培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法与流程

[0001]
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法。


背景技术：

[0002]
糖尿病(diabetes mellitus,dm)是一种因多种遗传因素和环境因素共同作用而导致的胰岛素产生不足或功能缺陷，并以血糖异常升高为主要特征的内分泌代谢紊乱疾病。由于血液中葡萄糖累积过多，还会引发各种致病因子作用于机体的各大靶器官导致一系列并发症的形成。糖尿病是世界公认的顽疾之一，已经成为世界第三大慢性疾病和第五大致死性疾病。
[0003]
据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的i型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的ii型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于i型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于ii型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。
[0004]
目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗i型糖尿病和部分ii型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。近年来，诱导多能干细胞的出现为再生医学提供了一个全新的治疗策略，而由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛的出现也为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。
[0005]
ips细胞，英文全称为induced pluripotent stemcells，中文全称是诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。ips细胞的获得方法相对简单和稳定，不使用胚胎细胞或卵细胞，不仅在伦理上占有优势，更扩大了干细胞的来源范围，使更多患者能够有机会利用ips技术获得所需的干细胞。但目前对于如何将ips细胞分化为胰岛的研究尚不足。干细胞体外定向诱导和分化的过程就是在模拟体内正常生理情况下组织器官的发生和发育过程。但由于诱导的过程往往分成诺干阶段，同时分化的时间长，因此实际操作过程中，往往重复性低，诱导效率差，副产品多严重影响了诱导胰岛的临床应用。


技术实现要素：

[0006]
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法，该方法转化效率高、操作便捷，且全程无动物源组分添加。
[0007]
本发明从ips到胰岛的体外诱导分化过程采用分步诱导方法，一共分七个阶段，定向内胚层的诱导分化、原肠管的诱导分化、后前肠的诱导分化、胰腺祖细胞的诱导分化、内
分泌前体细胞的诱导分化、早期胰岛的诱导分化、晚期成熟胰岛的诱导分化这7个步骤，最终可以得到大量成熟胰岛。
[0008]
在ips向内胚层分化阶段，本发明提供了：
[0009]
gdf8在制备促进ips细胞向内胚层细胞分化的制剂中的应用。
[0010]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，gdf8作为组分之一存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，gdf8独立存在，或与辅料共同存在，在诱导时添加入培养基中，作为诱导ips细胞向内胚层细胞分化的诱导剂。所述辅料包括但不限于水。
[0011]
一种培养基，由基础培养基、gdf8和chir-99021、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)组成。
[0012]
在此培养基中，所述stage1基础培养基为mcdb131培养基。
[0013]
所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。当其为粉末培养基时以无菌水或mcdb131培养基稀释，使用滤器灭菌。
[0014]
在此培养基(stage 1培养基a)中，所述gdf8的浓度为80ng/ml～120ng/ml；所述chir-99021的浓度为2μmol/l～4μmol/l；所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、所述bsa的质量分数为1％～3％。
[0015]
一些具体实施例中，培养基(stage 1培养基a)中，所述gdf8的浓度为100ng/ml；所述chir-99021的浓度为3μmol/l；所述碳酸氢钠的浓度为3g/l、所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l、所述葡萄糖的浓度为20mmol/l、所述bsa的质量分数为2％。
[0016]
在此培养基(stage 1培养基b)中，所述gdf8的浓度为80ng/ml～120ng/ml；所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、所述bsa的质量分数为1％～3％。
[0017]
一些具体实施例中，培养基(stage 1培养基b)中，所述gdf8的浓度为100ng/ml；所述碳酸氢钠的浓度为3g/l、所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l、所述葡萄糖的浓度为20mmol/l、所述bsa的质量分数为2％。
[0018]
此培养基在诱导ips细胞向内胚层细胞分化中的应用。
[0019]
一种诱导ips细胞向内胚层细胞分化的方法，以上述的培养基诱导ips细胞向内胚层细胞分化。
[0020]
所述诱导的容器经过matrigel基质铺板，所述铺板的条件为：e8完全培养基存在条件下，37℃，5％co
2
静置1-2d。
[0021]
所述诱导的时间为3d，诱导第1天使用stage 1培养基a；诱导第2～3天，使用stage1培养基b，每天更换新鲜培养基。
[0022]
经过诱导分化的ips细胞形态发生改变，相比于未分化的干细胞，此时内胚层细胞的核质比显著降低，并且细胞之间接触之处存在明显界限。
[0023]
ips经诱导后，用sox17(绿色)、foxa2(红色)作为内胚层的标记物(图5)，内胚层的阳性率要高于85％，本发明实施例中，诱导后获得的内胚层细胞经检测sox17/dapi(免疫荧光)，表达率>90％，foxa2/dapi(免疫荧光)，表达率>90％。研究表明，采用gdf8、chir-99021联合对ips进行诱导，诱导的效率更高，所得内胚层细胞的数量大、sox17及foxa2的阳性率
更高，显著高于单独采用gdf8或chir-99021，p<0.05。
[0024]
在内胚层向原肠管分化阶段，本发明提供了：
[0025]
fgf7和/或抗坏血酸在制备促进内胚层细胞向原肠管分化的制剂中的应用。
[0026]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，fgf7和/或抗坏血酸作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，fgf7和/或抗坏血酸分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为诱导内胚层细胞向原肠管分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0027]
一种培养基(stage 2培养基)，由基础培养基、fgf7、抗坏血酸、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)组成。
[0028]
在此培养基(stage 2培养基)中，
[0029]
所述fgf7的浓度为45ng/ml～55ng/ml；
[0030]
所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l。
[0031]
所述碳酸氢钠的浓度为2～4g/l；
[0032]
所述谷氨酰胺的浓度为1～3mmol/l(100
×
)；
[0033]
所述葡萄糖的浓度为15～25mmol/l；
[0034]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为1％～3％
[0035]
一些实施例中，该培养基(stage 2培养基)中，
[0036]
所述fgf7的浓度为50ng/ml、
[0037]
所述抗坏血酸的浓度为0.25mmol/l、
[0038]
所述碳酸氢钠的浓度为3g/l、
[0039]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l、
[0040]
所述葡萄糖的浓度为20mmol/l、
[0041]
所述bsa的质量分数为2％。
[0042]
所述培养基(stage 2培养基)的基础培养基为mcdb131培养基。
[0043]
所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。基础培养基为粉末培养基时以无菌水或mcdb131培养基稀释，使用滤器灭菌。
[0044]
此培养基(stage 2培养基)在诱导内胚层细胞向原肠管分化中的应用。
[0045]
一种诱导内胚层细胞向原肠管分化的方法，以上述的培养基(stage 2培养基)诱导内胚层细胞向原肠管分化；优选的，所述诱导的时间为2d～3d。
[0046]
本发明中，所述诱导的时间为2d，每天更换新鲜培养基。
[0047]
经过诱导分化的内胚层细胞变得更加致密和厚实，并且叠层生长，可以看到细胞的核质比几乎消失不见，细胞之间的间隙呈现隆起状形态。
[0048]
为了保证分化的高效进行，所述内胚层细胞的sox17/dapi(免疫荧光)，表达率应高于85％。
[0049]
经过诱导后，以foxa2和hnf1b作为标志物，为了提高后续诱导的效率，诱导获得原肠管中，foxa2的表达率不低于90％，hnf1b的表达率不低于85％。研究表明，采用fgf7与抗坏血酸联合对内胚层细胞进行诱导，诱导的效率更高，所得原肠管的细胞数量较大、foxa2和hnf1b的阳性率更高，显著高于单独采用fgf7或抗坏血酸，p<0.05。
[0050]
在原肠管向后前肠分化阶段，本发明提供了：
[0051]
抗坏血酸、fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、its-x中至少一种在制备诱导原肠管向后前肠分化的制剂中的应用。
[0052]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，抗坏血酸、fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、its-x中至少一种作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，抗坏血酸、fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、its-x中至少一种分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为原肠管向后前肠分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0053]
一种培养基(stage 3培养基)，由基础培养基、抗坏血酸、fgf7、sant-1、ra、ldn193189和tpb、its-x、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)(bsa)组成。
[0054]
该培养基(stage 3培养基)中，
[0055]
所述fgf7的浓度为45ng/ml～55ng/ml；
[0056]
所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l；
[0057]
所述sant-1的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l；
[0058]
所述ra的浓度为0.8μmol/l～1.2μmol/l；
[0059]
所述its-x的浓度为1mmol/l～4mmol/l；
[0060]
所述ldn193189的浓度为80nmol/l～120nmol/l；
[0061]
所述tpb的浓度为180nmol/l～220nmol/l；
[0062]
所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、
[0063]
所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、
[0064]
所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、
[0065]
所述bsa的质量分数为1％～3％。
[0066]
一些实施例中，所述培养基(stage 3培养基)中，
[0067]
所述fgf7的浓度为50ng/ml；
[0068]
所述抗坏血酸的浓度为0.25mmol/l；
[0069]
所述sant-1的浓度为0.25mmol/l；
[0070]
所述ra的浓度为1.0μmol/l；
[0071]
所述its-x的浓度为2mmol/l；
[0072]
所述ldn193189的浓度为100nmol/l；
[0073]
所述tpb的浓度为200nmol/l；
[0074]
所述碳酸氢钠的浓度为3g/l、
[0075]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l、
[0076]
所述葡萄糖的浓度为20mmol/l、
[0077]
所述bsa的质量分数为2％。
[0078]
该培养基(stage 3培养基)的基础培养基为mcdb131培养基。
[0079]
所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。基础培养基为粉末培养基时以无菌水或mcdb131培养基稀释，使用滤器灭菌。
[0080]
此培养基(stage 3培养基)在诱导原肠管向后前肠分化中的应用。
[0081]
一种诱导原肠管向后前肠分化的方法，以培养基(stage 3培养基)诱导原肠管向
后前肠分化；优选的，所述诱导的时间为2d～3d。
[0082]
一些实施例中，所述诱导的时间为2d，每天更换新鲜培养基。
[0083]
经过诱导后，底层平铺细胞逐渐变薄，球状以及椭球状结构逐渐增多。
[0084]
经诱导后，以pdx1+/hnf6/sox9/dapi为标志物，其表达率不低于85％，则进一步的诱导可高效进行；研究表明，采用抗坏血酸、fgf7、sant-1ra、ldn193189、tpb、its-x共同诱导原肠管向后前肠分化的效率较高，各组分互相配合，起到良好的增效协同作用，研究表明，在本发明提供的配比和浓度下，各因子的协同作用达到最佳。
[0085]
在后前肠向胰腺祖细胞分化阶段，本发明提供了：
[0086]
fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、抗坏血酸、its-x中至少一种在制备诱导后前肠向胰腺祖细胞分化的制剂中的应用。
[0087]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、抗坏血酸、its-x中至少一种作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，fgf7、sant-1、ra、ldn193189、tpb、抗坏血酸、its-x中至少一种分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为诱导后前肠向胰腺祖细胞分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0088]
一种培养基(stage 4培养基)，由基础培养基、fgf7、sant-1、ra、ldn193189和tpb组成、抗坏血酸、its-x、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)。
[0089]
该培养基(stage 4培养基)中，
[0090]
所述fgf7的浓度为1ng/ml～3ng/ml；
[0091]
所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l；
[0092]
所述sant-1的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l；
[0093]
所述ra的浓度为0.08μmol/l ～0.12μmol/l；
[0094]
所述its-x的浓度为1mmol/l～4mmol/l；
[0095]
所述ldn193189的浓度为180nmol/l～220nmol/l；
[0096]
所述tpb的浓度为80nmol/l～120nmol/l；
[0097]
所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、
[0098]
所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、
[0099]
所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、
[0100]
所述bsa的浓度为1％～3％。
[0101]
一些实施例中，所述培养基(stage 4培养基)中，
[0102]
所述fgf7的浓度为2ng/ml；
[0103]
所述抗坏血酸的浓度为0.25mmol/l；
[0104]
所述sant-1的浓度为0.25mmol/l；
[0105]
所述ra的浓度为0.1μmol/l；
[0106]
所述its-x的浓度为2mmol/l；
[0107]
所述ldn193189的浓度为200nmol/l；
[0108]
所述tpb的浓度为100nmol/l；
[0109]
所述碳酸氢钠的浓度为3g/l、
[0110]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l、
[0111]
所述葡萄糖的浓度为20mmol/l、
[0112]
所述bsa的质量分数为2％。
[0113]
该培养基(stage 4培养基)的基础培养基为mcdb131培养基。所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。基础培养基为粉末培养基时以无菌水或mcdb131培养基稀释，使用滤器灭菌。
[0114]
此培养基(stage 4培养基)在诱导后前肠向胰腺祖细胞分化中的应用。
[0115]
一种诱导后前肠向胰腺祖细胞分化的方法，以培养基(stage 4培养基)诱导原肠管向后前肠分化；优选的，所述诱导的时间为3d～5d。
[0116]
一些实施例中，所述诱导的时间为3d，每天更换新鲜培养基。
[0117]
经诱导后，底层平铺细胞继续变薄甚至脱落，条索状、球状以及椭球状结构继续大量增多。经诱导，以pdx1+/nkx6.1/sox9/dapi为标志物，为了保证所获得胰腺祖细胞的品质，对所得pdx1和nkx6.1的抗体进行了免疫荧光染色检测，其中，pdx1阳性率不低于90％，而nkx6.1的阳性率不低于85％，pdx1与nkx6.1双阳率不低于60％。说明，本发明提供的培养基中各组分相互配合，起到了良好的增效协同作用，而研究表明，在本发明提供的配比和浓度下，各因子的协同作用达到最佳。
[0118]
在胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化阶段，本发明提供了：
[0119]
san-t、维甲酸(ra)、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠中至少一种在制备促进胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化的制剂中的应用。
[0120]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，san-t、维甲酸(ra)、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠中至少一种作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，san-t、维甲酸(ra)、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠中至少一种分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0121]
一种培养基(stage 5培养基)，由基础培养基、san-t、维甲酸(ra)、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)、组成。
[0122]
该培养基(stage 5培养基)中，
[0123]
所述san-t的浓度为0.2μmol/l～0.3μmol/l；
[0124]
所述维甲酸(ra)的浓度为0.04μmol/l～0.06μmol/l；
[0125]
所述ldn193189的浓度为80nmol/l～120nmol/l；
[0126]
所述its-x的浓度为1.5mmol/l～2.5mmol/l；
[0127]
所述t3的浓度为0.8μmol/l～1.2μmol/l；
[0128]
所述alk5抑制剂ii的浓度为8μmol/l～12μmol/l；
[0129]
所述硫酸锌的浓度为8μmol/l～12μmol/l
[0130]
所述肝素钠的浓度为8μg/ml～12μg/ml；
[0131]
所述碳酸氢钠的浓度为2～4g/l；
[0132]
所述谷氨酰胺的浓度为1～3mmol/l(100
×
)；
[0133]
所述葡萄糖15～25mmol/l；
[0134]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的浓度为1％～3％。
[0135]
一些实施例中，所述培养基(stage 5培养基)中，
[0136]
所述san-t的浓度为0.25μmol/l；
[0137]
所述维甲酸的浓度为0.05μmol/l；
[0138]
所述ldn193189的浓度为100nmol/l；
[0139]
所述its-x的浓度为2mmol/l。
[0140]
所述t3的浓度为1μmol/l；
[0141]
所述alk5抑制剂ii的浓度为10μmol/l；
[0142]
所述硫酸锌的浓度为10μmol/l。
[0143]
所述肝素钠的浓度为10μg/ml；
[0144]
所述碳酸氢钠的浓度为3g/l；
[0145]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l(100
×
)；
[0146]
所述葡萄糖20mmol/l；
[0147]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为2％。
[0148]
此培养基(stage 5培养基)的基础培养基为mcdb131培养基。所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。基础培养基为粉末培养基时以无菌水稀释。
[0149]
此培养基(stage 5培养基)在诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化中的应用。
[0150]
一种诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化的方法，其以培养基(stage 5培养基)诱导胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化；优选的，所述诱导的时间为3d～5d。
[0151]
一些实施例中，所述诱导的时间为3d，每天更换新鲜培养基。
[0152]
经诱导后，细胞呈悬浮的球状小体生长。以pdx1+/nkx6.1/neurog3/neurog1/dapi为标志物，为了保证所获得胰腺祖细胞的品质，对所得pdx1和nkx6.1的抗体进行了免疫荧光染色检测，其中，pdx1阳性率不低于70％，而nkx6.1的阳性率不低于80％，pdx1与nkx6.1双阳率不低于45％。说明，本发明提供的培养基中各组分相互配合，起到了良好的增效协同作用，而研究表明，在本发明提供的配比和浓度下，各因子的协同作用达到最佳。
[0153]
在内分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化的阶段，本发明提供了：
[0154]
ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂、肝素钠中至少一种在制备促进内分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化的制剂中的应用。
[0155]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂、肝素钠中至少一种作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂、肝素钠中至少一种分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为诱导内分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0156]
一种培养基(stage 6培养基a)，由基础培养基、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌和γ-分泌酶抑制剂、肝素钠、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)组成。
[0157]
该培养基(stage 6培养基a)中，
[0158]
所述ldn193189的浓度为80nmol/l～120nmol/l、
[0159]
所述γ-分泌酶抑制剂的浓度为80nmol/l～120nmol/l、
[0160]
所述its-x的浓度为1.8mmol/l～2.2mmol/l、
[0161]
所述t3的浓度为0.8μmol/l～1.2μmol/l、
[0162]
所述alk5抑制剂ii的浓度为8μmol/l～12μmol/l、
[0163]
所述硫酸锌的浓度为8μmol/l～12μmol/l、
[0164]
所述肝素钠的浓度为8μg/ml～12μg/ml；
[0165]
所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、
[0166]
所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、
[0167]
所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、
[0168]
所述bsa的浓度为1％～3％。
[0169]
一些实施例中，所述培养基(stage 6培养基a)中，
[0170]
所述ldn193189的浓度为100nmol/l；
[0171]
所述its-x的浓度为2mmol/l。
[0172]
所述t3的浓度为1μmol/l；
[0173]
所述alk5抑制剂ii的浓度为10μmol/l；
[0174]
所述硫酸锌的浓度为10μmol/l；
[0175]
所述γ-分泌酶抑制剂的浓度为100nmol/l。
[0176]
所述肝素钠的浓度为10μg/ml；
[0177]
所述碳酸氢钠的浓度为1.5g/l；
[0178]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l(100
×
)；
[0179]
所述葡萄糖20mmol/l；
[0180]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为2％。
[0181]
一种培养基(stage 6培养基b)，由基础培养基、ldn193189、its-x、t3、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa(胎牛白蛋白)组成。
[0182]
所述ldn193189的浓度为80nmol/l～120nmol/l、
[0183]
所述its-x的浓度为1.8mmol/l～2.2mmol/l、
[0184]
所述alk5抑制剂ii的浓度为8μmol/l～12μmol/l、
[0185]
所述硫酸锌的浓度为8μmol/l～12μmol/l、
[0186]
所述肝素钠的浓度为8μg/ml～12μg/ml；
[0187]
所述碳酸氢钠的浓度为2g/l～4g/l、
[0188]
所述谷氨酰胺的浓度为1mmol/l～3mmol/l、
[0189]
所述葡萄糖的浓度为15mmol/l～25mmol/l、
[0190]
所述bsa的质量分数为1％～3％。
[0191]
一些实施例中，所述培养基(stage 6培养基b)中，
[0192]
所述ldn193189的浓度为100nmol/l；
[0193]
所述its-x的浓度为2mmol/l。
[0194]
所述alk5抑制剂ii的浓度为10μmol/l；
[0195]
所述硫酸锌的浓度为10μmol/l；
[0196]
所述肝素钠的浓度为10μg/ml；
[0197]
所述碳酸氢钠的浓度为1.5g/l；
[0198]
所述谷氨酰胺的浓度为2mmol/l(100
×
)；
[0199]
所述葡萄糖20mmol/l；
[0200]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为2％。
[0201]
此培养基(stage 6培养基a或b)的基础培养基为mcdb131培养基。所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。基础培养基为粉末培养基时以无菌水稀释。
[0202]
此培养基(stage 6a和stage 6b培养基)在诱导分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化中的应用。
[0203]
一种诱导分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，以培养基(stage 6a培养基和stage 6b)诱导分泌前体细胞向幼稚胰岛细胞分化；优选的，所述诱导的时间分别为7d～10d。
[0204]
一些实施例中，所述stage 6a和stage 6b培养基诱导的时间分别为7d，总共14天。即：诱导前7天使用stage 6培养基a；诱导后7天，使用stage 6培养基b，每天更换新鲜培养基。
[0205]
经诱导后，悬浮的球状越来越致密，同时数目也变少。这一阶段的胰岛能够分泌胰岛素，但刺激胰岛素释放的信号通路还没有形成，因此，对于外周的葡萄糖刺激不能够释放胰岛素。由于培养体系中有胰岛素(its-x)成分存在，因此检测细胞培养上清液中的胰岛素以及血糖刺激后的胰岛素，会有误差。c-peptide和胰岛素是一个分泌多肽的两段，而培养环境中，没有c-peptide。小体内部细胞表达胰岛β细胞的标志基因insulin、pdx-1和nkx6.1，其中insulin阳性的细胞比例可以高达30％左右；nkx6.1阳性的细胞比例可以高达60％左右，pdx-1阳性的细胞比例70％。
[0206]
以上结果说明，本发明提供的培养基中各组分相互配合，起到了良好的增效协同作用，而研究表明，在本发明提供的配比和浓度下，各因子的协同作用达到最佳。
[0207]
在幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化的阶段，本发明提供了：
[0208]
its-x、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠、t3、n-乙酰半胱氨酸、trolox、r428中至少一种在制备幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化的制剂中的应用。
[0209]
所述制剂为培养基或培养基添加物，当所述制剂为培养基时，its-x、alk5抑制剂ii、硫酸锌、肝素钠、t3、n-乙酰半胱氨酸、trolox、r428中至少一种作为组分存在于培养基中；当所述制剂为培养基添加物时，its-x、alk5抑制剂ii、硫酸锌、、肝素钠、t3、n-乙酰半胱氨酸、trolox、r428中至少一种分别独立存在，或混合共同形成制剂，在诱导时添加入培养基中，作为诱导幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化的诱导剂。所述制剂中可含有辅料，所述辅料包括但不限于水。
[0210]
一种培养基(stage 7培养基)，由基础培养基、its-x、alk5抑制剂ii、硫酸锌、t3、肝素钠、n-乙酰半胱氨酸、trolox、r428、碳酸氢钠、谷氨酰胺(glutamax)、葡萄糖、脱脂bsa组成。
[0211]
该培养基(stage 7培养基)中，
[0212]
所述its-x的浓度为1～4mmol/l
[0213]
所述alk5抑制剂ii的浓度为8μmol/l～12μmol/l；
[0214]
所述硫酸锌的浓度为8μmol/l～12μmol/l；
[0215]
所述t3的浓度为0.8μmol/l～1.2μmol/l；
[0216]
所述肝素钠的浓度为5～15ug/ml；10ug/ml
[0217]
所述n-乙酰半胱氨酸的浓度为0.8mmol/l～1.2mmol/l；
[0218]
所述trolox的浓度为8μmol/l～12μmol/l；
[0219]
所述r428的浓度为1.8μmol/l～2.2μmol/l。
[0220]
所述碳酸氢钠的浓度为2～4g/l；
[0221]
所述谷氨酰胺的浓度为1～3mmol/l(100x)；
[0222]
所述葡萄糖15～25mmol/l；
[0223]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为1-3％
[0224]
一些实施例中，所述培养基(stage 7培养基)中，
[0225]
所述its-x的浓度为2mmol/l
[0226]
所述alk5抑制剂ii的浓度为10μmol/l；
[0227]
所述硫酸锌的浓度为10μmol/l；
[0228]
所述t3的浓度为1μmol/l；
[0229]
所述肝素钠的浓度为10ug/ml；
[0230]
所述n-乙酰半胱氨酸的浓度为1mmol/l；
[0231]
所述trolox的浓度为10μmol/l；
[0232]
所述r428的浓度为2μmol/l。
[0233]
所述碳酸氢钠的浓度为2～4g/l；
[0234]
所述谷氨酰胺的浓度为1～3mmol/l(100x)；
[0235]
所述葡萄糖15～25mmol/l；
[0236]
所述脱脂bsa(胎牛白蛋白)的质量分数为2％
[0237]
此培养基(stage7培养基)的基础培养基为mcdb131培养基。
[0238]
所述mcdb131培养基为液体培养基或粉末培养基。
[0239]
基础培养基为粉末培养基时以无菌水或mcdb131稀释，采用滤器灭菌。
[0240]
此培养基(stage 7培养基)在诱导幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化中的应用。
[0241]
一种诱导幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，以培养基(stage 7培养基)诱导幼稚胰岛细胞向成熟胰岛细胞分化；优选的，所述诱导的时间为14d～18d。
[0242]
一些实施例中，所述诱导的时间为14d，每天更换新鲜培养基。
[0243]
经诱导后，细胞形成致密的悬浮球状体。stage7诱导结束的成熟类胰岛小体高度类似成体胰岛小体。小体内部细胞高度表达胰岛β细胞的标志基因insulin和mafa，其中insulin阳性的细胞比例可以高达60％左右；mafa和insulin双阳性的细胞比例可以高达50％左右。小体外部细胞则显著达胰岛α细胞的标志基因glucagon，占小体总细胞数30％左右。(如下图)在结构上和细胞组成上，诱导的胰岛与成体胰岛组织高度一致。
[0244]
另外针对stage7晚期胰岛进行的体外胰岛素分泌检测实验显示，stage7晚期胰岛能够很好地在体外水平响应高浓度葡萄糖刺激而分泌出两倍以上的胰岛素(相较于低糖水平的基础胰岛素分泌量)，说明此阶段时的胰岛细胞已经具备了很好的分泌功能，分化成熟。
[0245]
根据上述7个分化阶段，本发明提供了
[0246]
一种培养基组合：
[0247]
由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基中至少2种组成；
[0248]
或由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基与γ-分泌酶抑制剂的组合物、stage7培养基与γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428的组合物中至少2种组成。
[0249]
具体的：
[0250]
一种诱导ips细胞向原肠管细胞分化的方法，该方法包括：
[0251]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0252]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管。
[0253]
本发明提供了一种诱导ips细胞向原肠管细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基组成。
[0254]
一种诱导ips细胞向后前肠细胞分化的方法，该方法包括：
[0255]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0256]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0257]
stage3：所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞。
[0258]
本发明提供了一种诱导ips细胞向后前肠细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基组成。
[0259]
一种诱导ips细胞向胰腺祖细胞分化的方法，该方法包括：
[0260]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0261]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0262]
stage3：所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0263]
stage4：所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞。
[0264]
一种诱导ips细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基和stage4培养基组成。
[0265]
一种诱导ips细胞向内分泌前体细胞分化的方法，该方法包括：
[0266]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0267]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0268]
stage3：所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0269]
stage4：所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0270]
stage5：所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞。
[0271]
本发明提供了一种诱导ips细胞向内分泌前体细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基组成。
[0272]
一种诱导ips细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0273]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0274]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0275]
stage3：所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0276]
stage4：所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0277]
stage5：所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0278]
stage6：所述内分泌前体细胞以stage6培养基a诱导7～10天，继续以stage6培养基b诱导7～10天获得幼稚胰岛细胞。
[0279]
本发明提供了一种诱导ips细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基和stage6培养基a、stage6培养基b组成；
[0280]
或由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基和γ-分泌酶抑制剂组成。
[0281]
一种诱导内胚层细胞向后前肠细胞分化的方法，该方法包括：
[0282]
所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0283]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞。
[0284]
本发明提供了一种诱导内胚层细胞向后前肠细胞分化的培养基组合，由stage2培养基、stage3培养基组成。
[0285]
一种诱导内胚层细胞向胰腺祖细胞分化的方法，该方法包括：
[0286]
所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0287]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0288]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞。
[0289]
本发明提供了一种诱导内胚层细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基组成。
[0290]
一种诱导内胚层细胞向内分泌前体细胞分化的方法，该方法包括：
[0291]
所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0292]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0293]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0294]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞。
[0295]
本发明提供了一种诱导内胚层细胞向内分泌前体细胞分化的培养基组合，由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基组成。
[0296]
一种诱导内胚层细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0297]
所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0298]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0299]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0300]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0301]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞。
[0302]
本发明提供了一种诱导内胚层细胞向原肠管细胞分化的培养基组合，由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b组成；
[0303]
或由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基和γ-分泌酶抑制剂组成。
[0304]
一种诱导内胚层细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0305]
所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0306]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0307]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0308]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0309]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0310]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0311]
本发明提供了一种诱导内胚层细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0312]
或由stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0313]
一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的方法，该方法包括：
[0314]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0315]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞。
[0316]
本发明提供了一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage3培养基、stage4培养基组成。
[0317]
一种诱导原肠管细胞向内分泌前体细胞分化的方法，该方法包括：
[0318]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0319]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0320]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞。
[0321]
本发明提供了一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基组成。
[0322]
一种诱导原肠管细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0323]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0324]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0325]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0326]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞。
[0327]
本发明提供了一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基和stage6培养基a、stage6培养基b组成；
[0328]
或由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基和γ-分泌酶抑制剂组成。
[0329]
一种诱导原肠管细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0330]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0331]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0332]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0333]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0334]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0335]
本发明提供了一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b、和stage7培养基组成；
[0336]
或由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0337]
一种诱导原肠管细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0338]
所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0339]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0340]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0341]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0342]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0343]
本发明提供了一种诱导原肠管细胞向胰腺祖细胞分化的培养基组合，由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0344]
或由stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0345]
一种诱导后前肠细胞向内分泌前体细胞分化的方法，该方法包括：
[0346]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0347]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞。
[0348]
本发明提供了一种诱导后前肠细胞向内分泌前体细胞分化的培养基组合，由stage4培养基和stage5培养基组成。
[0349]
一种诱导后前肠细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0350]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0351]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0352]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞。
[0353]
本发明提供了一种诱导后前肠细胞向幼稚胰岛细胞分化的培养基组合，由stage4培养基、stage5培养基和stage6培养基a、stage6培养基b组成；
[0354]
或由stage4培养基、stage5培养基和γ-分泌酶抑制剂组成。
[0355]
一种诱导后前肠细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0356]
所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0357]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0358]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0359]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0360]
本发明提供了一种诱导后前肠细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0361]
或由stage4培养基、stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0362]
一种诱导胰腺祖细胞向幼稚胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0363]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0364]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞。
[0365]
本发明提供了一种诱导后前肠细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage5培养基和stage6培养基a、stage6培养基b组成；
[0366]
或由stage5培养基和γ-分泌酶抑制剂组成。
[0367]
一种诱导胰腺祖细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0368]
所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0369]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0370]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0371]
本发明提供了一种诱导胰腺祖细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0372]
或由stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0373]
一种诱导内分泌前体细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，该方法包括：
[0374]
所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导14～18天获得幼稚胰岛细胞；
[0375]
所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0376]
本发明提供了一种诱导内分泌前体细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0377]
或由stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0378]
一种诱导ips细胞向成熟胰岛细胞分化的方法，将ips细胞经诱导依次形成内胚层细胞、原肠管、后前肠、胰腺祖细胞、内分泌前体细胞、幼稚胰岛细胞、成熟胰岛细胞。
[0379]
具体的，该方法包括：
[0380]
stage1：以stage1培养基a诱导ips细胞1d，然后以stage1培养基b继续诱导2天，获得内胚层细胞；
[0381]
stage2：所述内胚层细胞以stage2培养基诱导2～3天获得原肠管；
[0382]
stage3：所述原肠管以stage3培养基诱导2～3天获得后前肠细胞；
[0383]
stage4：所述后前肠细胞以stage4培养基诱导3～5天获得胰腺祖细胞；
[0384]
stage5：所述胰腺祖细胞细胞以stage5培养基诱导3～5d获得内分泌前体细胞；
[0385]
stage6：所述内分泌前体细胞以stage6培养基诱导7-10天，继续使用stage6培养基b诱导7-10天获得幼稚胰岛细胞；
[0386]
stage7：所述幼稚胰岛细胞以stage7培养基诱导14～18天获得成熟胰岛细胞。
[0387]
该方法中，对内胚层细胞、原肠管、后前肠细胞的诱导无须经过重悬，而在stage4结束后，需用胰酶或/和细胞刮对细胞团进行消化和悬浮培养，再进行诱导获得内分泌前体细胞；内分泌前体细胞、幼稚胰岛细胞继续悬浮培养进行诱导获得成熟胰岛细胞。
[0388]
stage1中，所述诱导的容器经过matrige1铺板。所述铺板的条件为：e8完全培养基存在条件下，37℃，5％co
2
静置1-2d。
[0389]
stage5、6、7中，重悬后转移至低亲赴孔板里一直到培养结束。
[0390]
该方法中，在第五步诱导的培养基中添加了γ-分泌酶抑制剂，显著提高了胰岛素阳性细胞响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的能力，且移植到体内之后可以改善糖尿病大鼠的高血糖状态。此外，通过降低stage4中培养外液中葡萄糖的浓度，以及在stage4后用胰酶对细胞团进行消化和悬浮培养，并延长培养时间至stage6，不仅显著提高了胰岛素阳性细胞的数目，而且其胰岛素分泌能力相较于stage5也增加了近30倍。同时，通过在各个关键步
骤，添加小分子药物，并于关键节点检测标志基因的表达，从而实现逐步诱导和精准的质量控制。
[0391]
一些具体实施例中，stage1的诱导时间为3d；stage2的诱导时间为2d；stage3的诱导时间为2d；stage4的诱导时间为3d；stage5的诱导时间为3d；stage6的诱导时间为14d；stage7的诱导时间为14d；每天更换新鲜培养基。
[0392]
本发明提供了一种诱导ips细胞向成熟胰岛细胞分化的培养基组合，由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、stage6培养基a、stage6培养基b和stage7培养基组成；
[0393]
或由stage1培养基a、stage1培养基b、stage2培养基、stage3培养基、stage4培养基、stage5培养基、γ-分泌酶抑制剂、n-乙酰半胱氨酸、trolox和r428组成。
[0394]
如无特殊说明，本发明所述诱导的条件为：37℃，5％co
2
，静置培养。
[0395]
本发明所述方法制得的成熟胰岛细胞。
[0396]
经本发明提供的方法诱导结束的成熟胰岛细胞高度类似成体胰岛小体。小体内部细胞高度表达胰岛β细胞的标志基因insulin和mafa，其中insulin阳性的细胞比例可以高达60％左右；mafa和insulin双阳性的细胞比例可以高达50％左右。小体外部细胞则显著达胰岛α细胞的标志基因glucagon，占小体总细胞数30％左右。在结构上和细胞组成上，诱导的胰岛与成体胰岛组织高度一致。
[0397]
本发明提供的成熟胰岛细胞在制备治疗糖尿病的制剂中的应用。
[0398]
本发明针对获得的成熟胰岛细胞进行的体外胰岛素分泌检测实验显示，该成熟胰岛细胞能够很好地在体外水平响应高浓度葡萄糖刺激而分泌出两倍以上的胰岛素(相较于低糖水平的基础胰岛素分泌量)，说明此阶段时的胰岛细胞已经具备了很好的分泌功能，分化成熟。
[0399]
本发明还提供了一种治疗糖尿病的制剂，其含有本发明所述的成熟胰岛细胞。
[0400]
本发明制得的成熟胰岛细胞聚集成为胰岛小体，所述的治疗糖尿病的制剂中胰岛小体以生理盐水分散，分散至胰岛小体的密度为40个/μl。
[0401]
本发明还提供了一种治疗糖尿病的方法，其为给予本发明所述的治疗糖尿病的制剂。
[0402]
本发明还提供了诱导ips细胞向成熟胰岛细胞分化的质量控制方法，所述质量控制的项目包括：
[0403]
ips细胞的核质比、核型、全外显子和/或标志物表达；
[0404]
内胚层细胞的sox17和/或foxa2阳性表达率；
[0405]
原肠管细胞的foxa2和/或hnf1b阳性表达率；
[0406]
后前肠细胞的pdx1和/或sox9的阳性表达率；
[0407]
胰腺祖细胞的pdx1、nkx6.1和/或sox9、hnf1b的阳性表达率；
[0408]
内分泌前体细胞的pdx1、nkx6.1、的阳性表达率；
[0409]
幼稚胰岛细胞的pdx1、nkx6.1、insulin和/或neurod1的阳性表达率；
[0410]
成熟胰岛细胞的、insulin、glucagon、mafa、c-peptide的阳性表达率。
[0411]
本发明提供的分化方法中，从ips干细胞到胰腺祖细胞的分化过程需要14天(2周)的时间。主要分为四个步骤：定向内胚层
→
原肠管
→
后前肠
→
胰腺祖细胞。从胰腺祖细胞到
功能性胰岛的分化过程大约需要31天(1个月)的时间。主要分为三步：内分泌祖细胞
→
早期胰岛
→
晚期功能成熟的胰岛。上述各个步骤都需要特定的诱导培养基，这些培养基由基础培养基添加相应的诱导因子而实现，并且需要每天更换相应的诱导培养基进行培养。该方法诱导全程不需要饲养层细胞，所采用的培养基中也不含有任何动物源的成分，降低了异源免疫风险。因此，该方法更安全、可重复性强，所得细胞可直接应用于动物体或人体的回输。实验表明，本申请提供方法制得的成熟胰岛细胞mafa和insulin双阳性的细胞比例可以高达50％左右。小体外部细胞则显著达胰岛α细胞的标志基因glucagon，占小体总细胞数30％左右。动物实验表明，随着植入时间的延长，回输该细胞的模型小鼠体内，c-peptide的分泌量逐渐增加，说明胰岛素水平得到了显著提高。
附图说明
[0412]
图1示干细胞定向诱导分化为胰岛以及胰岛β细胞过程中，每一步所对应的需要调控的信号通路；
[0413]
图2示本发明方案诱导分化的7个步骤；
[0414]
图3示本发明采用的ips细胞的显微图，其中，3-a示第一天的ips细胞；3-b示第一天的ips细胞；3-c示第一天的ips细胞；
[0415]
图4示stage1诱导的细胞，其中，4-a示诱导的1天后的细胞，4-b示诱导3天后的细胞；
[0416]
图5示stage1诱导细胞的免疫荧光检测结果，其中，5-a示sox17的荧光；5-b示dapi的荧光，5-c示叠加的荧光图，5-d示sox19的表达率；5-e示dapi的荧光；5-f示foxa2的荧光，5-g示叠加的荧光图，5-h示foxa2的表达率；
[0417]
图6示stage2诱导的细胞，其中，6-a示诱导的1天后的细胞，6-b示诱导3天后的细胞；
[0418]
图7示stage2诱导后细胞的免疫荧光检测，其中，7-a示foxa2的荧光；7-b示dapi的荧光，7-c示叠加的荧光图，7-d示foxa2的表达率；7-e示hnf1b的荧光；7-f示dapi的荧光，7-g示叠加的荧光图；
[0419]
图8示stage3诱导的细胞，其中，8-a示诱导的2天后的细胞放大10倍，8-b示诱导2天后的细胞放大20倍；
[0420]
图9示stage3诱导后细胞的免疫荧光检测；
[0421]
图10示stage4诱导的细胞，其中，10-a示诱导的3天后的细胞放大10倍，10-b示诱导3天后的细胞放大40倍；
[0422]
图11示stage4诱导后细胞的免疫荧光检测；其中，11-a示pdx1的荧光；11-b示nkx6.1的荧光；11-c示dapi的荧光；11-d示叠加的荧光图；11-e示放大的pdx1的荧光；11-f示放大的nkx6.1的荧光；11-g示放大的dapi的荧光；11-h示标志物的表达；
[0423]
图12示stage5诱导的细胞，其中，12-a示stage5诱导前(即stage4的第3天)的细胞，12-b示stage5诱导1天后的细胞，12-c示stage5诱导3天后的细胞；
[0424]
图13示经stage5诱导后细胞的免疫荧光检测；其中，13-a示pdx1的荧光；13-b示nkx6.1的荧光；13-c示dapi的荧光；13-d示叠加的荧光图；13-e示放大的pdx1的荧光；13-f示放大的nkx6.1的荧光；13-g示放大的dapi的荧光；13-h示标志物的表达；
[0425]
图14示stage6诱导的细胞，其中，14-a stage6诱导7天后的细胞，14-b示stage6诱导14天后的细胞；
[0426]
图15示经stage6诱导后细胞的免疫荧光检测；其中，15-a示pdx1的荧光；15-b示nkx6.1的荧光；15-c示dapi的荧光；15-d示pdx1与nkx6.1的表达；15-e示放大的pdx1的荧光；15-f示insulin的荧光；15-g示放大的dapi的荧光；15-h示15-e～15-g叠加的荧光；15-i示pdx1与insulin的荧光表达；15-j示放大的nkx6.1的荧光；15-k示insulin的荧光；15-l示放大的dapi的荧光；15-m示15-e～15-g叠加的荧光；15-n示nkx6.1与insulin的荧光表达；
[0427]
图16示体外葡萄糖刺激下，实施例6获得的幼稚胰岛细胞的免疫荧光检测，其中，16-a示insulin的荧光；16-b示dapi的荧光；16-c示叠加的荧光；16-d示胰岛素的z-stack movie检测；16-e示胰岛素分泌、激活情况检测结果；
[0428]
图17示幼稚胰岛体外葡萄糖刺激下c-peptide检测；17-a示检测方法，17-b示检测结果；
[0429]
图18示stage7诱导的细胞，其中，18-a stage7诱导3天后的细胞，18-b示stage7诱导10天后的细胞；18-c示stage7诱导18天后的细胞；
[0430]
图19示stage7诱导的细胞的免疫荧光检测，其中19-a示insulin的荧光，19-b示c-peptide的荧光，19-c示insulin与c-peptide的叠加荧光；19-d示glucagon的荧光，19-e示insulin的荧光，19-f示insulin与glucagon的叠加荧光；
[0431]
图20示stage7诱导的细胞的免疫荧光检测；其中，20-a示mafa的荧光；20-b示insulin的荧光，20-b示mafa与insulin荧光的叠加；20-d示insulin与c-peptide的表达；20-e示glucagon与insulin的表达；20-e示mafa与insulin的表达；
[0432]
图21示成熟胰岛体外葡萄糖刺激下c-peptide检测；21-a示检测方法，21-b示检测结果。
[0433]
图22示成熟胰岛体内功能鉴定；21-a示造模后血糖水平，21-b示移植后小鼠血糖水平。
具体实施方式
[0434]
本发明提供了培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0435]
本发明方案诱导ips细胞经过的阶段包括：
[0436]
内胚层(definitive endoderm)在发明中，亦称做定向内胚层、内胚层细胞、定向内胚层细胞；
[0437]
原肠管(primitive gut tube)在发明中，亦称做原肠管细胞；
[0438]
后前肠(posterior foregut)在发明中，亦称做后前肠细胞；
[0439]
胰腺祖细胞，英文名称为pancreatic progenitors；
[0440]
内分泌前体细胞(endocrine precursors)在发明中，亦称做内分泌祖细胞；
[0441]
幼稚胰岛(immature beta cells)在发明中，亦称做早期胰岛；
[0442]
成熟胰岛(maturing beta cells)在发明中，亦称做晚期功能成熟的胰岛、晚期成熟胰岛细胞或胰岛小体。
[0443]
本发明中，基础培养基为mcdb131培养基，来自赛默飞世尔，货号10372019。本发明采用的小分子诱导剂包括：
[0444]
gdf8(growth and differentiation factor 8)，是tgf-β家族的成员之一，。调节发育ips多能性及细胞命运决定过程
[0445]
chir-99021是一种糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,gsk)3β抑制剂。
[0446]
成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor 7，fgf7)，也称做角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)，促进细胞增殖分化。
[0447]
抗坏血酸(ascorbic acid)，又称为维生素c、维他命，c是一种抗氧化剂。
[0448]
sant-1是对smoothened蛋白最具拮抗效应的分子，该小分子主要抑制shh通路，该通路的抑制是早期内胚层胰腺特化的先决条件。
[0449]
ra，全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ra)，是重要的细胞外信号，在本发明中，亦称做维甲酸(retinoic acid)。
[0450]
ldn193189是一种选择性的bmp信号通路抑制剂，抑制bmp i型受体alk2和alk3的转录活性。
[0451]
tppb(tpb)是苯并内酰胺衍生的可渗透细胞的蛋白激酶c(pkc)活化物无脂肪酸牛血清白蛋白(fatty acid free bsa)，其中总脂质和脂肪酸含量极低，不含有igg。
[0452]
its-x，胰岛素-转铁蛋白-硒-x添加剂。
[0453]
t3，三碘甲状腺原氨酸，是甲状腺激素的主要活性成分。
[0454]
alk5抑制剂ii(alk5 inhibitor ii)，alk5是tgf-β信号传导的关键性节点，alk5抑制剂ii用以阻断该通路。
[0455]
硫酸锌，英文名称为zinc sulfate。
[0456]
γ-分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor)，主要抑制notch通路，促使ngn3表达，促使早期胚胎胰腺上皮细胞向内分泌腺谱系的转变，cas 209984-56-5。
[0457]
n-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine)又名乙酰半胱氨酸；n-乙酰-l-半胱氨酸。
[0458]
trolox，水溶性维生素e，具有良好的抗氧化能力。
[0459]
目前，体细胞重编程技术得到迅猛发展。一方面，诱导因子的配伍及种类在不断地进行尝试探索，从标准oskm1到os,nanog,lin28，再到osk,l-myc,lin28，同时新的诱导因子也在不断涌现，如rars,lrh1,asf1a,glis17。另一方面，表达载体体系也在不断地进行开发改良，从最初的逆转录病毒表达体系到dna质粒表达载体，再到rna表达载体。最终目的都在于提高体细胞重编程技术的高效性和安全性，以便为最终的临床应用提供技术保障。研究已经证明，不同来源的ips的功能直接影响了分化的方向和诱导效率。因此，验证ips是否合适诱导成胰岛是保证本发明方案是否能够顺利进行的第一个阶段。本发明ips细胞的构建方法使用商业化试剂盒epi5
tm
episomal ipsc reprogramming kit(赛默飞世尔，货号a15960)，对ips细胞的验证包括：
[0460]
morphology检查(核质比)、核型、全外显子、marker的表达oct4,nanog,tra60,ssea4(免疫荧光和流式检测)ap染色、eb后检测三胚层的marker、检测重编程质粒残留(pcr)。
[0461]
经鉴定，适合进行胰岛细胞诱导的ips细胞集落边界明显，边界光滑折光度高，集落内细胞全部致密化，细胞界限消失，核质比高，核仁明显符合人类ips形态特征。典型的图例如图3。
[0462]
诱导的第一个阶段结束，细胞的核质比显著降低，并且细胞之间接触之处存在明显界限。用sox17(绿色)foxa2(红色)作为内胚层的标记物，内胚层的阳性率要高于90％。
[0463]
诱导的第二个阶段结束，细胞变得更加致密和厚实，并且叠层生长，可以看到细胞的核质比几乎消失不见，细胞之间的间隙呈现隆起状形态。用foxa2(红色)、hnf1b(绿色)作为原肠管的标志物，foxa2阳性率应不低于90％，hnf1b阳性率应不低于80％。
[0464]
诱导的第三个阶段结束，底层平铺细胞逐渐变薄，球状以及椭球状结构逐渐增多，用sox9、pdx1作为后前肠的标志物，阳性率应不低于50％。
[0465]
诱导的第四个阶段结束，底层平铺细胞继续变薄甚至脱落，条索状、球状以及椭球状结构继续大量增多。用pdx1和nkx6.1作为胰腺祖细胞的标志物，pdx1阳性率应不低于70％，nkx6.1的阳性率不应低于70％。
[0466]
诱导的第五个阶段结束，悬浮的球状小体生长。用pdx1和nkx6.1作为内分泌前体细胞的标志物，pdx1阳性率应不低于75％，nkx6.1的阳性率不应低于85％，pdx1和nkx6.1双阳率不应低于50％。
[0467]
诱导的第六个阶段结束，悬浮的球状越来越致密，同时数目也变少。用pdx1、nkx6.1、insulin作为幼稚胰岛细胞的标志物，pdx1阳性率应不低于50％，neurod1的阳性率不应低于65％，insulin的阳性率不应低于20％。
[0468]
诱导的第七个阶段结束，形成致密的悬浮球状体。以胰岛细胞的标志基因为标志物，小体内部细胞高度表达胰岛β细胞的标志基因insulin阳性的细胞比例可以高达60％左右；c-peptide阳性的细胞比例可以高达60％左右，mafa和insulin双阳性的细胞比例可以高达50％左右。小体外部细胞则显著达胰岛α细胞的标志基因glucagon，占小体总细胞数30％左右。
[0469]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0470]
实施例1
[0471]
stage1:ipsc向定向内胚层的分化
[0472]
首先，将matrigel基质在细胞培养板上铺板，加入e8完全培养基，置于细胞培养箱中静置一天，得到铺板后的细胞培养板，然后弃除e8培养基。
[0473]
使用e8培养基接种ips细胞至细胞密度为15-20万/cm
2
，当细胞融合度达90％以上，将培养基更换成stage1培养基a(含有100ng/ml gdf8、3μmol/l chir-99021、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基)，诱导1d。
[0474]
第2d，将培养更换成stage1培养基b(含有100ng/ml gdf8、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基)诱导1d；
[0475]
第3d，更换新鲜的stage1培养基b(含有100ng/ml gdf8、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基)，继续诱导1d，获得内胚层细胞。
[0476]
相比于未分化的ips细胞，经过上述3天诱导后，内胚层细胞的核质比显著降低，并
且细胞之间接触之处存在明显界限(图4)。
[0477]
将诱导后的细胞以sox17和foxa2作为标志物进行检测，所得内胚层细胞的sox17阳性率应不低于85％，而foxa2的阳性率应不低于85％。
[0478]
经检测，本申请诱导后所得内胚层细胞的sox17阳性率大于90％，foxa2 90％(图5)。
[0479]
实验表明，stage1培养基a，80～120ng/ml gdf8、2～4μmol/l chir-99021浓度范围内；stage1培养基b，80～120ng/ml gdf8皆能够获得图4～图5所示的诱导效果。但单独使用gdf8或单独使用chir-99021作为诱导剂，则无法在3d内获得内胚层细胞，所得细胞的sox17的阳性率、foxa2的阳性率皆显著低于联合使用gdf8、hir-99021进行诱导获得内胚层细胞的阳性率，p<0.05。并且，在上述浓度范围外，gdf8、hir-99021配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，使所得内胚层细胞的sox17、foxa2的阳性率显著降低，p<0.05。
[0480]
实施例2
[0481]
stage 2:定向内胚层向原肠管的分化
[0482]
第4d，将实施例1诱导获得的内胚层细胞的培养液更换为stage2培养基：含有50ng/ml fgf7、0.25mmol/l抗坏血酸、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基，每天更换新鲜培养液，诱导2d，获得原肠管细胞。
[0483]
经过上述2天诱导后，细胞变得更加致密和厚实，并且叠层生长，可以看到细胞的核质比几乎消失不见，细胞之间的间隙呈现隆起状形态，开始出现条索状、球状结构(图6)。
[0484]
将诱导后的细胞以foxa2和hnf1b作为标志物进行检测，所得内胚层细胞的hnf1b的阳性率应不低于80％，而foxa2的阳性率应不低于90％。
[0485]
经检测，本申请诱导后所得内胚层细胞的hnf1b阳性率为90％，foxa2的阳性率为91％(图7)。
[0486]
实验表明，stage2培养基中，45～55ng/mlfgf7、0.2～0.3mmol/l抗坏血酸浓度范围内，皆能够获得图6～图7所示的诱导效果。但单独使用fgf7或单独使用抗坏血酸作为诱导剂，则无法在2d内获得原肠管细胞，所得细胞的hnf1b的阳性率、foxa2的阳性率皆显著低于联合使用fgf7、抗坏血酸进行诱导获得原肠管细胞的阳性率，p<0.05。且研究表明在上述浓度范围外，fgf7、抗坏血酸配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，使所得原肠管细胞的sox17、foxa2的阳性率显著降低，p<0.05。
[0487]
实施例3
[0488]
stage 3:原肠管向后前肠的分化
[0489]
第6d，将实施例2诱导获得的内胚层细胞的培养液更换为stage3培养基：含有50ng/ml fgf7，0.25mmol/l抗坏血酸，0.25μmol/l sant-1，1μmol/l ra，100nmol/l的ldn193189，2mmol/l its-x、200nmol/l tpb的、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基。每天更换新鲜培养液，诱导2d，获得后前肠细胞。
[0490]
经过上述2天诱导后，可以明显观察到底层平铺细胞逐渐变薄，球状以及椭球状结构逐渐增多，图8。
[0491]
为了控制所得细胞的品质，所得后前肠细胞的pdx1的阳性率应不低于50％，而
sox9的阳性率应不低于50％。
[0492]
诱导结束，本申请诱导后所得后前肠细胞以pdx1的阳性率为60％、sox9的阳性率为70％，如图9。
[0493]
实验表明，stage3培养基中，45～55ng/ml fgf7，0.20～0.30mmol/l抗坏血酸，0.2～0.3μmol/l sant-1，0.8～1.2μmol/l ra，80～120nmol/l的ldn193189、180～220nmol/l tpb，1～4mmol/l its-x浓度范围内，皆能够获得图8～图9所示的诱导效果。但省略其中任意一种组分，皆无法在3d内获得后前肠细胞，省略组分后，所得细胞的pdx1、hnf6、sox9的阳性率皆显著低于stage3中各诱导剂联合使用进行诱导获得后前肠细胞的阳性率，p<0.05。且研究表明在上述浓度范围外，各组分配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，使所得后前肠细胞的pdx1、hnf6、sox9的阳性率显著降低，p<0.05。
[0494]
实施例4
[0495]
stage 4:后前肠向胰腺祖细胞的分化
[0496]
第8d，将实施例3诱导获得的后前肠细胞的培养液更换为stage4培养基:含有2ng/ml fgf7，0.25mmol/l抗坏血酸，0.25μmol/l sant-1，0.1μmol/lra，200nmol/l ldn193189以及100nmol/l tpb，2mmol/l its-x、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基。每天更换新鲜培养液，诱导3d，获得胰腺祖细胞细胞。
[0497]
经过上述3天诱导后，可以明显看到底层平铺细胞继续变薄甚至脱落。而另一方面，条索状、球状以及椭球状结构继续大量增多，且逐渐变得致密(图10)。
[0498]
为了控制所得胰腺祖细胞的品质，所得胰腺祖细胞的pdx1阳性率应不低于70％，nkx6.1的阳性率应不低于70％。
[0499]
诱导结束，本申请诱导后所得胰腺祖细胞固定(4％pfa)后，用胰腺祖细胞标志基因pdx1和nkx6.1的抗体进行了免疫荧光染色。下图为用转盘激光共聚焦荧光显微镜在40倍高倍镜下的拍摄结果。绿色为pdx1染色阳性的细胞，红色表示nkx6.1染色阳性的细胞，蓝色为dapi染色阳性的细胞核。结果显示：该protocol不论是在诱导分化出来的管状还是球状结构中，胰腺祖细胞的标志基因pdx1和nkx6.1均为染色阳性结果(图11)。
[0500]
实验表明，stage4培养基中，1.8～2.2ng/ml fgf7，0.2～0.3mmol/l抗坏血酸，0.2～0.3μmol/l sant-1，0.08～0.12μmol/lra，180～220nmol/l ldn193189，80～120nmol/l tpb，1～4mmol/l its-x的浓度范围内，皆能够获得图10～图11所示的诱导效果。但省略其中任意一种组分，皆无法在3d内获得后胰腺祖细胞，省略组分后，所得细胞的pdx1、nkx6.1、sox9的阳性率皆显著低于stage4中各诱导剂联合使用进行诱导获得后胰腺祖细胞的阳性率，p<0.05。且研究表明在上述浓度范围外，各组分配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，使所得后胰腺祖细胞的pdx1、nkx6.1、sox9的阳性率显著降低，p<0.05。
[0501]
实施例5
[0502]
stage 5:胰腺祖细胞向内分泌前体细胞分化
[0503]
第11d，将实施例4诱导获得的胰腺祖细胞细胞经过10μm-27632孵育4个小时后用胰酶或/和使用细胞刮对细胞团进行重悬，以stage5培养基(含有2mmol/l its-x，0.25μmol/l san-t，0.1μmol/l维甲酸，1μmol/l t3，100nmol/l ldn193189，10μmol/l alk5抑制剂ii，10μmol/l硫酸锌、10μg/ml肝素钠、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/
l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基)至细胞密度为300万/ml重悬至超低亲附孔板中继续培养，每天更换新鲜培养液，诱导3d，获得内分泌前体细胞。
[0504]
诱导3d后，可见悬浮的球状小体生长(图12)。
[0505]
所获得的内分泌前体细胞以pdx1、nkx6.1、为标志物进行质量控制，要求pdx1阳性率应不低于75％、nkx6.1阳性率应不低于80％。
[0506]
诱导结束，对所得细胞进行检测的结果如图13。pdx1阳性率不低于75％，nkx6.1的阳性率不低于85％，pdx1和nkx6.1双阳率不低于50％。
[0507]
实验表明，stage5培养基中，1.8％～2.2％脱脂bsa，2mmol/l its-x，0.2～0.3μmol/l san-t，0.04～0.06μmol/l维甲酸，0.8～1.2μmol/l t3，80～120nmol/l ldn193189，8～12μmol/l alk5抑制剂ii，8～12μmol/l硫酸锌，8～12μg/ml肝素钠的浓度范围内，皆能够获得图12～图13所示的诱导效果。但省略其中任意一种组分，皆无法在3d内获得后内分泌前体细胞，省略组分后，所得细胞的pdx1、nkx6.1、的阳性率皆显著低于stage5中各诱导剂联合使用进行诱导获得后内分泌前体细胞的阳性率，p<0.05。且研究表明在上述浓度范围外，各组分配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，使所得后内分泌前体细胞的pdx1、nkx6.1、的阳性率显著降低，p<0.05。
[0508]
实施例6
[0509]
stage 6:内分泌前体细胞向幼稚胰岛分化
[0510]
第14d，将实施例5诱导获得的内分泌前体的重悬于stage6a培养基：含有100nmol/l ldn193189、100nmol/l γ-分泌酶抑制剂、2mmol/l its-x、1μmol/l t3、10μmol/l alk5抑制剂ii、10μmol/l硫酸锌、10μg/ml肝素钠、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基。每天更换新鲜培养液；
[0511]
诱导7d后，第22d，将实施例5诱导获得的内分泌前体的重悬于stage6b培养基：含有100nmol/l ldn193189、2mmol/l its-x、1μmol/l t3、10μmol/l alk5抑制剂ii、10μmol/l硫酸锌、10μg/ml肝素钠、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基。继续诱导7d后，每天更换新鲜培养液，获得幼稚胰岛细胞。悬浮的球状越来越致密，同时数目也变少(图14)。
[0512]
为了控制所得幼稚胰岛细胞的品质，所得胰腺祖细胞的pdx1阳性率50％，nkx6.1的阳性率65％，insulin的表达量20％。对所得细胞的免疫荧光检测结果如图15。
[0513]
这一阶段的胰岛能够分泌胰岛素，但刺激胰岛素释放的信号通路还没有形成，因此，对于外周的葡萄糖刺激不能够释放胰岛素(图16)。
[0514]
但由于培养体系中有胰岛素的添加，因此检测细胞培养上清液中的胰岛素以及血糖刺激后的胰岛素，会有误差。c-peptide和胰岛素是一个分泌多肽的两段，而培养环境中，没有c-peptide。因此测定c-peptide可以真实反应胰岛素的分泌值(图17)。
[0515]
实验表明，stage6培养基中，100nmol/l ldn193189、100nmol/l γ-分泌酶抑制剂、2mmol/l its-x、1μmol/l t3、10μmol/l alk5抑制剂ii、10μmol/l硫酸锌、10μg/ml肝素钠、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基的浓度范围内，皆能够获得图14～图17所示的诱导效果。但省略其中任意一种组分，皆无法在14d内获得幼稚胰岛细胞，省略组分后，所得细胞的标志物的表达发生改变，胰岛素也无法分泌，效果显著性的低于stage6培养基中各诱导剂联合诱导的效果，p<
0.05。且研究表明在上述浓度范围外，各组分配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，p<0.05。
[0516]
实施例7
[0517]
stage 7:幼稚胰岛向成熟胰岛分化
[0518]
第30d，将实施例6诱导获得的幼稚胰岛的培养液更换为stage7培养基：含有2mmol/l its-x、1μmol/l t3、10μmol/l alk5抑制剂ii、10μmol/l硫酸锌、10μg/ml肝素钠、1mmol/l n-acetyl cysteine(n-乙酰半胱氨酸)，10μmol/l trolox,2μmol/l r428、3g/l碳酸氢钠，2mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，20mmol/l葡萄糖，2％bsa(胎牛白蛋白)的mcdb131培养基。每天更换新鲜培养液，诱导14d，获得成熟胰岛细胞。
[0519]
经过上述14天的诱导，细胞形成致密的悬浮球状体(图18)。
[0520]
stage7诱导结束的成熟类胰岛小体高度类似成体胰岛小体。小体内部细胞高度表达胰岛β细胞的标志基因insulin和mafa，其中insulin阳性的细胞比例可以高达60％左右；mafa和insulin双阳性的细胞比例可以高达50％左右。小体外部细胞则显著达胰岛α细胞的标志基因glucagon，占小体总细胞数30％左右(图19～20)。在结构上和细胞组成上，诱导的胰岛与成体胰岛组织高度一致。
[0521]
实验表明，stage7培养基中，1～4mmol/l its-x，8μmol/l～12μmol/l alk5抑制剂ii，8μmol/l～12μmol/l硫酸锌，0.8μmol/l～1.2μmol/l t3，8～12ug/ml肝素钠，0.8mmol/l～1.2mmol/l n-乙酰半胱氨酸，8μmol/l～12μmol/l trolox，1.8μmol/l～2.2μmol/l r428，2～4g/l碳酸氢钠，1～3mmol/l(100
×
)谷氨酰胺，15～25mmol/l葡萄糖，1％～3％bsa(胎牛白蛋白)。的浓度范围内，皆能够获得图18～图20所示的诱导效果。但省略其中任意一种组分，皆无法在14d内获得成熟的胰岛细胞，省略组分后，所得细胞的标志物的表达发生改变，胰岛素也无法分泌，效果显著性的低于stage7培养基中各诱导剂联合诱导的效果，p<0.05。且研究表明在上述浓度范围外，各组分配比及浓度的改变，也会显著的降低诱导结果，p<0.05。
[0522]
效果验证
[0523]
1、体外验证
[0524]
1.1针对stage7晚期胰岛进行的体外胰岛素分泌检测实验显示，stage7晚期胰岛能够很好地在体外水平响应高浓度葡萄糖刺激而分泌出两倍以上的胰岛素(相较于低糖水平的基础胰岛素分泌量)，说明此阶段时的胰岛细胞已经具备了很好的分泌功能，分化成熟(图21)。
[0525]
2、体内验证
[0526]
2.1stage7晚期成熟胰岛细胞体内功能鉴定
[0527]
为了进一步验证诱导得到的胰岛细胞在体内是否同样具备胰岛素分泌能力，我们将约2000个诱导胰岛小体移植到scid免疫缺陷小鼠制备的糖尿病模型中，观察胰岛小体的胰岛素分泌能力以及对小鼠血糖水平的作用能力。
[0528]
scid免疫缺陷小鼠通过单次高剂量注射链脲霉素(stz，190mg/kg)制备糖尿病模型小鼠，一般10天左右即可成型。胰岛小体用50ul生理盐水重悬后，注射移植到小鼠肾包膜下。对照组进行假手术并注射等量生理盐水。
[0529]
(1)空腹血糖水平检测
[0530]
在stz注入后(见图22，左图)，小鼠血糖水平急剧升高，说明建模成功。
[0531]
在建模10天后(day0)，按上述方法将诱导得到的胰岛小体移植到小鼠肾包膜下。
[0532]
可以看到在移植后40天左右，小鼠血糖水平基本恢复到了正常水平(图22，右图)。这就说明移植的诱导胰岛小体具备有效的血糖调控能力。
[0533]
(2)胰岛素水平检测
[0534]
我们同时也检测了移植胰岛小体后小鼠体内胰岛素的分泌水平。
[0535]
c肽(c-peptide)又称连接肽，由胰岛β细胞分泌，它与胰岛素有一个共同的前体胰岛素原。胰岛素原裂解成1个分子的胰岛素和1个分子的c肽，因此c肽与自身胰岛素摩尔量是一致的。因为c肽不容易被肝脏降解，因此测c肽就是测了胰岛素的含量，能准确反映胰岛细胞的功能。
[0536]
同样，在做完肾切除手术后，c-peptide的分泌能力消失。说明移植的诱导胰岛小体具备显著的胰岛素分泌能力。
[0537]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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