铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶及其制备方法与应用与流程

nh
2
)与聚乙二醇二缩水甘油醚上的环氧醚反应形成交联网络结构，此结构中溶解的丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯反应又形成另一交联结构，两者形成互穿网络结构，使得水凝胶具有良好的力学性能。负载有hkust-1nps功能化水凝胶具有缓慢可控地释放铜离子，清除伤口创面的活性氧，保护伤口免受外界损伤的能力，促进伤口愈合。因此，可被用作伤口的医用敷料。
[0007]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008]
铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：将羧甲基壳聚糖(cmcs)溶解后加入混合溶解在去离子水中的还原型谷胱甘肽(gsh)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，搅拌均匀后，在室温下，用稀盐酸调节反应混合物ph值为4.0～5.8；在25～35℃匀速搅拌反应2～4小时；然后将产物置于透析袋中，用去离子水浸泡，消除未反应的试剂；最后，将所得混合物溶液冻干，谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)；
[0010]
2)铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)和乙酸铜一水合物分别溶于混合溶剂后再混合，室温下搅拌下反应，形成凝胶状深绿松石悬浮液；离心悬浮液分离颗粒，使用无水乙醇和去离子水洗涤以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜；将得到的固体干燥，充分研磨至粉末，制得铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)；所述的混合溶剂由水、无水乙醇和dmf混合组成；
[0011]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：将铜金属有机骨架纳米粒子与去离子水混合；然后加入谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖、丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二缩水甘油醚和引发剂，在25～35℃水浴中搅拌均匀，充n
2
鼓泡，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入孔板中并密封，然后置于65～70℃的水浴中反应5～6小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，将冻干的水凝胶密封置于冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶。
[0012]
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的还原型谷胱甘肽和n-羟基琥珀酰亚胺物质的摩尔比为10～15：1；所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1～1.2：1；羧甲基壳聚糖与还原型谷胱甘肽的质量比1.78～100：1。
[0013]
优选地，步骤1)中，所述的用去离子水浸泡的时间为3～7天；所述的羧甲基壳聚糖的浓度为0.15～0.18g/ml；所述的混合溶解的时间为25～30min；所述的稀盐酸的浓高度为0.1～0.5mol/ml；所述的透析袋的截留值为12～14kda。
[0014]
优选地，步骤1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在去离子水中后加入，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为0.5～1mmol/ml；所述的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖的接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为50～500。
[0015]
优选地，步骤2)中，所述的1,3,5-苯三甲酸与乙酸铜一水合物的摩尔比为2～2.5：3；所述的水、无水乙醇和dmf的体积比为1：1：1；所述的室温下搅拌下反应的时间为20～30min；所述的干燥为-50～80℃条件下冷冻干燥。
[0016]
优选地，步骤2)中，所述的洗涤的无水乙醇和去离子水的体积比为1～1.5：1；所述的洗涤要求重复洗涤3次以上。
[0017]
优选地，步骤3)中，所述的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖和丙烯酰胺的质量比为质量比3：2～2.5；所述的聚乙二醇二缩水甘油醚的质量为谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖的1～2％；所述的聚乙二醇二丙烯酸酯的质量为丙烯酰胺的质量的1～2％；所述的引发剂的质量为丙烯酰胺的质量的0.15～0.30％；所述的引发剂为k
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。
[0018]
优选地，步骤3)中，每ml去离子水中加入所述的铜金属有机骨架纳米粒子400～600μg。
[0019]
一种铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶，由上述制备方法制得；所述的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶在120min内清除80～85％的abts自由基，60min内清除68～72％的羟基自由基，20min内清除70～75％的超氧自由基；所述的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝溶胀率为37～39.4，12h时水保留率大于11％；所述的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率达到98％以上。
[0020]
所述的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶在伤口愈合药物中的应用。
[0021]
本发明还原型谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖，赋予功能化水凝胶抗氧化性能，可以清除慢性伤口的活性氧ros。本发明将还原型谷胱甘肽引入水凝胶分子链上，水凝胶具有良好的抗氧化性，具有清除自由基(即abts自由基、羟基自由基(
·
oh)和超氧自由基(
·
o
2-))的能力；本发明将铜离子以hkust-1nps的形式负载于功能化水凝胶中，降低铜离子的细胞毒性，水凝胶对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌均表现出明显的抗菌作用；本发明羧甲基壳聚糖上的氨基(-nh
2
)与聚乙二醇二缩水甘油醚上的环氧醚反应形成一交联网络结构，此结构中溶解的丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯反应又形成另一交联结构，两者形成互穿网络结构，赋予功能化水凝胶具有良好的机械性能。本发明功能化水凝胶中cmcs-gsh中cmcs的分子链中存在大量的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)以及羧酸根(-coo-)可以水分子形成氢键，可以将大量水分子“固定”在水凝胶的三维网络结构中，难以溢出；gsh接枝在cmcs上和hkust-1nps负载入交联网络可以撑开水凝胶交联网络，可以释放cmcs分子链上的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)，从而增加了与水分子的结合，赋予功能化水凝胶良好的吸水性能和水保持性能。本发明功能化水凝胶具有良好的吸水性能和水保持性能，使得功能化水凝胶始终能保持伤口创面无积液且湿润的3d微环境，可以使细胞活动更加激烈，促进伤口愈合。
[0022]
针对慢性伤口三个特点(即
①
高浓度活性氧ros；
②
有大量渗出液；
③
大量细菌等病原微生物滋生)，铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶具有良好的清除活性能、抗菌性能、吸水和保留水性能的协同作用更有利于加速慢性伤口的愈合；羧甲基壳聚糖上的氨基(-nh
2
)与聚乙二醇二缩水甘油醚上的环氧醚反应形成交联网络结构，此结构中溶解的丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯反应又形成另一交联结构，两者形成互穿网络结构，使得水凝胶具有良好的力学性能。负载有hkust-1nps功能化水凝胶具有缓慢可控地释放铜离子，清除伤口创面的活性氧，始终能保持伤口创面无积液且湿润的3d微环境，且能保护伤口免受外界损伤的能力，促进伤口愈合。因此，可被用作伤口的医用敷料，具有重要意义。
[0023]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0024]
(1)抗氧化剂水凝胶已被用于修复几种受伤的组织。例如，基于碳水化合物支链淀粉、丝蛋白和阿魏酸的仿生抗氧化剂水凝胶被用作皮肤再生敷料，以保护间充质干细胞或皮肤成纤维细胞在体外和高氧化应激环境下免受氧化损伤。壳聚糖(cs)及其衍生物由于其
丰富的游离羟基和氨基可以与超氧化物自由基结合，可以作为天然抗氧化剂。据报道，基于壳聚糖的水凝胶可以通过清除ros增强缺血心脏和急性受伤的肾脏中的干细胞移植，存活和归巢。谷胱甘肽(gsh)是由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸形成的一种小三肽，在促进细胞粘附方面具有特定的肽配体作用。此外，它是体内清除ros的主要屏障，可以通过保护细胞中的巯基氧化还原电位免受氧化应激的影响来保护细胞。然而，由于低热稳定性，gsh作为低分子量抗氧化剂之一，效果较差。为了克服该限制，本发明通过酰胺共价键将gsh连接羧甲基壳聚糖基质上，从而增强其稳定性和理化性质。通过将谷胱甘肽接枝到羧甲基壳聚糖分子链上，使得功能化水凝胶具有良好的抗氧化性，降低慢性伤口上ros的浓度，促进伤口愈合。
[0025]
(2)铜离子是一种众所周知的抗菌剂，对多种细菌(例如病毒，真菌和革兰氏细菌)的广泛抗菌活性而具有优异的抗菌活性。它可以通过减少伤口感染的可能性来促进愈合。另外它参与许多与伤口愈合相关的过程，包括诱导血管内皮生长因子，血管生成，以及细胞外皮肤蛋白(例如角蛋白和胶原蛋白)的表达和稳定。硫酸铜和氧化铜已显示出可促进健康和糖尿病小鼠的愈合，但必须多次应用，使患者处于铜毒性的风险中。升高的非生理浓度的铜离子会产生毒性，因为铜离子会干扰其他金属的稳态，破坏dna，并产生可对蛋白质，脂质和核酸的活性氧。金属有机骨架(mof)，也称为多孔配位聚合物，是一类由无机金属离子或通过多齿有机配体连接的簇组成的结晶多孔材料。mof通常用于气体吸附和分离，催化，质子传导，其性质可能对生物医学应用有用。尽管mof在生物医学应用中可能引起人们的兴趣，但mof在含有生理蛋白的溶液中往往不稳定。因此可以利用将mofs负载入水凝胶中作为一种缓解其降解从而防止铜离子过早释放的策略，使得铜基mofs应用到促进伤口愈合中。hkust-1nps由于其合成简单且配体1,3,5-苯三甲酸的毒性低，可以作为理想的铜基mof。本发明通过溶液法制备大小结构不均一的铜基mof(hkust-1)，然后将其负载入壳聚糖基抗氧化水凝胶中，缓解其降解从而防止铜离子过早释放，实现可控缓慢释放。
[0026]
(3)根据湿性愈合理论，湿润环境下伤口愈合速度比暴露于空气中干燥创面要快一倍。湿润的环境为新生细胞提供类似生理的微环境(利于细胞的增殖和分化)，有利于肉芽的生长，便于皮肤细胞的分裂；而慢性伤口会渗出大量液体，液体内含有丰富的糖类和蛋白类物质，会造成细菌感染；因此临床医学上要求医用敷料不仅要吸收过量的渗出液也需要保持湿润的伤口愈合微环境，促进伤口愈合。功能化水凝胶中cmcs-gsh中cmcs的分子链中存在大量的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)以及羧酸根(-coo-)可以水分子形成氢键，可以将大量水分子“固定”在水凝胶的三维网络结构中，难以溢出；gsh接枝在cmcs上和hkust-1nps负载入交联网络可以撑开水凝胶交联网络，可以释放cmcs分子链上的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)，从而增加了与水分子的结合。功能化水凝胶具有良好的吸水性能和水保持性能，使得功能化水凝胶始终能保持伤口创面无积液且湿润的3d微环境，可以使细胞活动更加激烈，促进伤口愈合。
[0027]
(4)水凝胶敷料具备与伤口创面贴敷良好、优异地吸收伤口渗出液性、可负载各种促进伤口愈合的药物等优点。其主要缺点是机械性能相对较差。本专利利用羧甲基壳聚糖上的氨基(-nh
2
)与聚乙二醇二缩水甘油醚上的环氧醚反应形成一交联网络结构，此结构中溶解的丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯反应又形成另一交联结构，两者形成互穿网络结构，使得水凝胶具有良好的力学性能。良好的机械性能可以避免伤口再次受到损伤。
附图说明
[0028]
图1为实施例1、2、3、4和5中制备的具有不同gsh接枝率的功能化水凝胶对abts自由基的清除率图。
[0029]
图2为实施例1、2、3、4和5中制备的具有不同gsh接枝率的功能化水凝胶对羟基自由基的清除率图。
[0030]
图3为实施例1、2、3、4和5中制备的具有不同gsh接枝率的功能化水凝胶对超氧自由基的清除率图。
[0031]
图4为实施例1、2、3、4和5中制备的不同配比的功能化水凝胶的吸水性能图。
[0032]
图5为实施例1、2、3、4和5中制备的不同配比的功能化水凝胶的保水性能图。
[0033]
图6为实施例1、2、3、4和5中制备的负载不同浓度的hkust-1np的功能化水凝胶的抗菌性柱状图。
[0034]
图7为实施例1、2、3、4和5中制备的负载不同浓度的hkust-1np的功能化水凝胶的抗菌性琼脂糖凝胶板图。
[0035]
图8为实施例1、2、3、4和5中制备的负载不同浓度的hkust-1np的功能化水凝胶对金黄葡萄球菌(s.aureus)和大肠杆菌(e.coli)的pi染色后的流式细胞术分析图。
[0036]
图9为实施例1制备的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶的伤口愈合图。
[0037]
图10为实施例1制备的铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶的伤口愈合h&e染色图。
具体实施方式
[0038]
为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例所用的试剂均为从市场购得。
[0039]
实施例1
[0040]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：在装有磁力搅拌子的200ml圆底烧瓶中，用30ml去离子水溶解0.5g羧甲基壳聚糖(cmcs)制成均相溶液；将0g还原型谷胱甘肽(gsh)和0.0006g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在10ml去离子水中，以250rpm转速均匀搅拌30min，将gsh和nhs的混合溶液加入到烧瓶中；将0.048g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解在10ml去离子水中，搅拌均匀后，将其加入烧瓶中；在室温下，用0.5mol/ml的hcl溶液调节烧瓶中的反应混合物至ph 4.0～5.8，以300rpm转速均匀搅拌下反应6小时；然后将产物置于透析袋中(分子量截断值：8～12kd)，用去离子水浸泡3天(每天换去离子水两次)，以消除未反应的试剂；最后，将混合物溶液在-80℃下冻干，获得接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为0mol/g的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)。
[0041]
2)铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶于10ml水、无水乙醇和dmf组成的混合溶剂中(每份混合溶剂中，水、无水乙醇、dmf的体积比为1：1：1)；将所得的两种溶液在烧杯中混合，在25℃下以300rpm转速搅拌约30min以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤，重复洗涤三次以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜，得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，最终制得铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)。
[0042]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：在装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入10ml去离子水和500μg的hkust-1nps搅拌均匀；将0.60g cmcs-gsh、0.40g丙烯酰胺、150μl聚乙醇二丙烯酸酯、100μl聚乙二醇二缩水甘油醚和0.00060g引发剂k
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依次加入圆底烧瓶中，在65℃水浴中以250rpm转速均匀搅拌30min，充n
2
鼓泡30min，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入直径为10mm的孔板中并密封，然后置于65℃水浴中反应6小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗三次，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，最后，将冻干的水凝胶密封置于4℃冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶(hydrogel-0)。
[0043]
实施例2
[0044]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：在装有磁力搅拌子的200ml圆底烧瓶中，用30ml去离子水溶解0.5g羧甲基壳聚糖(cmcs)制成均相溶液；将0.10g还原型谷胱甘肽(gsh)和0.011g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在10ml去离子水中，以250rpm转速均匀搅拌30min，将gsh和nhs的混合溶液加入到烧瓶中；将0.096g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解在10ml去离子水中，搅拌均匀后，将其加入烧瓶中；在室温下，用0.6mol/ml的hcl溶液调节烧瓶中的反应混合物至ph 4.0～5.8，以300rpm转速均匀搅拌下反应4小时；然后将产物置于透析袋中(分子量截断值：8-12kd)，用去离子水浸泡3天(每天换去离子水两次)，以消除未反应的试剂；最后，将混合物溶液在-80℃下冻干，获得接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为56.85mol/g的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)。铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将0.45g(2.15mmol)1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)溶于10ml水、无水乙醇和dmf的混合溶剂中(其中，水、无水乙醇、dmf的体积比为1.2：1：1)，将0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物溶于10ml相同的混合溶剂中；将两种溶液在烧杯中混合，在30℃下以300rpm转速搅拌约30min以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤，重复洗涤三次以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，最终制得铜金属有机骨架纳米粒子(h kust-1nps)。
[0045]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：在装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入10ml去离子水和500μg的hkust-1nps搅拌均匀；将0.60g cmcs-gsh、0.25g丙烯酰胺、100μl聚乙二醇二丙烯酸酯、100μl聚乙二醇二缩水甘油醚和0.00060g引发剂k
2
s
2
o
8
依次加入烧瓶中，在60℃水浴中以250rpm转速均匀搅拌30min，充n
2
鼓泡30min，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入直径为10mm的孔板中并密封，然后置于65℃水浴中反应4小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗三次，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，最后，将冻干的水凝胶密封置于4℃冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶(hydrogel-1)。
[0046]
实施例3
[0047]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：在装有磁力搅拌子的200ml圆底烧瓶中，用30ml去离子水溶解0.5g羧甲基壳聚糖(cmcs)制成均相溶液；将0.19g还原型谷胱甘肽(gsh)和0.011g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在10ml去离子水中，以250rpm转速均匀搅拌30min，将gsh和nhs的混合溶液加入到烧瓶中；将0.096g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解在10ml去离子水中，搅拌均匀后，将其加入烧瓶中；在室温下，
用0.5mol/ml的hcl溶液调节烧瓶中的反应混合物至ph 4.0～5.8，以300rpm转速均匀搅拌下反应5小时；然后将产物置于透析袋中(分子量截断值：8-12kd)，用去离子水浸泡3天(每天换去离子水两次)，以消除未反应的试剂；最后，将混合物溶液在-80℃下冻干，获得接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为194.03mol/g的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)。
[0048]
2)铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将0.46g(2.2mmol)1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)溶于10ml水、无水乙醇和dmf的混合溶剂中(其中，水、无水乙醇、dmf的体积比为1.15：1：1)，将0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物溶于10ml相同的混合溶剂中；将两种溶液在烧杯中混合，在30℃下以300rpm转速搅拌约25min以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤，重复洗涤三次以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，最终制得铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)。
[0049]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：在装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入10ml去离子水和500μg的hkust-1nps搅拌均匀；将0.50g cmcs-gsh、0.50g丙烯酰胺、150μl聚乙二醇二丙烯酸酯、100μl聚乙二醇二缩水甘油醚和0.00075g引发剂k
2
s
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o
8
依次加入烧瓶中，在65℃水浴中以250rpm转速均匀搅拌30min，充n
2
鼓泡30min，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入直径为10mm的孔板中并密封，然后置于65℃水浴中反应7小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗三次，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，最后，将冻干的水凝胶密封置于4℃冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶(hydrogel-2)。
[0050]
实施例4
[0051]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：在装有磁力搅拌子的200ml圆底烧瓶中，用30ml去离子水溶解0.5g羧甲基壳聚糖(cmcs)制成均相溶液；将0.23g还原型谷胱甘肽(gsh)和0.011g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在10ml去离子水中，以250rpm转速均匀搅拌25min，将gsh和nhs的混合溶液加入到烧瓶中；将0.096g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解在10ml去离子水中，搅拌均匀后，将其加入烧瓶中；在室温下，用0.5mol/ml的hcl溶液调节烧瓶中的反应混合物至ph 4.0～5.8，以300rpm转速均匀搅拌下反应6小时；然后将产物置于透析袋中(分子量截断值：8-12kd)，用去离子水浸泡3天(每天换去离子水两次)，以消除未反应的试剂；最后，将混合物溶液在-80℃下冻干，获得接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为286.67mol/g的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)。
[0052]
2)铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将0.47g(2.25mmol)1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)溶于10ml水、无水乙醇和dmf的混合溶剂中(其中，水、无水乙醇、dmf的体积比为1.25：1：1)，将0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物溶于10ml相同的混合溶剂中；将两种溶液在烧杯中混合，在室温下以300rpm转速搅拌约30min以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤，重复洗涤三次以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，最终制得铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)。
[0053]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：在装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入10ml去离子水和500μg的hkust-1nps搅拌均匀；将0.40g cmcs-gsh、0.60g丙烯酰胺、150μl聚乙二醇二丙烯酸酯、100μl聚乙二醇二缩水甘油醚和0.00090g引发剂k
2
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依次加
入烧瓶中，在70℃水浴中以250rpm转速均匀搅拌30min，充n
2
鼓泡30min，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入直径为10mm的孔板中并密封，然后置于65℃水浴中反应7小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗三次，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，最后，将冻干的水凝胶密封置于4℃冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶(hydrogel-3)。
[0054]
实施例5
[0055]
1)谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)的制备：在装有磁力搅拌子的200ml圆底烧瓶中，用30ml去离子水溶解0.5g羧甲基壳聚糖(cmcs)制成均相溶液；将0.28g还原型谷胱甘肽(gsh)和0.011g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在10ml去离子水中，以250rpm转速均匀搅拌35min，将gsh和nhs的混合溶液加入到烧瓶中；将0.096g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶解在10ml去离子水中，搅拌均匀后，将其加入烧瓶中；在室温下，用0.5mol/ml的hcl溶液调节烧瓶中的反应混合物至ph 4.0～5.8，以300rpm转速均匀搅拌下反应6小时；然后将产物置于透析袋中(分子量截断值：8-12kd)，用去离子水浸泡3天(每天换去离子水两次)，以消除未反应的试剂；最后，将混合物溶液在-80℃下冻干，获得接枝度(gd＝gsh/cmcs-gsh(mol/g))为431.83mol/g的谷胱甘肽改性羧甲基壳聚糖(cmcs-gsh)。
[0056]
2)铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的制备：将0.525g(2.5mmol)1,3,5-苯三甲酸(h
3
btc)溶于10ml水、无水乙醇和dmf的混合溶剂中(其中，水、无水乙醇、dmf的体积比为1：1.25：1)，将0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物溶于10ml相同的混合溶剂中；将两种溶液在烧杯中混合，在35℃下以300rpm转速搅拌约35min以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤，重复洗涤三次以除去残留的1,3,5-苯三羧酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，最终制得铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)。
[0057]
3)铜金属有机骨架功能化水凝胶的制备：在装有磁力搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入10ml去离子水和1000μg的hkust-1nps搅拌均匀；将0.50g cmcs-gsh、0.50g丙烯酰胺、150μl聚乙二醇二丙烯酸酯、100μl聚乙二醇二缩水甘油醚和0.00075g引发剂k
2
s
2
o
8
依次加入烧瓶中，在65℃水浴中以250rpm转速均匀搅拌30min，充n
2
鼓泡30min，除去体系中氧气；将混合溶液迅速倒入直径为10mm的孔板中并密封，然后置于65℃水浴中反应6小时；反应结束取出水凝胶，用去离子水反复冲洗三次，去除水凝胶表面未反应的液体，冷冻干燥，最后，将冻干的水凝胶密封置于4℃冰箱保存，制得含铜金属有机骨架功能化水凝胶(hydrogel-4)。
[0058]
通过体外抗氧化实验，研究了不同接枝度的铜金属有机骨架功能化水凝胶清除氧自由基(即abts自由基、羟基自由基(
·
oh)和超氧自由基(-o
2-))的能力。其中hydrogel-0为实施例1制备；hydrogel-1为实施例2制备；hydrogel-2为实施例3制备；hydrogel-3为实施例4制备和hydrogel-4为实施例5制备，且分别代表ds(gsh/cmcs-gsh)为0μmol/g、56.85μmol/g、194.03μmol/g、289.63μmol/g、431.83μmol/g。
[0059]
(1)abts自由基清除能力测定。
[0060]
分别取5ml的7.4mmol/l 2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)和88μl的2.6mmol/l过硫酸钠(na
2
s
2
o
8
)两种溶液混合均匀，并在室温下于黑暗中放置16h。然后将该2mg水凝胶置于工作溶液中，并在37℃下孵育。在每个时间点取样abts溶液，用mq水1：1
稀释，并用紫外分光光度计在734nm处测量吸光度。所有测量均重复三次。通过测量与对照溶液相比的吸光度降低，将抗自由基活性测量为自由基抑制百分比。abts自由基清除可使用以下公式计算：
[0061]
清除率(％)＝[a
0-a
i
/a
0
]
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1-1)
[0062]
式中：a
0
为不加样品时abts的吸光度；
[0063]
a
i
为加入样品时abts的吸光度。
[0064]
如图1显示不同ghs接枝度功能化水凝胶对abts自由基清除能力。随着接枝度的增加，对abts自由基能力明显提高，其中hydrogel-3和hydrogel-4分别在120min内清除了73％和85％的abts自由基，表现出良好的自由基清除能力。
[0065]
(2)羟基自由基(
·
oh)的清除能力测定
[0066]
利用fenton反应产生羟自由基：h
2
o
2
+fe
2+
＝
·
oh+h
2
o+fe
3+
，在反应体系中加入水杨酸，fenton反应产生羟自由基与水杨酸反应，生成于510nm处有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸。
[0067]
取3支25ml的比色管(样品管、空白管、样品本底管)，依次加入5ml浓度为1mmol feso
4
，空白管和样品管中加入5ml浓度为3mmol/l的h
2
o
2
溶液，本底管中的h
2
o
2
溶液用蒸馏水代替。本底管和样品管分别加入直径为10mm厚为1mm的样品，空白管中加入1ml蒸馏水，混合均匀后用3mmol/l水杨酸溶液定容至刻度，在37℃的恒温水中反应15min后用紫外分光光度计在510nm的波长下测定吸光度。羟基自由基清除可使用以下公式计算：
[0068]
清除率(％)＝[(a
0-(a
i-a
1
))/a
0
]
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2-4)
[0069]
式中：a
0
为不加样品的吸光度
[0070]
a
i
为加入样品的吸光度
[0071]
a
1
为本底的吸光度
[0072]
图2显示不同ghs接枝度功能化水凝胶对对羟基自由基(
·
oh)的清除能力。hydrogel-2、hydrogel-3和hydrogel-4分别在60min内清除了62％、69％和72％的羟基自由基清除能力。其中未接枝谷胱甘肽的水凝胶在60min内清除了17％的羟基自由基。
[0073]
(3)超氧自由基(
·
o
2-)清除能力测定
[0074]
将直径为10mm厚为1mm的不同接枝率的水凝胶与12ml三氯化叔丁基盐酸(50mm，ph＝8.1)(1ml去离子水作为对照)，然后2ml邻苯三酚(3mm)混合。将其在黑暗中加入混合物中5分钟。最后将5ml hcl(0.8m)加入混合物中以终止反应。用紫外分光光度计在299nm处测量吸光度。超氧自由基清除可使用以下公式计算：
[0075]
清除率(％)＝[(a
0-ai)-a
0
]
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2-5)
[0076]
式中：a
0
为不加样品的吸光度
[0077]
a
i
为加入样品的吸光度
[0078]
图3显示不同ghs接枝度功能化水凝胶对超氧自由基(-o
2-)的清除能力。hydrogel-2、hydrogel-3和hydrogel-4分别在20min内清除了45％、55％和70％的超氧自由基清除能力。其中未接枝谷胱甘肽的水凝胶在20min内清除了20％的羟基自由基，表现出良好的自由基清除能力。原因是cmcs由于其丰富的游离羟基和氨基可以与超氧化物自由基结合，可以作为天然抗氧化剂。
[0079]
为了验证铜金属有机骨架功能化水凝胶的溶胀和保水性能，分别进行了溶胀性能
表征和保水性能表征。
[0080]
(1)溶胀性能表征：采用重量法测定了四种水凝胶的膨胀比，具体方法为：将样品切成直径为10mm，厚度为5mm的圆柱形，放在在冻干机中冻干后，称重，然后将样品加入37℃的磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中，并在不同时间取出水凝胶吸水后的质量。记录后并重新放回原蒸馏水中，如此反复，直至达到溶胀平衡。同一样品测试了三遍。使用一下公式计算溶胀率。
[0081]
溶胀率(％)＝[(w
b-w
a
)/w
a
]
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2-1)
[0082]
式中：w
a
—溶胀前水凝胶的质量，g
[0083]
w
b
—不同时间点水凝胶的质量，g
[0084]
保水性能表征：将在磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中达到溶胀平衡的样品在37℃下孵育，在不同时间称取水凝胶后的质量。同一样品测试了三遍。使用一下公式计算保留率。
[0085]
保留率(％)＝[(w
c-w
d
)/w
d
]
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2-2)
[0086]
式中：w
c
—不同时间点水凝胶的质量，g
[0087]
w
d
—溶胀前水凝胶的质量，g
[0088]
图4为4种不同质量比的功能化水凝胶在去离子水中吸水的溶胀对比数据。图4中显示hydrogel-1、hydrogel-2、hydrogel-3、hydrogel-4四种水凝胶在6h和12h分别为27.2和34.5、23.4和28.5、18.6和24.3、17.0和22.8，表现出快速吸水性能。水凝胶敷料快速吸水性能，可以快速吸收伤口渗出液避免其在伤口创面的积累。图4显示四种壳聚糖基抗氧化水凝胶在去离子水中的溶胀率分别是39.4、34.3、31.5、28.7；随着cmcs-gsh/am质量比的增加，水凝胶的溶胀率逐渐降低。上述结果表明四种水凝胶均表现出良好的溶胀性能和保持水分的能力。图5显示了4种壳聚糖基抗氧化水凝胶的水保留特性。hydrogel-1、hydrogel-2、hydrogel-3、hydrogel-4四种水凝胶随着cmcs-gsh/am质量比的增加，水凝胶的水保留率逐渐降低，在12h后对pbs的保留率>4％。表明它们能在较长时间保持湿润的伤口创面愈合微环境，促进伤口愈合，适合作为医用敷料。出现这种现象的原因是cmcs-gsh中cmcs的分子链中存在大量的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)以及羧酸根(-coo-)可以水分子形成氢键，可以将大量水分子“固定”在水凝胶的三维网络结构中，难以溢出；gsh接枝在cmcs上可以撑开cmcs分子链内和链间距离，可以释放cmcs分子链上的羟基(-oh)和氨基(-nh
2
)，从而增加了与水分子的结合；am含量增加导致am和聚乙二醇二丙烯酸酯的交联网络密度增加，水凝胶的三维网络结构的孔径减小，使得被“固定”的水分减少。
[0089]
为了探究负载hkust-1的水凝胶的抗菌效果，本发明研究了不同hkust-1含量的水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌效率。即采用载药水凝胶的浸泡液与细菌孵育2小后，涂板并计算s.aureus和e.coli的存活率。如图6所示，随着水凝胶内负载hkust-1浓度的增加，s.aureus和e.coli的存活率均逐渐降低。hkust-1浓度为31.2、125、500、1000μg/ml下，s.aureus的存活率分别为78.5％、17.4％、13.7％、0％，e.coli的存活率分别为88.3％、27.6％、17.3％、1.8％。其中hkust-1浓度浓度为500μg/ml时，超过80％的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被杀死；hkust-1浓度浓度为1000μg/ml时，几乎100％的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被杀死。图7和图8是与之对应的s.aureus和e.coli的琼脂糖凝胶板和pi染色后的流式细胞术分析图片，结果与图6保持一致。综上结果可知，随着铜基mof功能化水凝胶内负载hkust-1浓度的增加，材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抗菌性能；
hkust-1被负载到水凝胶内部可以有效避免其结构破环，让铜离子缓慢可控的释放。
[0090]
应用实施例
[0091]
体内伤口愈合：经华南农业大学动物伦理委员会批准进行动物实验。实验动物使用20只雄性spf级sd大鼠(4周龄，广东省动物实验中心提供)，重约80-100g，分为四组，每组5只大鼠。用5％水合氯醛(400mg/kg)经腹腔注射麻醉后，背部剃毛并用脱毛膏将其背部的毛发完全去除。用医用酒精棉签消毒后，使用医用打孔器在大鼠背部脊椎左侧造成一个直径为10mm的圆形伤口。然后分别将灭菌后的pbs缓冲溶液、500μg/ml的hkust-1(由实施例1制备)、hydrogel(由实施例2制备hydrogel-1，未负载hkust-1的功能化水凝胶)、负载有500μg/ml的hkust-1的水凝胶(hydrogel+hkust-1)(由实施例5制备的hydrogel-5)敷在各组大鼠伤口上。其中，注射伤口滴加灭菌的pbs溶液作为空白对照组。并用医用胶带和纱布固定水凝胶，以免动物互咬伤口或活动时撕扯伤口。然后放入笼中饲养每隔一天来观察伤口愈合情况，伤口愈合情况如图9所示。用imagine j计算伤口像素区域。用下式计算伤口闭合：
[0092]
伤口愈合率％＝[1-s
n
/s
0
]
×
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(3-1)
[0093]
式中：s
0
为初试伤口面积，cm
2
[0094]
s
n
为n天后伤口面积，cm
2
[0095]
为了进一步研究各个材料对sd大鼠伤口愈合的治疗效果，分别在第3、7和11天处死大鼠，剪去伤口横切面并用4％甲醛溶液固定，此后将伤口横截面包埋在石蜡中并切成5μm的切片。进行苏木精和曙红(h&e)染色，并在光学显微镜yuyhr上观察切片，如图10所示。
[0096]
如图9所示，观察分别将pbs、500μg/ml hkust-1、hydrogel和hydrogel+hkust-1覆盖在伤口创面上观察伤口在1、3、5、7和11天后的愈合的宏观照片，以评估伤口在每个时间点的愈合情况。在第1天，所有伤口均显现出炎症，其中，经pbs处理的伤口出现轻微的水肿；hydrogel+hkust-1处理的伤口创面保持湿润且炎症较轻。在第3天，经pbs、hkust-1、hydrogel和hydrogel+hkust-1的伤口创面愈合率分别为18％、27％、21％和46％。其中，经pbs和hydrogel处理的创面仍存在炎症和细菌感染；hkust-1处理的创面炎症较轻，但创面结痂；hydrogel+hkust-1处理的创面表面红润，长出新生肉芽组织。第5天，经pbs、hkust-1、hydrogel和hydrogel+hkust-1的伤口创面愈合率分别为35％、58％、47％、81％。pbs处理的创面炎症减轻，伤口结痂；hydrogel+hkust-1处理的创面愈合较明显，上皮开始形成。第7天，经pbs、hkust-1、hydrogel和hydrogel+hkust-1的伤口创面愈合率分别为74％、83％、81％和98％。其中，hydrogel+hkust-1处理的创面几乎全部愈合。第9天，经pbs、hkust-1、hydrogel和hydrogel+hkust-1的伤口创面与愈合率分别为96％、98％、97％和100％。pbs、hkust-1、hydrogel处理的创面基本愈合，仍存在创面结痂；hydrogel+hkust-1处理的创面上皮完全重新形成。在整个愈合过程中，相比较它们处理的创面的伤口收缩百分比和平均愈合时间，hydrogel+hkust-1处理的创面始终保持红润，不存在严重的炎症和细菌感染，促进伤口愈合的程度更高。这种特性可能是由于铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶具有出色的抗菌和抗氧化性特性，无毒，良好的溶胀和保水能力。
[0097]
为了评估不同时间点用不同材料处理伤口的组织学结果，在伤口愈合的第3、7和11天对伤口横切面进行h&e染色。如图10所示，在第3天，pbs和hydrogel处理的伤口中出现较多嗜中性粒细胞，这表明伤口部位出现了细菌感染；hydrogel+hkust-1处理伤口中嗜中性粒细胞的数量正常，并且大多数细胞均正常，这表明hydrogel+hkust-1具有有效的抗菌
性能。在第7天，hydrogel+hkust-1处理的伤口中出现了一些成纤维细胞和胶原纤维，形成部分表皮和真皮，并且观察到一些微血管，这表明hydrogel+hkust-1具有更高的支持伤口愈合的能力；经pbs和hydrogel处理的伤口上仍有大量炎性细胞残留，而经hkust-1处理的伤口上炎性细胞较少。此外，表皮和真皮开始在hkust-1组中形成。第11天，hydrogel+hkust-1处理的伤口组织已经完全恢复正常。从而表明铜金属有机骨架纳米粒子功能化水凝胶对伤口愈合过程产生了积极影响。
[0098]
本发明将还原型谷胱甘肽引入水凝胶分子链上，水凝胶具有良好的抗氧化性，具有清除自由基(即abts自由基、羟基自由基(
·
oh)和超氧自由基(
·
o
2-))的能力；将铜离子以铜金属有机骨架纳米粒子(hkust-1nps)的形式负载于功能化水凝胶中，降低铜离子的细胞毒性，水凝胶对革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)细菌均表现出明显的抗菌作用；功能化水凝胶具有良好的吸水性能和水保持性能，使得功能化水凝胶始终能保持伤口创面无积液且湿润的3d微环境，可以使细胞活动更加激烈，促进伤口愈合。
[0099]
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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