一种ZIF-8@FDH纳米杂化材料的制备方法及应用与流程

一种zif-8@fdh纳米杂化材料的制备方法及应用
技术领域
[0001]
本发明属于纳米材料技术领域，尤其涉及一种使用zif-8将甲酸脱氢酶(fdh)固定的方法和应用。
技术背景
[0002]
甲酸脱氢酶作为一种生物催化剂，可以在常温常压下高效的催化甲酸还原生成二氧化碳和还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nadh，或者在合适的电子供体存在下催化二氧化碳还原为甲酸。但是酶的价格昂贵，且稳定性较差。在高温、酸碱性环境或有机溶液中容易失活。并且在产物中的酶难以分离，不利于酶的回收再利用，还会造成产物的污染。因此，对酶进行固定化是提高fdh的使用效率和降低成本的重要措施之一。
[0003]
近年来，酶固定化技术已经得到广泛研究，固定载体和固定方法也有较多报导。其中金属-有机框架(mof)是一种多孔材料，由含金属的节点和通过配位键连接的有机配体组成。由于金属节点和配体的几何形状和连通性的丰富性，可以针对特定功能设计和定制它的拓扑结构。因其拥有出色的可调控的框架结构，并且制备方法简单，已成为固定化酶的一个重要方法(lian x,fang y,joseph e,et al.enzyme
–
mof(metal
–
organic framework)composites[j].chemical society reviews,2017,46(11):3386-3401.)。而且mof具有极高的比表面积和孔体积，易于调整的孔径。合成方式温和，不会对酶造成伤害等显著优点。
[0004]
利用mof固定化酶的方法可分为表面附着、共价键连接、孔包封和共沉淀四种类型。其中，共沉淀法主要是通过锌离子和2-甲基咪唑(hmim)配位形成沸石咪唑酸盐骨架(zif-8)可以在合成过程中将酶原位固定，允许将比孔径大的客体分子包封在zif结构中。不仅zif-8的结构对于固定酶和保持酶活性有重要影响，酶分子的存在反作用于zif-8，影响其框架结构和孔尺寸，从而影响固定化酶的活性。因此，需要设计适用于fdh固定的zif-8框架结构。另外，目前报导的方法中zif-8团聚较严重，不利于在溶液中分散以增加酶与底物的接触，导致催化效率不高。因此，迫切需要新的制备方法以提高zif-8在水溶液中的分散性。


技术实现要素：

[0005]
针对目前mof固定生物酶方法中存在的问题，本发明提出一种zif-8固定fdh方法和应用。该制备方法简单，反应条件温和，不会对酶造成伤害。所得固定化材料作为催化剂用于酶促反应时，可保持较高的酶活且对环境有较好的耐受性，易于分离，可循环使用等。具体发明内容如下：
[0006]
本发明提供了一种zif-8@fdh纳米杂化材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]
s1：将二水合乙酸锌溶于水中，得到溶液a；
[0008]
s2：将2-甲基咪唑溶于水中，加入fdh粉末混匀后，得到溶液b；
[0009]
s3：将溶液a于搅拌下逐步滴加到溶液b中，经反应得到zif-8@fdh悬浊液；
[0010]
s4：将悬浊液离心冲洗后，将沉淀真空干燥12h，得到zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0011]
优选的，二水合乙酸锌浓度为10-40mm,2-甲基咪唑浓度为50-160mm。
[0012]
优选的，溶液a与溶液b的体积比为0.5-4。
[0013]
优选的，所述fdh，其浓度为0.05-0.5mg/ml。。
[0014]
优选的，所述反应在室温下进行，反应时间为12-48h。
[0015]
优选的，zif-8@fdh悬浊液离心速度为5000-12000rpm,离心时间为10-30min。
[0016]
本发明提供了一种根据上述任一项制备方法制备得到的zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0017]
本发明提供了一种根据上述制备方法所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料在催化二氧化碳向甲酸的特异性转化中的应用。
[0018]
本发明所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料中fdh的酶活与游离酶相比，活性保持在80％以上，且对环境的耐受性提高。
[0019]
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
[0020]
1、本发明利用锌离子与2-甲基咪唑配位形成的沸石咪唑酸盐骨架将fdh在水溶液中原位固定，zif-8@fdh纳米杂化材料在水相中有较好的分散性。在提高fdh稳定性的同时，较好地保持了固定化酶的活性，可循环使用。
[0021]
2、本发明提供的制备方法简单，水性环境对酶友好，且价格低廉，便于进一步的工业化生成和商业推广。
附图说明
[0022]
图1为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料的透射电子显微镜(tem)照片；
[0023]
图2为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料在水溶液中分散的光学照片；
[0024]
图3为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料与纯zif-8的傅里叶变换红外光谱(ftir)；
[0025]
图4a为不同浓度nadh水溶液所对应紫外-可见吸收光谱中吸光度的标准曲线；
[0026]
图4b为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料和游离fdh为催化剂时，在催化nad
+
还原过程中，生成的产物nadh与反应时间的关系曲线；
[0027]
图5为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh与游离fdh在不同温度下的酶活性；
[0028]
图6为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料在循环催化时，产物nadh与反应时间的关系曲线；
[0029]
图7为本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料催化co2向甲酸转化的转化率-时间曲线。
具体实施方式
[0030]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。
[0031]
本发明实施例提供了一种zif-8@fdh纳米杂化材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0032]
s1：将二水合乙酸锌溶于水中，得到溶液a；
[0033]
s2：将2-甲基咪唑溶于水中，加入fdh粉末混匀后，得到溶液b；
[0034]
s3：将溶液a于搅拌下逐步滴加到溶液b中，经反应得到zif-8@fdh悬浊液；
[0035]
s4：将悬浊液离心冲洗后，将沉淀真空干燥12h，得到zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0036]
上述实施例所公开方法的原理在于通过锌离子与2-甲基咪唑配位形成的沸石咪唑酸盐骨架。在此过程中，生物大分子通过参与框架的构建过程，可以调节框架材料的大小，形态和结晶度，同时将其自身封装在多孔框架材料中，并随之产生新的空腔，这些空腔紧密围绕生物大分子并与其骨架相互作用，从而将酶分子在溶液中原位固定，最终形成具有特定形态的多面体结构，如图1所示。该反应的优势在于：反应在水溶液中进行，条件温和，操作简单，制备过程中不会对酶的活性造成损害。
[0037]
在一项优选实施例中，二水合乙酸锌浓度为10-40mm,2-甲基咪唑浓度为50-160mm。需要说明的是，每个酶分子表面会结合固定数量的锌离子和hmim配体，增加金属阳离子和有机配体的局部浓度将促进zif-8在生物大分子周围的预成核簇，从而使晶体的形成可控结构。因此，锌离子和hmim的浓度非常关键，其会对酶与离子形成的复合物的结构和大小产生影响。并最终影响固定化产物活性，因此需固定其浓度。过高或过低的浓度均会影响酶与离子形成的复合物的结构与大小产生影响。并最终影响产物活性。在本实施例中，优选二水合乙酸锌浓度为10-40mm,2-甲基咪唑浓度为50-160mm，可以形成规整的框架结构。
[0038]
在一项优选实施例中，溶液a与溶液b的体积比为0.5-4。可以理解的是通过控制锌离子与hmim的比例，可以使晶体只有在酶存在时生成，降低了纯zif-8晶体对产物的影响。当hmim浓度过高时，在不加入酶的情况下也会迅速生成纯zif-8，去除困难，因此会对最终产物的整体活性产生影响。
[0039]
在一项优选实施例中，所述fdh，其浓度为0.05-0.5mg/ml。如前文所述，每个酶分子表面会结合固定数量的锌离子和hmim配体，过量的酶分子无法与配体离子结合。且可能会吸附在zif-8结晶表面，使产物粒径增大，形成沉淀。不利于底物充分扩散与催化剂接触，从而影响催化效率。在本实施例中，选择fdh的浓度为0.05-0.5mg/ml，可以满足分散性好，不容易团聚的要求(如图2所示)。而通过红外光谱图(如图3所示)表征发现，反应产物除具有zif-8的基团特征外，还具有fdh的n-h和酰胺带的特征峰，表明zif-8@fdh纳米杂化材料的成功合成。
[0040]
在一项优选实施例中，所述反应在室温下进行，反应时间为12-48h。反应在室温进行，是为了更好的保持生物酶的活性。在室温下，反应时间控制在12-48h之间，反应较为充分，可以获得具有规整结构和良好催化性质的zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0041]
在一项优选实施例中，zif-8@fdh悬浊液离心速度为5000-12000rpm,离心时间为10-30min。离心的目的是将固定化后的zif-8@fdh从溶液中分离出来，借此来除去未反应的反应物和未固定的fdh分子，以避免在后续的酶催化实验中污染产物，增加纯化的难度。离心的转速和时间主要由分离产物的尺寸决定，不同的反应物配比和fdh浓度会导致zif-8@fdh纳米杂化材料尺寸的差异，因此在离心时应选择合适的转速。在本实施例中，离心速度
选择5000-12000rpm,离心时间选择10-30min较为合适。
[0042]
本发明实施例提供了一种根据上述任一项实施例所述的制备方法制备得到的一种zif-8@fdh纳米杂化材料，其在水中的分散结果如图2所示。本发明提供的zif-8@fdh纳米杂化材料一方面提高了酶的稳定性，使酶可以耐受不同的环境(如图5所示)；另一方面，使酶便于与产物分离，并可以循环利用(如图6所示)。这对于减少酶对产物的污染并降低酶的浪费具有重要意义。
[0043]
本发明实施例提供了根据上述制备方法所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料在催化二氧化碳向甲酸的特异性转化中的应用，可以将co2专一性地转化为甲酸(如图7所示)。
[0044]
在一优选实施例中，本发明所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料中fdh与游离酶相比，活性保持在80％以上(如图4所示)，且对环境的耐受性提高。
[0045]
为了更清楚详细得介绍本发明实施例所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料的制备方法及应用，下面将结合具体实施例进行描述。
[0046]
实施例1
[0047]
取二水合乙酸锌配制成水溶液，得到溶液a，其中二水合乙酸锌浓度10mm。
[0048]
取2-甲基咪唑配制成水溶液。将甲酸脱氢酶溶于2-甲基咪唑溶液中，得到溶液b，其中2-甲基咪唑浓度50mm，fdh浓度0.05mg/ml。
[0049]
将溶液a于搅拌下加入溶液b中，于室温下反应12h，得到zif-8@fdh悬浊液。
[0050]
将悬浊液离心，将沉淀清洗后，于室温下真空干燥12h，得到zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0051]
实施例2
[0052]
取二水合乙酸锌配制成水溶液，得到溶液a，其中二水合乙酸锌浓度40mm。
[0053]
取2-甲基咪唑配制成水溶液。将甲酸脱氢酶溶于2-甲基咪唑溶液中，得到溶液b，其中2-甲基咪唑浓度160mm，fdh浓度0.5mg/ml。
[0054]
将溶液a于搅拌下加入溶液b中，于室温下反应48h，得到zif-8@fdh悬浊液。
[0055]
将悬浊液离心，将沉淀清洗后，于室温下真空干燥12h，得到zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0056]
实施例3
[0057]
取二水合乙酸锌配制成水溶液，得到溶液a，其中二水合乙酸锌浓度25mm。
[0058]
取2-甲基咪唑配制成水溶液。将甲酸脱氢酶溶于2-甲基咪唑溶液中，得到溶液b，其中2-甲基咪唑浓度100mm，fdh浓度0.3mg/ml。
[0059]
将溶液a于搅拌下加入溶液b中，于室温下反应36h，得到zif-8@fdh悬浊液。
[0060]
将悬浊液离心，将沉淀清洗后，于室温下真空干燥12h，得到zif-8@fdh纳米杂化材料。
[0061]
实施例4
[0062]
采用傅立叶红外光谱仪，型号：nicolet6700，于实验温度25℃下进行下述测试，以上述实施例所制备的材料为例进行说明。
[0063]
结合傅立叶红外光谱仪测量样品在红外区的透过率，具体的，将样品与溴化钾混合研磨后压片进行测量，测量范围400-4000nm。
[0064]
测试结果如图2所示，对于纯zif-8，包封有fdh的zif-8样品在3300cm-1
和1650cm-1
产生了两个新的峰，分别对应蛋白质的n-h键和酰胺键。证明了所制备zif-8@fdh纳米杂化材料的组成。
[0065]
实施例5
[0066]
采用紫外可见分光光度仪，型号：uv-1700pharmaspec，于实验温度25℃下进行下述测试，以上述实施例所得材料为例进行说明。
[0067]
nadh在紫外可见光谱中340nm处具有吸收，其强度与其浓度相关(如图4a所示)，本实施例结合紫外可见光谱测量体系中nadh的含量。
[0068]
首先，先配置不同浓度的nadh溶液，然后测量其在340nm处的紫外吸收，以不同浓度的nadh水溶液在340nm处的吸收峰强度为横坐标，以所对应的浓度为纵坐标，做nadh的标准曲线，如图4a所示，数据点之间具有较好的线性关系，线性方程为：y＝0.00814+0.18833x，通过测量不同反应体系中340nm处的紫外可见吸收强度，可以根据此关系式来计算体系中nadh的浓度，从而进一步计算出nadh的转化率。
[0069]
实施例6
[0070]
对比本发明实施例所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料与游离的fdh对nad
+
催化效果，具体实验方法如下：
[0071]
反应底物由13.4mg nad
+
，48mg甲酸和磷酸盐缓冲液(ph 7)组成，溶液总体积为4ml。分别将实施例3所制得的zif-8@fdh纳米杂化材料和相同用量的fdh加入底物中。每三分钟取样，通过紫外可见分光光光度计测量溶液在340nm处的吸光度来确定nadh的浓度。
[0072]
图4b给出了分别以本发明实施例3所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料和相同用量的游离fdh为催化剂，催化反应进行20分钟，样品的紫外可见吸收光谱曲线。从图中可以看出，以本发明实施例3所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料催化时，体系在340nm处的吸收峰强度与以游离fdh为催化剂时的吸收峰强度相差不大，表明所制备的zif-8@fdh纳米杂化材料较好地保持了fdh的催化活性。
[0073]
图4b给出了分别以本发明实施例3所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料和相同用量的游离fdh为催化剂时nadh的生成曲线。在所观测的时间范围内保留了游离fdh 80％以上的催化活性。充分表明本发明所提供的fdh固定方法不会对酶活性造成损害。
[0074]
图5给出了分别以本发明实施例3所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料和相同用量的游离fdh为催化剂时，在不同温度下催化nadh转化率的对比。发现在升温时，zif-8@fdh纳米杂化材料对fdh有较好的保护作用，体现了良好的环境耐受性。
[0075]
图6给出了本发明实施例3所提供的zif-8@fdh纳米催化材料在催化反应后回收再次催化时，生成的产物nadh与反应时间的关系曲线。从图中可以看出，回收的zif-8@fdh纳米催化材料仍然可以催化nadh的转化反应，表明本发明实施例所提供的zif-8@fdh纳米杂化材料可以重复循环使用，从而降低了酶的损耗和产物中酶引起的污染。
[0076]
图7给出了以本发明实施例3所制备的zif-8@fdh纳米催化材料为催化剂，以nadh为辅酶，成功地将二氧化碳转变成了甲酸，说明了本发明所提供的纳米材料可以用于二氧化碳向甲酸特异性转化的催化剂。

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