待测溶液1体积％的活化后的副干酪乳杆菌 tci708菌液分别接种至20毫升的三组待测溶液中，其中三组待测溶液分别为人工胃液、人工肠液及氯化钾缓冲液，且人工胃液、人工肠液为二组实验组，而氯化钾缓冲液则为控制组。接着，以转速50rpm于37℃下将实验组及控制组震荡培养3小时。将培养后的三组菌液取100微升(μl)的菌液涂盘，并于37℃下静置培养3天，并于3天后计数三组的活菌数。
[0038]
请参阅图1。附图中副干酪乳杆菌tci708的存活力为计数后的活菌数，并以log cfu/ml表示。其中，log cfu/ml代表每毫升菌液含有的菌落形成单位(cfu，colony-forming unit)并以对数(log)表示。由图1可知，控制组的副干酪乳杆菌tci708的存活力为7.85log cfu/ml(附图数值四舍五入)、人工胃液实验组的副干酪乳杆菌tci708的存活力为7.48logcfu/ml(附图数值四舍五入)，以及人工肠液实验组的副干酪乳杆菌 tci708的存活力为7.81log cfu/ml(附图数值四舍五入)。
[0039]
由此可知，人工胃液实验组的活菌数相对于控制组为95％，且人工肠液实验组的活菌数相对于控制组为99％。换言之，副干酪乳杆菌tci708可于胃模拟环境(ph值3-4)存活且存活率为95％。副干酪乳杆菌tci708亦可于肠道模拟环境(ph值7)存活且存活率为99％。因此，副干酪乳杆菌 tci708具有耐胃酸胆盐的功能。
[0040]
实验三：去除醣化终产物试验
[0041]
将副干酪乳杆菌tci708与其他乳酸菌属菌株一并进行去除醣化终产物试验，从而测试副干酪乳杆菌tci708的去除醣化终产物的能力。实验三测试的乳酸菌属菌株为自行分离并筛选如表2所示，其中表2的编号代表图2 中各乳酸菌属菌株。
[0042]
表2
[0043][0044][0045]
于此，表2的10株乳酸菌属菌株是各别分离自人体肠道、玉山土、能高瀑布、无花果、牛粪或香菇的各分离株。将各分离株分别以乳酸菌的16s 核醣体基因(16srdna)及酵母菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, its)基因进行菌种鉴定是通过ncbi确定各分离株的菌种。
[0046]
由鉴定结果可知，来自玉山土的二分离株分别为副干酪乳杆菌 (lactobacillus paracasei，编号：tci708)及胚芽乳杆菌(lactobacillusplantarum，编号：l805)、来自人体肠道的二分离株分别为嗜酸性乳酸杆菌(lactobacillus acidophilus，编号：l800)及洛德乳酸杆菌(lactobacillusreuteri，编号：l802)、来自能高瀑布的分离株为乳酸乳球菌 (lactococcuslactis，编号：l807)、来自无花果的分离株为副干酪乳杆菌 (lactobacillus paracasei，编号：l1044)、来自母乳的二分离株为卷曲乳酸杆菌(lactobacillus crispatus，编号：l1228、l1231)、来自牛粪的分离株为酵素乳酸杆菌(lactobacillus fermentum，编号：l1265)，以及来自香菇的分离株为清酒乳酸杆菌(lactobacillus sakei，编号：l1391)。其中， tci708的鉴定报告如实验一所述。其中l1044的16s核醣体基因 (16srdna)序列(即seqid no:2)，以ncbi网站进行分析，可知其 16srdna序列与其他副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)亚种的相似性为98.96％。
[0047]
将表2的各乳酸菌属的菌株冻菌分别取相对于培养基10体积％于乳酸菌mrs培养基(bd difco
tm
lactobacilli mrs broth，型号df0881-17-5) 中并于37℃下培养16小时以活化各乳酸菌属的菌株。
[0048]
分别取0.4毫升的将胶原蛋白溶液(collagen溶液)及果糖溶液 (fructose溶液)混合均匀并置于50℃反应24小时以产生醣化终产物，其中collagen溶液是以200mm磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer,ph7.4)配置含有0.06％迭氮化钠(nan
3
)且胶原蛋白浓度为每1毫升胶原蛋白溶液中含有60毫克(即60mg/ml)的胶原蛋白而成的collagen溶液，而fructose溶液是以200mm磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer,ph7.4)配置
果糖浓度为1.5m果糖(d-fructose)的fructose溶液。
[0049]
并且，调整活化后的各乳酸菌属菌株的菌液中含有的菌量为吸光值 (od600)为1后，再加入相对于各组菌液1体积％的上述醣化终产物以作为各乳酸菌属菌株的实验组。相对于各乳酸菌属菌株的实验组，于相同菌量 (od600＝1)的各乳酸菌属菌株的菌液中加入1％乳酸菌mrs培养基以作为对应于各实验组的控制组。
[0050]
接着，将各实验组及各控制组于37℃下培养16小时，接着以转速 13000rpm离心1分钟，以分离各实验组及各控制组的菌体及上清液。接着，各组取0.1毫升的上清液至96孔黑盘中，以激发光360nm及放射光 460nm下测定各组萤光值。并依照下列公式换算醣化终产物去除率(ages 去除率)。
[0051]
公式：ages去除率＝(1-实验组萤光值/对应的控制组萤光值)x100％
[0052]
请参阅图2。相对于其他乳酸菌属菌株，副干酪乳杆菌tci708的醣化终产物去除率为14％，高于胚芽乳酸菌l805(lactobacillus plantaruml805)及卷曲乳杆菌l1228(lactobacillus crispatus)的醣化终产物去除率。其中，胚芽乳酸菌l805的醣化终产物去除率为3％，而卷曲乳杆菌 l1228的醣化终产物去除率为5％。
[0053]
除了上述三株菌株(即图2编号tci708、l805、l1228)，其余乳酸菌属菌株的醣化终产物去除率为0％。换言之，除了副干酪乳杆菌tci708、胚芽乳酸菌l805及卷曲乳杆菌l1228，表2中的其他乳酸杆菌属菌株并无去除醣化终产物的能力。
[0054]
此外，同样作为副干酪乳杆菌菌株的副干酪乳杆菌l1044 (lactobacillus paracasei l1044)的醣化终产物去除率为0％。换言之，副干酪乳杆菌l1044不具有去除醣化终产物的能力。
[0055]
由此可知，副干酪乳杆菌tci708相对于同样为副干酪乳杆菌菌种的副干酪乳杆菌l1044具有去除醣化终产物的能力，具有与习知菌株(如副干酪乳杆菌l1044)不同的微生物性质。
[0056]
实验四：人体试验
[0057]
为进一步确认副干酪乳杆菌tci708对于人体的影响。以每颗胶囊含有 5x10
9
cfu(即5x10
9
cfu/cap)副干酪乳杆菌tci708的活菌胶囊提供给受试者每日服用一颗(50毫克/日，指每日服用一颗重量为50毫克的胶囊)，并服用4周。并于服用前及服用4周后进行血液中醣化终产物浓度(委托立人检验所检测)、肌肤明亮度、肌肤松弛程度、皱纹等测试项目。
[0058]
受试者有7位，且为年龄为20-55岁的女性及男性。并且，每位受试者均喜爱吃高油脂、甜食和烧烤食物等高含量醣化终产物的食物。
[0059]
测试结果以第0周及第4周的数值一起比较。第0周为测试前量测的数值，代表受试者所有人均未服用含有副干酪乳杆菌tci708的活菌胶囊的生理状态。第4周为连续服用四周后量测的数值。
[0060]
(一)血液中醣化终产物浓度
[0061]
于第0周及第4周时以2号黄头管收集7位受试者的血液，并委托立人检验所鉴测血液中醣化终产物浓度，结果如图3所示。
[0062]
请参阅图3。7位受试者于第0周时平均的血液中醣化终产物浓度为 1.34单位/毫升(unit/ml)，且于第4周时平均的血液中醣化终产物浓度为 1.27单位/毫升。换言之，7位受试者血液中醣化终产物浓度下降0.07单位/ 毫升，相较于第0周时下降5％。
[0063]
由此可知，服用含有副干酪乳杆菌tci708的活菌胶囊有助于下降人体血液中的醣化终产物浓度。因此，副干酪乳杆菌tci708具有去除醣化终产物的能力。
[0064]
(二)肌肤状态
[0065]
于第0周及第4周时以肌肤分析仪器(combo skinanalyzer)检测受试者的肌肤状况(肌肤明亮度、肌肤松弛程度、皱纹等)，从而观察副干酪乳杆菌tci708对于肌肤的影响。
[0066]
请参阅图4。将7位受试者于第0周测试到的肌肤明亮度的平均数值视为100％，且7位受试者于第4周测试到的肌肤明亮度的平均数值相较于第 0周的数值为111.9％。换言之，在连续服用4周的含有副干酪乳杆菌 tci708的活菌胶囊后，7位受试者肌肤明亮度上升11.9％。
[0067]
请参阅图5。将7位受试者于第0周测试到的肌肤松弛度的平均数值视为100％，且7位受试者于第4周测试到的肌肤松弛度的平均数值相较于第0周的数值为88.7％。换言之，在连续服用4周的含有副干酪乳杆菌tci708 的活菌胶囊后，7位受试者的肌肤松弛度下降11.3％。
[0068]
请参阅图6。将7位受试者于第0周测试到的皱纹的平均数值视为 100％，且7位受试者于第4周测试到的皱纹的平均数值相较于第0周的数值为95.1％。换言之，在连续服用4周的含有副干酪乳杆菌tci708的活菌胶囊后，7位受试者的皱纹下降4.9％。
[0069]
请参阅图7及图8。在第0周时，受试者眼下的皱纹wk-0较深且多，如图7所示。在第4周时，受试者眼下的皱纹wk-4较浅且稀疏，如图8所示。于此，相较于第0周时的皱纹状态，在连续服用4周的含有副干酪乳杆菌tci708的活菌胶囊后，受试者的皱纹减少。由此可知，副干酪乳杆菌 tci708具有改善皱纹的能力。
[0070]
于此，通过实验二可知，副干酪乳杆菌tci708可适应于人体肠胃环境。通过实验三可知，副干酪乳杆菌tci708具有去除醣化终产物的能力。并且，通过实验四可知，在服用副干酪乳杆菌tci708后，可有效降低人体内醣化终产物的累积，从而改善受体肌肤状态，如提高肌肤明亮度、减少肌肤松弛度及/或改善皱纹。
[0071]
综上所述，根据本发明任一实施例的副干酪乳杆菌tci708，其可制备去除醣化终产物的组合物。并且，副干酪乳杆菌tci708具有耐胃酸胆盐的功能，可生存于肠胃道环境。由于副干酪乳杆菌tci708可用以去除醣化终产物，其有效降低人体内累积的醣化终产物，从而改善人体肌肤状态(如，肌肤明亮度、肌肤松弛度及皱纹)。
[0072]
虽然本发明以前述的实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习相像技术者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与润饰，因此本发明的专利保护范围须视本说明书所附的权利要求书所界定者为准。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除