一种专一性催化CDCA及其缀合物的酶及其应用的制作方法

一种专一性催化cdca及其缀合物的酶及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种专一性催化cdca及其缀合物的酶及其在总cdca检测中的应用。


背景技术：

[0002]
羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(hydroxysteroid dehydrogenase，hsdh)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。早有文献指出7α-hsdhs能够催化胆酸(ca)或鹅去氧胆酸(cdca)及其牛磺酸或甘氨酸缀合物——牛磺胆酸(tca)，牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)，甘氨胆酸(gca)和甘氨鹅脱氧胆酸(gcdca)c-7位的α-位羟基脱羟基反应形成酮基。
[0003]
hsdh的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道hsdh还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。hsdh所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大的应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-hsdh在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，genbank序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中登记的功能已经确认的7α-hsdh共有8个，它们分别来自于bacteroides fragilis、clostridium scindens、clostridium sordellii、clostridium absonum、stenotrophomonas maltophilia、eubacterium sp.vpi 12708、clostridium difficile和escherichia coli；来自c.absonum，collinsella aerofacien，ruminococcus gnavus和r.torques的7β-hsdh基因也已经成功被克隆。
[0004]
目前临床上主要通过循环酶法生化自动分析仪检测血清中的总胆汁酸来诊断疾病。其反应原理是利用3α-hsdh和硫代氧化型辅酶(thio-nad)特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原型辅酶-(nadh)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(nad)，每一次循环比原来的反应提高一倍灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的硫代还原型辅酶-(thio-nadh)，通过测定生成的thio-nadh的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。但由于很多疾病都能引起总胆汁酸的变化，其诊断的特异性较低。总胆汁酸中的不同胆汁酸具有相同的母核，结构相似，但是与各种肝胆类疾病的相关性存在差异。
[0005]
胆汁酸与肝胆疾病存在密切关系，胆管癌是胆管上皮细胞恶性肿瘤约占肝胆系统肿瘤的10％～15％，胆管癌早期诊断、鉴别诊断、术前定性诊断相当困难，胆管癌确诊时往往处于中晚期。利用lc-ms/ms进行定量分析gca平均组成比为35.6％，作为阳性标志物；tcdca平均组成比(13.8％)比其他患者显著降低，作为阴性标志物，其可以将胆管癌患者(cca)、良性胆道疾病患者(bbd)、胰腺癌患者(pc)区分开来。张超峰也进一步证实了结合胆汁酸gca、gcdca、gdca可以刺激胆管癌细胞的增殖，游离胆汁酸ca、cdca、dca可以促进癌细胞的凋亡，结合胆汁酸的增加及游离胆汁酸的降低可能是促进胆管癌形成的原因。同样利
用hplc测定牛磺结合型胆汁酸含量发现妊娠期肝内胆汁淤积患者(icp)、icp伴糖尿病、icp伴病毒性肝炎患者血清中tca、tcdca、tdca分别比正常孕妇高10倍、5倍、3倍以上(p<0.01)。肝细胞癌(hcc)是第五大常见癌症，甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)可以作为肝细胞癌hcc诊断和预后的重要指标。ressom hw等基于代谢组学鉴定肝硬化患者中肝细胞癌的血清生物标志物，乙型肝炎患者血清与健康对照组比较gcdca上调，gca、tca、cdca和lpc下调，且据报道，gcdca是细胞凋亡的诱导因子。肝胆疾病早期诊断的胆汁酸标志物的确定，可以避免向癌症的转化，尽早采取治疗手段。代谢疾病主要包括肥胖症、2型糖尿病(t2dm)、血脂异常等，胆汁酸通过直接作用于肠道、肝脏和胰腺中的fxr和tgr5来调节葡萄糖稳态和脂质代谢。韩建华等发现单纯性肥胖患者以甘氨鹅去氧胆酸(gcdca)和牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)增高为主，其余各种胆汁酸亚组分的表达与正常者相同。yu h等人应用靶向代谢组学方法定量测量2型糖尿病(t2dm)患者中26种血清胆汁酸，t2dm的肥胖患者的cdca％显著高于非缓解组，cdca可作为t2dm和肥胖的新治疗靶标。carious b等发现胰岛素敏感性和血浆鹅去氧胆酸、胆酸、脱氧胆酸浓度呈正相关，葡萄糖注射率和血浆鹅去氧胆酸和胆酸浓度呈负相关。
[0006]
各类胆汁酸在体内引发不同的生理和病理反应之间的差异在很大程度上是未知和被忽略的，因为缺乏有效的分析方法来量化单个胆汁酸及已结合物的生理和病理反应，目前大多利用hplc、gc、gc-ms/ms将结构相似的胆汁酸区分开来，全面、准确地从不同的生物样品(如血清、尿液、唾液等)中监测各种胆汁酸含量变化与疾病的关系。基于各类胆汁酸与疾病的关系，我们对胆汁酸的检测方法进行了分析，认为目前胆汁酸的检测存在以下弊端：(1)胆汁酸检测试剂盒只能检测总胆汁酸的含量，其特异性较差，在肝癌检测中利用价值极小；(2)各种胆汁酸作为疾病的诊断标志，在诊断与胆汁酸相关肝胆疾病、代谢疾病中具有高灵敏性和较强的特异性，对疾病的诊断和预后具有指导意见，但是目前大多采用液相色谱连用质谱等，需要的仪器设备较为复杂，且价格昂贵，成本较高，无法广泛用于临床检测。因此，研究专一性催化特定胆汁酸及其缀合物的酶并将其应用于血清、胆汁中该特定胆汁酸的检测，对于疾病的预防、诊断和治疗具有重要意义。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种专一性催化cdca及其缀合物的酶，该酶具有底物选择性，可识别特定底物(cdca、tcdca、gcdca)，在胆汁酸类化合物检测中有巨大的应用价值。
[0008]
一方面，本发明提供一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no:2所示，是由氨基酸序列如seq id no:1所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的c-端截短8个氨基酸所得。
[0009]
编码所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因也属于本发明的保护范围。
[0010]
优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0011]
包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0012]
在本发明的一些实施例中，所述载体可以是克隆载体，包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因以及质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体基因的pgex-6p-2载体。
[0013]
在本发明的一些实施例中，所述重组菌可以是包含克隆载体的重组菌，例如
e.coli dh5α，通过培养细胞使细胞内的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体基因得到复制；也可以是包含表达载体的重组细胞，在适当的条件下培养该重组细胞，例如，加入适量的iptg，16℃诱导7α-羟基类固醇脱氢酶突变体蛋白的表达。
[0014]
本发明还提供所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：合成所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达并纯化。
[0015]
在本发明所述制备方法的优选实施例中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0016]
本发明还提供一种催化剂，其特征在于：其有效成分包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。所述催化剂可以单独使用，也可以与其它适合的催化剂同时使用。
[0017]
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于：包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂。
[0018]
在本发明所述试剂盒的优选实施例中，所述试剂盒包括试剂1、试剂2以及胆汁酸标准品(tcdca)；所述试剂1采用100mmol/l tris-hcl(ph 4-4.4)配制，含有0.9mmol/l thio-nadp
+
；所述试剂2采用500mmol/l tris-hcl(ph 9.2-9.5)配制，含有6mmol/l nadph和12.5ku/l本发明的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体；所述胆汁酸标准品(tcdca)采用ddh
2
o配制，浓度为50μmol/l。
[0019]
所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂或所述试剂盒在检测样品中总cdca含量中的应用也属于本发明的保护范围；其中，所述总cdca包括鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸。
[0020]
另一方面，本发明提供一种测定样品中总cdca含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0021]
(1)在检测管中加入thio-nadp
+
、待测样品、所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体、nadph，充分混匀后反应；在校准管中加入thio-nadp
+
、标准品、所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体、nadph，充分混匀后反应；
[0022]
(2)在405nm波长分别测定检测管和校准管中的反应物的吸光度变化率；
[0023]
(3)按照如下公式计算待测样品中总cdca的含量：待测样品中总cdca的浓度＝检测管的吸光度变化率/校准管的吸光度变化率
×
标准品的浓度；
[0024]
所述总cdca包括鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸；所述标准品为鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸或甘氨鹅去氧胆酸。
[0025]
在所述反应中，thio-nadp
+
及胆汁酸通过酶的循环反应，微量胆汁酸被扩增，在405nm波长测定每分钟thio-nadph吸光度的变化率(δa/min)，从而计算待测样品中总cdca的含量。所述待测样品为胆汁酸类化合物或含胆汁酸类化合物的组分，包括但不限于血清、胆汁和胆粉。所述总cdca的含量是指所述待测样品中鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸的含量之和。
[0026]
优选地，所述步骤(1)中，将thio-nadp
+
和待测样品加入检测管后或将thio-nadp
+
和标准品加入校准管后，37℃孵育300秒，再加入7α-羟基类固醇脱氢酶突变体和nadph；所述步骤(2)中，反应90s后测定405nm处吸光度a1，反应120秒后测定吸光度a2，计算反应物的吸光度变化率(δa/min)。
[0027]
为获得专一性催化特定胆汁酸及其缀合物的酶，本发明首先从一级结构至高级结构多角度多层系比较了野生型7α-hsdh s1-a-1酶蛋白(seq id no:1)与同源酶蛋白的异同，确定了其c-末端是影响7α-hsdh s1-a-1功能的重要结构域。因此，我们将野生型7α-hsdh s1-a-1基因序列的第778-801位碱基去除，也就是将野生型7α-hsdh s1-a-1c-端的丝氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸和精氨酸这8个氨基酸去除，得到7α-hsdh s1-a-1突变体，命名为s1-a-1c8突变体。该突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0028]
我们利用pcr技术克隆获得了s1-a-1c8突变体基因(seq id no:4)，通过构建突变体基因的gst融合表达载体并导入基因工程菌e.coli bl21中诱导表达，获得了s1-a-1c8突变体酶蛋白。测定相同底物浓度存在下酶的初始反应速度，结果表明，7α-hsdh s1-a-1的突变体s1-a-1c8在底物cdca和nadp
+
的存在下，酶活为21.6u/mg；在底物tcdca和nadp
+
的存在下，酶活为24.5u/mg；在底物gcdca和nadp
+
的存在下，酶活为11.8u/mg；在底物ca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg；在底物tca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg；在底物gca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg。表明该突变体酶相较于野生型酶对cdca、tcdca、gcdca具有催化选择性。将7α-hsdh s1-a-1突变体酶专一性催化cdca(鹅去氧胆酸)及其牛磺酸缀合物(tcdca)或甘氨酸缀合物(gcdca)的底物选择性应用于样品总cdca的检测，可准确检测血清、胆汁中的总cdca含量，测定结果与采用uplc-ms/ms方法的测定结果一致(参见实施例3)，对于肝胆疾病的诊断具有巨大的应用潜力。
附图说明
[0029]
图1.7α-hsdh转化cdca、tcdca、gcdca、ca、tca或gca的示意图；当底物为ca、tca或gca时，化学结构式中的r1为-oh；当底物为cdca、tcdca或gcdca时，化学结构式中的r1为-h；当底物为ca或cdca时，化学结构式中的r为当底物为gcdca或gca时，化学结构式中的r为当底物为tcdca或tca时，化学结构式中的r为
[0030]
图2.7α-羟基类固醇脱氢酶(s1-a-1)突变体s1-a-1c8的sds-page电泳图；其中，m为蛋白质分子量标准(marker)，从上到下分子量大小依次是120，100，70，50，40，30，25，14kda；s1-a-1c8表示突变体酶蛋白，分子量大小为27.98kda。
[0031]
图3.7α-羟基类固醇脱氢酶(s1-a-1)野生型的sds-page电泳图；其中，m为蛋白质分子量标准(marker)，从上到下分子量大小依次是120，100，70，50，40，30，25，14kda；s1-a-1表示野生型酶蛋白，分子量大小为28.93kda。
[0032]
图4.nadph的标准曲线；其中，横坐标为nadph溶液的浓度(mm)，纵坐标为每个浓度的nadph溶液在340nm处的光吸收值。
[0033]
图5.野生型7α-hsdh s1-a-1及其突变体的酶活测定结果；分别以cdca、tcdca、gcdca、ca、tca和gca为底物，其中s1-a-1代表野生型(灰柱)，s1-a-1c8代表突变体(黑柱)。
[0034]
图6.采用本发明的突变体s1-a-1c8测定样品中总cdca浓度的线性范围；其中，横坐标为405nm处吸光度的变化值(
△
a/min)，纵坐标为胆汁酸标准品(tcdca)的浓度(μmol/l)。
具体实施方式
[0035]
下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
[0036]
主要试剂
[0037]
prime star max premix(2
×
)，宝生物科技有限公司(大连)，货号：r045a；bamh i，宝生物科技有限公司(大连)，货号：1010s；xho i，宝生物科技有限公司(大连)，货号：1094s；t4 dna ligase，宝生物科技有限公司(大连)，货号：2011a；pgex-6p-2质粒为已知载体，购买自上海生工生物科技有限公司；trans5α感受态细胞，全式金生物技术有限公司，货号：cd201-01；e.coli bl21(de3)感受态细胞，全式金生物技术有限公司，货号：cd601；磷酸盐缓冲液(pbs)干粉，北京索莱宝科技有限公司，货号：p1010；glutathione sepharose4b，购买自ge healthcare，货号：10223836；prescission protease酶，购买自genscript公司，货号：z02799-100；bradford蛋白浓度测定试剂盒，购买自beyotime公司，货号：p0006；回收试剂盒cycle pure kit，omega bio-tek(中国代理商)，货号：d6493；质粒提取试剂盒plasmid mini kit i，omega bio-tek(中国代理商)，货号：d6943；nadph：cas号2646-71-1，购买自sigma-aldrich公司，货号：10621692001；nadp
+
：cas号53-59-8，购买自sigma-aldrich公司，货号：n5755；thio-nadp
+
：cas号19254-05-8，购买自creative enzymes公司，货号：nate-0697；cdca(鹅去氧胆酸)：cas号2646-38-0，购买自sigma-aldrich公司，货号：c8261；tcdca(牛磺鹅去氧胆酸)：cas号6009-98-9，购买自百灵威科技公司，货号：330776；gcdca(甘氨鹅去氧胆酸)：cas号16564-43-5，购买自麦克林试剂公司，货号：g835599；ca(胆酸)：cas号206986-87-0，购买自sigma-aldrich公司，货号：c1254；tca(牛磺胆酸)：cas号345909-26-4，购买自sigma-aldrich公司，货号：t4009；gca(甘氨胆酸)：cas号338950-81-5，购买自sigma-aldrich公司，货号：g7132。
[0038]
培养基
[0039]
每100ml lb培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，ph 7.4。配制方法：在950ml ddh
2
o中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用naoh调节ph为7.4，用ddh
2
o定容至1l。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
[0040]
缓冲液
[0041]
10mm pbs(ph 7.4)的配制方法：称取8g nacl、0.2g kcl、1.44g na
2
hpo
4
和0.24g kh
2
po
4
，溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可。121℃高压蒸气灭菌至少20分钟，保存于室温或4℃冰箱中备用。
[0042]
50mm tris-hcl(ph 8.0)的配制方法：取6.057g tris固体粉末溶于1l去离子水中，用盐酸调ph到8.0，室温放置备用。100mmol/l tris-hcl(ph 4～4.4)的配制方法：称取
0.1877g tris固体粉末溶于50ml ddh
2
o中，用盐酸调节ph 4～4.4。500mmol/l tris-hcl(ph 9.2-9.5)的配制方法：称取0.24228g tris固体粉末溶于20ml ddh
2
o中，用盐酸调节ph 9.2-9.5。
[0043]
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
[0044]
实施例1. 7α-羟基类固醇脱氢酶(s1-a-1)突变体的制备
[0045]
1.突变体基因的设计与合成
[0046]
野生型7α-羟基类固醇脱氢酶s1-a-1(7α-hsdh s1-a-1)的氨基酸序列如seq id no:1所示，其核苷酸序列如seq id no:3所示。7α-hsdh s1-a-1的基因是本实验室从四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品中分离得到的，其开放阅读框全长804bp，编码267个氨基酸。该基因的分离和克隆方法记载在专利号为zl 201710008510.7，授权公告号为cn106701707b，发明名称为“7α-羟基类固醇脱氢酶基因s1-a-1”的专利文本中，通过引用将该专利的全部内容包含在本文中。
[0047]
野生型7α-羟基类固醇脱氢酶s1-a-1的氨基酸序列(267aa)如下：
[0048]
mkkledkvaiitaatkgiglasaevlaengalvyiaarseelakevisniesnggrakfvyfnarepqtyttmvetvaqnegrldilvnnygetnvkldrdlvngdteeffrivqdnlqsvylpskaaiprmakngggsivnistigsvvpdlgriaycvskaainsltqnialqyarqgvrcnavlpgligtkaamenmtdefrdsflrhvpinrvgkpediakavlyyasddsdyvtgmihevaggyalgspqyaefsammersr(seq id no:1)
[0049]
野生型7α-羟基类固醇脱氢酶s1-a-1的核苷酸序列(804bp)如下：
[0050]
atgaaaaagttagaagataaagtagcaataattactgcagctacaaaaggcataggtcttgcttcagcagaagtgttagctgaaaatggagctttagtctatatagcagcaagatctgaggaattagccaaggaagttatatccaacattgaaagtaatggtggtagagctaagttcgtatatttcaatgctcgtgagccacaaacctatactactatggtagaaactgtggcacaaaatgaaggaaggttagacatattagtaaataactacggtgaaactaacgtaaagctcgacagagatttagttaatggggacacagaggaattttttaggatagttcaagataacttacaaagcgtttatttacctagtaaggctgcaatacctcgtatggctaaaaatggaggtggaagtatagtaaatatatcaacaataggatctgttgttccagacttaggaaggattgcttattgtgtttcaaaggcagcaataaactctttaactcaaaatatagctcttcaatatgcgagacaaggggtaagatgtaatgctgtgcttccaggcttaattggaactaaagcagctatggagaatatgaccgatgaatttagggattccttcttaagacatgtaccaataaacagagtcggaaaaccagaagatattgcaaaggcagtactttattatgcaagtgatgattcagattatgtaactggaatgattcatgaagttgctggaggatatgctttaggaagtccacaatatgctgagttttctgcaatgatggagagaagtagatag(seq id no:3)
[0051]
通过从一级结构至高级结构的多角度多层系比较野生型7α-hsdh s1-a-1与同源酶蛋白的异同，确定了影响7α-hsdh s1-a-1酶学性质的位点为c-末端。因此，我们将野生型7α-hsdh s1-a-1基因序列的第778-801位碱基去除，也就是将野生型7α-hsdh s1-a-1c-端的丝氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸和精氨酸这8个氨基酸去除，得到7α-hsdh s1-a-1酶突变体，命名为s1-a-1c8突变体。该突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:4所示。
[0052]
2.表达载体构建
[0053]
2.1基因扩增
[0054]
本实验以野生型7α-hsdh s1-a-1基因为模板，通过pcr法获得突变体基因，分别在s1-a-1c8突变体基因序列的5
’
端引入酶切位点bamh i(ggatcc)，3
’
端引入酶切位点xho i(ctcgag)。实验中所使用的野生型7α-hsdh s1-a-1基因是本实验室前期以黑熊粪便样品的总dna为模板，采用pcr技术克隆所得(该基因的分离和克隆方法参见专利号为zl 201710008510.7的专利文本)。所述野生型7α-hsdh s1-a-1基因也可通过基因合成的方法获得。实验中所使用的引物的核苷酸序列如下表所示，委托sangon biotech(中国，上海)公司进行引物合成。
[0055]
表1：7α-hsdh s1-a-1c8突变体基因引物
[0056][0057]
pcr体系：
[0058][0059]
pcr条件：
[0060][0061]
同时，按照上述pcr体系和条件扩增野生型7α-hsdh s1-a-1基因，引物为：
[0062]
s1-a-1-fp：5
’-
cgcggatccatgaaaaagttagaagataaagtag-3
’
；
[0063]
s1-a-1-rp：5
’-
cgctcgagctatctacttctctccatcattg-3
’
。
[0064]
2.2酶切
[0065]
利用bamh i(takara bio，货号：1010s)和xho i(takara bio，货号：1094s)限制性内切酶分别对扩增的基因和pgex-6p-2质粒进行双酶切。
[0066]
酶切体系：
[0067][0068][0069]
酶切条件：37℃酶切3h(干浴)。
[0070]
采用回收试剂盒cycle pure kit(omega bio-tek，货号d6493)，按照试剂盒说明书上的操作步骤进行酶切产物回收：
[0071]
1)向每个离心管加入等体积的结合剂binding buffer，使之与酶切产物充分混匀后，吸入dna微型柱的2ml收集管中，离心(10000
×
g，1min)。
[0072]
2)向收集管加入300μl binding buffer，离心(14000
×
g，1min)。
[0073]
3)加入700μl乙醇稀释的spw wash buffer洗涤吸附柱，离心(14000
×
g，1min)，重复一次。
[0074]
4)弃去液体，并将空的吸附柱离心(14000
×
g，2min)。
[0075]
5)将收集管弃去，将dna微型柱放在干净的纸上，开盖静置10min，充分挥发酒精。期间将一管无菌的ddh
2
o预热至65℃备用。
[0076]
6)将dna微型柱放于已灭菌的1.5ml离心管中，加50μl加热到65℃的ddh
2
o，于室温下放置1-2min，洗脱dna，离心(14000
×
g，2min)。
[0077]
7)测浓度。吸取2μl dna于超微量分光光度计中，测定dna的浓度。(浓度单位：ng/μl，260/280：核酸含量)。
[0078]
2.3连接
[0079]
使用t4 dna ligase(takara bio，货号：2011a)，按照如下体系和条件对pgex-6p-2线性载体和基因酶切产物进行连接。
[0080][0081]
16℃连接过夜，得到连接产物：pgex-6p-2/s1-a-1、pgex-6p-2/s1-a-1c8。
[0082]
2.4连接产物转化trans5α感受态细胞
[0083]
1)配制100ml固体lb培养基，121℃高压蒸汽灭菌30min，待冷至40-50℃，向其中加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素。取适量培养基均匀地铺在无菌的培养皿中，于超净台上凝固。期间将-80℃冷冻保存的trans5α感受态细胞(全式金，货号：cd201-01)取出并迅速
放在冰上，静置10min，融化后使用。
[0084]
2)快速将trans5α感受态细胞按照需求分装于无菌的1.5ml离心管中，加入10μl连接产物，在冰上静置30min。
[0085]
3)于45℃，热激45s。
[0086]
4)快速将离心管转移到冰上放置2min(切勿晃动离心管)。
[0087]
5)向其中加入无抗生素无菌的lb液体培养基500μl，摇床培养，温度37℃，摇速180rpm，时间45min，复苏细胞。
[0088]
6)吸取100μl左右菌液，涂布于100μg/ml amp
+
抗性lb平板培养基上，37℃过夜培养。
[0089]
2.5阳性克隆筛选
[0090]
1)挑取单菌落，接种于适量的无菌的100μg/ml amp
+
抗性lb液体培养基中，摇床培养，温度37℃，摇速220rpm。培养至od
600
大约为0.8-1。
[0091]
2)保种：菌液和25％(v/v)无菌甘油按照2：1的体积比混匀后，液氮速冻，保存于-80℃。
[0092]
3)余下的菌液用于质粒提取。采用质粒提取试剂盒plasmid mini kit i(omega bio-tek，货号：d6943)按试剂盒说明书提取质粒，步骤如下：
[0093]
1)菌液生长至od
600
大约为0.8-1，8000rpm离心5min获取菌体。
[0094]
2)弃上清液，并立即用200μl移液枪吸干残留液体，立即加入250μl solution i(已加入rna酶，并保存于4℃)，涡旋直至菌体沉淀完全悬浮。
[0095]
3)将混匀的菌液加入1.5ml无菌离心管中，向离心管中加入同等体积的solution-，缓慢的转动离心管彻底混匀样品，以获得澄清裂解液。立即向其中加入350μl solution-，缓慢的转动离心管混合样品(出现白色絮状沉淀)，离心(4℃，13000
×
g，10min)。(注意这步必须在5min内完成，并且不能剧烈混合，否则染色体dna断裂使得到的质粒纯度降低)。
[0096]
4)用200μl移液枪小心吸取上清(确保没有吸入沉淀)，转移至装dna微型柱的2ml收集管中。
[0097]
5)离心(13000
×
g，1min)，弃滤液。
[0098]
6)向收集柱中加入500μl buffer hb，离心(13000
×
g，1min)，弃滤液。
[0099]
7)向收集柱中加入700μl dna wash buffer(已加入无水乙醇)，离心(13000
×
g，1min)，弃滤液，除杂。重复一次，弃液体。
[0100]
8)离心(15000
×
g，2min)以甩干dna微型柱，打开收集柱盖子，静置10min，使无水乙醇挥发干净。期间取一管无菌的ddh
2
o预热到65℃。
[0101]
9)将dna微型柱置于无菌的1.5ml离心管中，加入50μl已经预热到65℃ddh
2
o，室温静置2min，离心(15000
×
g，2min)。
[0102]
10)测浓度。吸取2μl dna于超微量分光光度计，测定dna的浓度。(浓度单位：ng/μl，260/280：核酸含量)。
[0103]
2.6质粒的双酶切鉴定
[0104]
酶切体系：
[0105][0106]
酶切条件：37℃酶切1.5h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
[0107]
2.7测序确认
[0108]
选取双酶切鉴定结果正确的重组质粒送sangon biotech(中国，上海)公司测序，将测序结果正确的重组质粒作为s1-a-1野生型和s1-a-1c8突变体的表达载体。
[0109]
3.酶蛋白的gst融合异源表达
[0110]
3.1质粒转化e.coli bl21细胞
[0111]
按照上述2.4(连接产物转化trans5α感受态细胞)的转化方法将上述2.7测序结果正确的重组质粒转入e.coli bl21(de3)细胞(全式金，货号：cd601)中，获得用于蛋白表达的重组菌。
[0112]
3.2蛋白表达与纯化
[0113]
(1)接种100μl重组菌的菌液于400ml无菌lb培养基中，氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，37℃，180rpm摇床培养。
[0114]
(2)待od
600
≈0.8时，加入终浓度为0.2mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，化学式c
9
h
18
o
5
s)，16℃诱导过夜(12h)。将菌液分装至高速离心瓶中，8000rpm离心5min，收集菌体。
[0115]
(3)按1l培养体系加30ml裂解缓冲液(ph 7.4，10mm pbs)的比例重悬菌体，4℃超声破菌至澄清。破碎的菌液均分至4℃预冷的50ml无菌离心管，4℃，12000rpm离心20min，沉降菌体，待离心结束，用精密移液枪将上清转移到4℃预冷的50ml无菌离心管中。
[0116]
(4)取glutathione sepharose 4b填料装于亲和层析柱(ge healthcare，货号：10223836)中，填料使用的比例为每升培养体系使用5ml填料。用4℃预冷的无菌的ph 7.4，10mm pbs冲洗3个柱体积，去除无水乙醇。将步骤(3)得到的上清与glutathione sepharose 4b结合，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。
[0117]
(5)结合完毕后，500rpm离心5min沉淀填料。滤掉上清，用4℃预冷的无菌的ph7.4，10mm pbs(含有体积分数为0.25％的吐温20)冲洗填料3到5个柱体积，去除杂蛋白。
[0118]
(6)加入1ml 4℃预冷的酶切缓冲液(ph 7.4，10mm pbs)，加入40μl prescission protease酶(genscript，z02799-100)，4℃酶切过夜。
[0119]
(7)酶切完毕后，将上清从层析柱中放出即为洗脱的7α-hsdh酶液。
[0120]
(8)将所得酶液进行sds-page，鉴定其分子量大小及纯度，野生型酶的分子量约为28.93kda，突变体酶的分子量约为27.98kda。使用bradford蛋白浓度测定试剂盒(beyotime，p0006)按照试剂盒说明书测定纯化蛋白的浓度。将酶液和体积分数为80％的无菌甘油按照3：1的体积比混匀，并将含有甘油的酶液分装于无菌的1.5ml离心管中，保存于-80℃。
[0121]
(9)使用后的glutathione sepharose 4b填料用6mol/l的盐酸胍(cas号50-01-1)
浸泡20min，再用pbs大量冲洗填料后用20％乙醇浸泡填料，保存于4℃冰箱。
[0122]
sds-page检测结果显示s1-a-1c8突变体可溶性表达成功(图2)，并且经一步亲和层析后蛋白的条带单一。纯化的s1-a-1c8突变体酶蛋白的浓度是1.35mg/ml。sds-page检测结果显示野生型酶可溶性表达成功(图3)。纯化的野生型酶蛋白的浓度为1.53mg/ml。
[0123]
实施例2. 7α-羟基类固醇脱氢酶(s1-a-1)突变体的酶活测定
[0124]
1.nadph标准曲线的制作
[0125]
利用反应缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)分别配制0mm，0.1mm，0.2mm，0.3mm，0.4mm的nadph(sigma-aldrich，货号：10621692001)溶液。用上述反应缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)调零后将各个浓度的nadph溶液分别加入2ml比色皿中，于室温下，在340nm处测定光吸收值od
340
。以nadph溶液的浓度为横坐标，对应的340nm光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图4所示，获得的标准曲线方程式为y＝2.79559x-0.0003，r
2
＝0.9999。
[0126]
反应缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0)的配制方法为：取6.057g tris(三羟甲基氨基甲烷，cas号1185-53-1)固体粉末溶于1l去离子水中，用盐酸调ph到8.0，室温放置备用。
[0127]
2.酶活测定
[0128]
(1)用ddh
2
o分别配制50mm nadp
+
辅酶(sigma-aldrich，货号：n5755)，50mm cdca(sigma-aldrich，货号：c8261)，50mm tcdca(百灵威科技，货号：330776)，50mm gcdca(麦克林试剂，货号：g835599),50mm ca(sigma-aldrich，货号：c1254)，50mm tca(sigma-aldrich，货号：t4009)和50mm gca(sigma-aldrich，货号：g7132)溶液。
[0129]
(2)设置6个实验组，每个实验组在2ml比色皿中首先加入1955μl 50mm tris-hcl(ph 8.0)缓冲溶液，再依次加入20μl 50mm nadp
+
辅酶溶液，以及2μl实施例1制备的酶蛋白溶液，充分混匀后在波长为340nm条件下调零，然后立即向各实验组的混合液中分别加入20μl 50mm cdca(鹅去氧胆酸)底物溶液/20μl 50mm tcdca(牛磺鹅去氧胆酸)底物溶液/20μl 50mm gcdca(甘氨鹅去氧胆酸)底物溶液/20μl 50mm ca(胆酸)底物溶液/20μl 50mm tca(牛磺胆酸)底物溶液/20μl 50mm gca(甘氨胆酸)底物溶液，充分吹打混匀，于室温下在340nm处记录30s内的光吸收变化，并根据nadph的标准曲线计算产物的生成量。每个酶蛋白样品进行3次重复试验，结果取平均值。
[0130]
(3)酶活计算：将340nm处记录的30s内的光吸收变化值带入nadph标准曲线y＝2.79559x-0.0003，r
2
＝0.9999中，计算得到30s时已转化底物浓度(mmol/l)。
[0131][0132]
vt：反应总体积，ml
[0133]
酶活单位：相应条件下，每分钟转化1μmol cdca或tcdca或gcdca或ca或tca或gca所需的7α-hsdh酶量定义为一个酶活单位u。酶的比活定义为：每毫克酶蛋白含有的活性单位数，单位为：u/mg。
[0134]
结果如图5所示，野生型酶s1-a-1在底物cdca和nadp
+
的存在下，酶活为156.8u/mg；在底物tcdca和nadp
+
的存在下，酶活为160.7u/mg；在底物gcdca和nadp
+
的存在下，酶活为136.0u/mg；在底物ca和nadp
+
的存在下，酶活为18.2u/mg；在底物tca和nadp
+
的存在下，酶活为33.2u/mg；在底物gca和nadp
+
的存在下，酶活为12.8u/mg。而突变体s1-a-1c8在底物cdca和nadp
+
的存在下，酶活为21.6u/mg；底物tcdca和nadp
+
的存在下，酶活为24.5u/mg，在
底物gcdca和nadp
+
的存在下，酶活为11.8u/mg；在底物ca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg；在底物tca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg；在底物gca和nadp
+
的存在下，酶活为0u/mg。可见，突变体s1-a-1c8出现了底物选择性，其专一性催化cdca及其缀合物。
[0135]
实施例3. 7α-羟基类固醇脱氢酶(s1-a-1)突变体检测总cdca的应用
[0136]
采用获得的专一性催化cdca及其缀合物的酶突变体s1-a-1c8进行总cdca胆汁酸的循环酶法检测，检测原理如下：
[0137][0138]
即利用7α-hsdh和硫代氧化型辅酶-(thio-nadp
+
)特异性氧化胆汁酸，生成7-酮类固醇和还原型辅酶-(nadph)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(nadp
+
)，每一次循环比原来的反应提高一倍灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的硫代还原型辅酶-(thio-nadph)，微量胆汁酸被扩增，在405nm波长测定每分钟thio-nadph吸光度的变化率(δa/min)，计算血清胆汁酸的含量。
[0139]
1.试剂准备
[0140]
试剂1(r1)：
[0141]
配制100mmol/l tris-hcl ph 4-4.4：称取0.1877g tris固体粉末溶于50ml ddh
2
o中，盐酸调节ph 4-4.4；称取35.8452mg辅酶-(thio-nadp
+
)(creative enzymes，货号：nate-0697)，加入于上述100mmol/l tris-hcl ph 4-4.4溶液中，使其终浓度为0.9mmol/l。
[0142]
试剂2(r2)：
[0143]
配制500mmol/l tris-hcl ph 9.2-9.5：称取0.24228g tris固体粉末溶于20ml ddh
2
o中，盐酸调节ph 9.2-9.5；称取100mg辅酶-(nadph)(sigma-aldrich，货号：10621692001)于上述500mmol/l tris-hcl ph 9.2-9.5溶液中，使其终浓度为6mmol/l；然后加入本发明的突变体酶s1-a-1c8(200ku/l)10μl，使其终浓度为12.5ku/l。
[0144]
胆汁酸标准品(tcdca)：用ddh
2
o配制浓度分别为10、25、50、75、100、125μmol/l的tcdca。
[0145]
2.采用本发明的方法测定血清样品中总cdca的含量
[0146]
采用紫外可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)进行总cdca检测，操作如下：
[0147]
(1)线性范围
[0148][0149]
结果如图6所示：胆汁酸测定线性范围：0μmol/l～100μmol/l。
[0150]
(2)血清样品中总cdca胆汁酸浓度的检测：
[0151][0152]
血清样品1-4由重庆大学校医院提供。
[0153][0154]
结果：血清样品1中总cdca的浓度为3.34μmol/l；血清样品2中总cdca的浓度为7.21μmol/l；血清样品3中总cdca的浓度为5.66μmol/l；血清样品4中总cdca的浓度为1.22μmol/l。
[0155]
3.采用超高效液相色谱－串联质谱法(uplc-ms/ms)测定血清样品中总cdca的含量
[0156]
(1)血清标本处理
[0157]
移取100μl血清于1.5ml离心管，加入300μl低温保存(-80℃)的含内标乙腈溶液(3μmol/l)(乙腈：色谱级，购买自honeywell burdick&jackson，货号：100269)，静置1min后旋涡振荡5min，在4℃下11000r/min高速离心5min，吸取上清液100μl，低温浓缩至接近干燥，
用100μl的70％(v/v)乙腈水溶液复溶；在4℃下11000r/min高速离心5min，取上清液用于uplc-ms/ms上样分析。
[0158]
(2)uplc-ms/ms检测
[0159]
acquity超高效液相色谱－串联四级杆质谱联用仪(uplc-ms/ms，美国waters公司)。色谱和质谱条件如下：
[0160]
色谱柱：waters beh c18(50mm
×
2.1mm，1.7μm)。流动相：a相为0.1％(v/v)甲酸水溶液，b相为0.1％(v/v)甲酸-乙腈与甲醇(甲酸-乙腈与甲醇体积比为3：1)的溶液，流速0.4ml/min；柱温为45℃。梯度洗脱程序：0～2min，35％～43％b；2.0～3.5min，43％～46％b；3.5～5.0min，46％～59％b；5.0～7.0min，59％b；7.0～8.7min，59％～66％b；8.7～10.7min，66％～98％b；10.7～11.3min，35％b。离子源：电喷雾离子源(esi)。扫描方式：负离子扫描。检测方式：多反应监测(mrm)模式。毛细管电压：3.0kv。离子源温度：150℃。脱溶剂气温度：400℃。脱溶剂气流速：800l/h。锥孔气流速：50l/h。脱溶剂气和锥孔气均为氮气。目标物质谱参数如下表所示。
[0161]
化合物离子对碰撞能量锥孔电压驻留时间cdca391.3/391.310-840.25tcdca498.3/80.062-920.23gcdca448.3/74.040-740.18
[0162]
(3)标准曲线线性范围：将倍比稀释的胆汁酸系列混合标准工作溶液取100μl，加入300μl内标乙腈溶液(3μmol/l)，以待测物浓度x为横坐标，相应响应值y(待测物与相应内标物响应值之比)为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归分析。建立cdca、tcdca、gcdca的标准曲线，得到线性回归方程和线性相关系数。其中cdca的质量浓度为1.0～2000.0nmol/l，tcdca的质量浓度为10.0～2000.0nmol/l，gcdca的质量浓度为10.0～6000.0nmol/l。三种胆汁酸在其范围内均呈现良好的线性关系，线性相关系数r
2
均大于0.9989。
[0163]
(4)血清标本的测定，采用上述方法进行测定，根据标准曲线计算血清样品1-4中各胆汁酸的含量。
[0164][0165]
结果如下表所示，采用uplc-ms/ms测定的血清样品中的总cdca含量与采用本发明的方法测定的血清样品中的总cdca含量一致。
[0166]
血清中各胆汁酸浓度比较(nmol/l)
[0167]
样品cdcatcdcagcdca总cdca血清样品117536.22795.63006.8血清样品227596.26795.67166.8血清样品3234.567.64800.85102.9
血清样品492.937.2998.61128.7
[0168]
实施例4.用于测定样品中总cdca含量的试剂盒
[0169]
1.试剂准备
[0170]
试剂1(r1)：
[0171]
配制100mmol/l tris-hcl ph 4-4.4：称取0.1877g tris固体粉末溶于50ml ddh
2
o中，盐酸调节ph 4-4.4；称取35.8452mg辅酶-(thio-nadp
+
)(creative enzymes，货号：nate-0697)，加入于上述100mmol/l tris-hcl ph 4-4.4溶液中，使其终浓度为0.9mmol/l。
[0172]
试剂2(r2)：
[0173]
配制500mmol/l tris-hcl ph 9.2-9.5：称取0.24228g tris固体粉末溶于20ml ddh
2
o中，盐酸调节ph 9.2-9.5；称取100mg辅酶-(nadph)(sigma-aldrich，货号：10621692001)于上述500mmol/l tris-hcl ph 9.2-9.5溶液中，使其终浓度为6mmol/l；然后加入s1-a-1c8(200ku/l)10μl，使其终浓度12.5ku/l。
[0174]
胆汁酸标准品(tcdca)：50μmol/l的tcdca。
[0175]
2.试剂盒组装
[0176]
将试剂1(r1)、试剂2(r2)和胆汁酸标准品(tcdca)全部装入试剂盒中，并装入试剂盒使用说明书，在试剂盒外壳上贴上试剂盒标签。
[0177]
试剂盒使用说明：
[0178]
(1)准备1支校准管和样品数量的检测管；
[0179]
(2)向校准管中加入180μl试剂1(r1)和3μl胆汁酸标准品(tcdca)，向检测管中加入180μl试剂1(r1)和3μl样品，37℃孵育300秒使样品与试剂充分混匀；
[0180]
(3)然后向各管中加入60μl试剂2(r2)，充分混匀后开始反应；
[0181]
(4)反应90s后记录405nm处吸光度a1，120秒后记录吸光度a2；分别计算检测管和校准管中反应物的405nm吸光度的变化率(
△
a/min)；
[0182]
(5)按照如下公式计算样品中总cdca的含量：
[0183][0184]
注：样品可以是血清、胆汁或胆粉。如果是胆粉，可使用ddh
2
o配制成溶液后进行检测。

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