一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法与流程

[0001]
本发明属于天然产物的高值化功能性产品开发领域，特别涉及一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法。


背景技术：

[0002]
银杏是我国宝贵且特有的林源植物。银杏叶具有多方面重要的药理作用和经济价值，其中主要的生物活性成分为黄酮类、萜内酯、聚戊烯醇(pps)和多糖等化合物。目前我国银杏叶产品的开发和应用仍处于初始阶段，主要利用其中的黄酮和萜内酯成分，最有价值的pps尚未开发利用。银杏叶聚戊烯醇(gbp)是由14-24个异戊烯基单元构成的桦木萜醇类pps，由于其和参与人体糖蛋白合成的多萜醇结构类似而成为近年来的研究热点。目前，关于gbp生物活性的研究主要集中在抗肿瘤、抑菌和抗氧化方面。例如，王成章等人以gbp为原料进行抗肿瘤实验，结果发现其对a549、hips、s180、ec和heps等多种肿瘤细胞均具有显著的抑制活性。张昌伟等人对gbp的抑菌和抗氧化活性研究发现，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和肺炎链球菌均具有强烈的抑制效果，并且对abts、dpph、羟自由基和超氧阴离子均具有较好的清除作用。gbp较好的抗肿瘤、抗氧化和抑菌活性使其在药品、保健品和化妆品等功能性产品领域极具开发潜力。但是，由于gbp本身具有的大分子量和强疏水性导致的低生物利用度，以及缺乏机体组织选择性造成的正常组织毒副性，限制了其相关功能性产品的开发和应用。
[0003]
钌(ru)多吡啶配合物因具有丰富的光物化性质、独特的dna结合能力、易吸收、代谢快、协同增效以及时间和空间上的可控释放性等优势，在解决gbp功能性产品开发应用问题方面极具发展前景。传统的钌多吡啶配合物主要由主配体和无生物活性的功能配体组成。近年来，通过引入生物活性分子作为可离去功能配体，在光照射后同时释放具有交联生物分子(dna)功能的钌双水合物和生物活性分子，以达到协同增效的目的，是钌多吡啶配合物发展的一大趋势。例如，sgambellone等人在钌多吡啶配合物上引入蛋白酶抑制剂或小分子化疗药物(5-氟尿嘧啶(5-fu)、5-氰基尿嘧啶(5-cnu)等)作为可解离的功能配体，在光照下同时释放生物活性分子和钌多吡啶部分，通过钌多吡啶部分与dna共价结合以及生物分子本身具有的活性实现了协同增效的目的。gbp本身较好的生物活性使其具有成为钌多吡啶配合物功能配体的潜力。但是，目前关于gbp-钌多吡啶金属配合物合成方面的研究在国内外鲜见报道。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供了一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法。
[0005]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006]
一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法，包括以下步骤：
[0007]
s1、银杏叶聚戊烯醇功能配体的制备
[0008]
将高纯度银杏叶聚戊烯醇末端羟基替换成配位能力更强的活性基团，合成聚戊烯醇功能配体；
[0009]
s2、银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成
[0010]
以聚戊烯醇功能配体和钌多吡啶配合物为原料，合成聚戊烯醇-钌多吡啶金属配合物。
[0011]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，步骤s1中所述聚戊烯醇的纯度高于99.8％。
[0012]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，步骤s1中所述配位能力更强的活性基团包括氨基、氰基，以及所有含有吡啶基团的衍生物。
[0013]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，步骤s2中所述钌多吡啶配合物包括吡啶环上修饰不同基团的所有钌多吡啶衍生物。
[0014]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，所述基团包括亲水基团、疏水基团、吸电子基团。
[0015]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，所述钌多吡啶衍生物包括4,4-二羟基-2,2-联吡啶、4,4-二甲基-2,2-联吡啶，4,4-二甲氧基-2,2-联吡啶和2,2-联吡啶-4,4-双磷酸。
[0016]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，包括以下步骤：
[0017]
s1、银杏叶聚戊烯醇功能配体的制备
[0018]
将银杏叶聚戊烯醇末端羟基通过光延反应和还原反应替换成配位能力更强的氨基，合成氨基聚戊烯醇；
[0019]
s2、钌多吡啶配合物的合成
[0020]
称取0.1～0.5g rucl
3
·
3h
2
0、0.5～1.0g2,2
’-
联吡啶和0.4-0.8g licl，放入10～50ml n,n-二甲基甲酰胺中回流5～10h，旋蒸除去溶剂，冷却至室温，加入50～100ml无水丙酮，然后放置于0～10℃冰箱中过夜，析出黑色微晶体，滤纸过滤，并用10～50ml无水丙酮洗涤2～5次，干燥至恒重，得到钌多吡啶配合物；
[0021]
s3、银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成
[0022]
称取10～50mg氨基聚戊烯醇和10～20mg koh放入乙醇-水溶液(v水：v乙醇＝1：5～10)里搅拌，然后加入钌多吡啶配合物，于n
2
氛围中加热回流1～5h，旋蒸除去溶剂，固体用硅胶柱分离，以三氯甲烷和甲醇(三氯甲烷：甲醇＝50～100：4)为淋洗剂，收集洗脱物，加入0.05～1.0gnh
4
pf
6
固体沉淀，滤纸过滤，甲醇洗涤2-5次，真空干燥8-20h，得银杏叶聚戊烯醇金属配合物。
[0023]
优选的，在上述一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法中，所述银杏叶聚戊烯醇功能配体制备具体包括如下步骤：
[0024]
s11、分别称取0.1～0.5g聚戊烯醇，0.05～0.50g邻苯二甲酰亚胺和0.05～0.5g三苯基膦于10～0ml厚壁耐压瓶中，加入1～10ml四氢呋喃，然后添加0.01～0.3g偶氮二甲酸二乙酯，在氮气氛围下于10～50℃下磁力搅拌反应1～10h，浓缩、洗脱，得到淡黄色油状洗脱物a；
[0025]
s12、分别称取0.1～1.0g洗脱物a和0.1～0.8g水合肼于20～100ml厚壁耐压瓶中，
然后分别加入1～10ml四氢呋喃和0.5～8.0ml甲醇，加入乙醚进行稀释，于20～80℃磁力搅拌器中反应1～8h，洗涤，干燥，过滤，浓缩，洗脱，得无色油状洗脱物b，即氨基聚戊烯醇；
[0026]
或者
[0027]
分别称取0.5～2.0g聚戊烯醇和0.1～1.0g三乙胺加入到10～50ml的四氢呋喃中，然后在0～5℃条件下逐滴加入0.5～1.0g氯化锶，得到的混合物在0～5℃条件下搅拌0.5～3h。向混合物中加入0.5～1.0g三乙胺和10～50ml四氢呋喃，然后在0～5℃条件下逐滴加入0.2～0.8g氰化钠；得到的混合物在10～30℃条件下搅拌1.0～3.0h，向反应后的混合物中依次倒入10～50ml水和10～50ml乙酸乙酯，合并的有机层用10～50ml盐水洗涤，经0.5～5.0g无水硫酸钠干燥，滤纸过滤以及减压浓缩，得到黄色油状液体，即氰基聚戊烯醇；
[0028]
或者
[0029]
将0.01～0.05g吡啶酸加入到1～5ml氯化亚砜中，搅拌升温至30～90℃，保温搅拌3～4小时，稍降温，减压浓缩氯化亚砜至干，浓缩所得残余物降温至10～40℃后加入1～5ml二氯甲烷，搅拌控温至0～5℃，滴加0.01～0.1g三乙胺，控温0～5℃并搅拌1～10min，滴加0.05～0.30g聚合物醇，升温至10～40℃后搅拌反应5～10h，反应结束后用1～5ml饱和碳酸氢钠溶液和1～5ml饱和食盐水分别洗涤，有机层用0.5～5.0g无水硫酸钠干燥，浓缩至干后即得甲酸吡啶基聚戊烯醇。
[0030]
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种具有光控活性银杏叶聚戊烯醇金属配合物的合成方法，利用该方法合成的聚戊烯醇金属配合物具有较好的暗稳定性、光致解离效率以及光控抗肿瘤性能，可为高值化银杏叶聚戊烯醇功能性产品开发提供理论参考和技术支撑。
附图说明
[0031]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0032]
图1为氨基聚戊烯醇合成路线；
[0033]
图2为氨基聚戊烯醇的
1
h-nmr图谱；
[0034]
图3为氨基聚戊烯醇金属配合物的
1
h-nmr图谱；
[0035]
图4为氨基聚戊烯醇金属配合物在黑暗条件下的紫外吸收光谱；
[0036]
图5为氨基聚戊烯醇金属配合物在光照前后的吸收光谱变化；
[0037]
图6为氨基聚戊烯醇金属配合物浓度与肿瘤细胞抑制率关系。
具体实施方式
[0038]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
实施例1：
[0040]
氨基聚戊烯醇的合成路线如图1所示。
[0041]
分别称取0.27g聚戊烯醇，0.06g邻苯二甲酰亚胺和0.11g三苯基膦于35ml厚壁耐压瓶中，加入2.5ml四氢呋喃，然后添加0.08g偶氮二甲酸二乙酯，于20℃下磁力搅拌反应4.0h(氮气氛围)，反应结束后浓缩，浓缩物用乙醚进行溶解，静置一段时间后过滤除去不溶于乙醚的物质，浓缩乙醚溶液，得0.44g浓缩物a，浓缩物a呈淡黄色油状，将浓缩物a用少量乙醚溶解然后上硅胶柱(硅胶为200-300目，硅胶柱为2cm
×
40cm，10g)进行洗脱，洗脱剂为乙醚：正己烷＝1:4，洗脱物a(0.21g)为淡黄色油状物，其rf为0.6(展开剂为乙醚：正己烷＝1:4)；
[0042]
分别称取0.44g洗脱物a和0.24g水合肼于35ml厚壁耐压瓶中，然后分别加入3.5ml四氢呋喃和1.5ml甲醇，加入乙醚进行稀释，于50℃磁力搅拌器中反应3h，反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液进行充分洗涤，有机相用无水硫酸钠进行干燥处理，过滤，浓缩，得0.6g浓缩物b(展开剂为氯仿：甲醇＝45：5)，将浓缩物b上三氧化二铝柱(碱性氧化铝适于胺的分离，30g)，并利用氯仿-甲醇进行梯度洗脱(甲醇最高可达5％)，洗脱物b(0.4g)为无色油状物，其rf为0.65(展开剂为氯仿：甲醇：水＝45：15：1)。
[0043]
为了进一步证实成功合成了氨基聚戊烯醇，对洗脱物b进行了氢谱测试，结果如图2所示。经过解析，洗脱物b的氢谱位移结果如下：
1
h nmr，δ：5.27(br-t,＝ch-ch
2-n)；5.12(m,＝ch)；3.26(br-d,n-ch
2
)；1.90～2.08(m,-ch
2
)；1.71(br-s,α-cis-ch
3
)；1.68(br-s,cis-ch
3
)；1.60(br-s,trans-ch
3
)。由此可说明成功合成了氨基聚戊烯醇。
[0044]
实施例2：
[0045]
称取30mg氨基聚戊烯醇配体，11.3mg氢氧化钾在5ml水-乙醇(1：9)的混合溶液中，在集热式恒温加热磁力搅拌器搅拌30min后，加入100mg cis-ru(bpy)
2
cl
2
，回流2h。旋蒸除去溶剂，得到浓缩物0.17g。然后用硅胶柱进行分离。称取6g硅胶，硅胶柱为2cm
×
40cm，硅胶用200-300目，用洗脱剂(三氯甲烷-甲醇＝100：4)进行淋洗。收集的化合物溶于乙醇，加入nh
4
pf
6
固体沉淀，用滤纸过滤得红色沉淀，再用水洗涤，干燥即得。
[0046]
氨基聚戊烯醇金属配合物的氢谱位移(如图3所示)分两部分解析：
[0047]
(1)氨基聚戊烯醇部分
1
h nmr，δ：5.27(br-t,＝ch-ch
2-n)；5.12(m,＝ch)；3.26(br-d,n-ch
2
)；1.90～2.08(m,-ch
2
)；1.71(br-s,α-cis-ch
3
)；1.68(br-s,cis-ch
3
)；1.60(br-s,trans-ch
3
)；
[0048]
(2)多吡啶金属配合物部分
1
h nmr，δ9.29(d,j＝5.2hz,1h)，8.67-8.84(m,4h)，8.45(d,j＝5.2hz,1h)，8.33-8.19(m,2h)，8.14-7.98(m,4h)，7.95-7.84(m,2h)，7.82(d,j＝5.1hz,1h)，7.70-7.63(m,1h)，7.58(d,j＝5.3hz,1h)，7.47-7.35(m,2h)。
[0049]
本发明对实施例2得到的聚戊烯醇金属配合物的光致解离效率和其光控抗肿瘤性能进行了如下的研究评价。
[0050]
1、聚戊烯醇金属配合物光致解离效率的研究
[0051]
将配合物溶液放置在黑暗条件下一段时间，测定配合物溶液在这段时间前后的紫外-可见分光光谱变化，从而判断其暗稳定性。
[0052]
将配合物放置在光照条件下一段时间，通过监测配合物的电子吸收光谱随照射时间的变化来确定光诱导的配体交换性质和反应进程。通过在水和乙腈中分别绘制528nm和530nm处吸光度随时间的变化来确定配体交换反应的半衰期，从而评价其光致配体解离效
率。
[0053]
光致配体解离实验所用光源为太阳能模拟器，用470nm滤光片截掉短波光。测定了gbp-钌多吡啶金属配合物(25μm)在黑暗条件下24h前后的吸收光谱，如图4所示。
[0054]
由图4可知，配合物的吸收光谱在24h之后几乎没发生变化，由此表明其具有较好的暗稳定性。但在可见光(波长≥470nm)的照射下，配合物的吸收光谱随光照时间延长表现出如图5所示规律性变化。配合物出现明显的等吸收点，表明有新产物生成。随着光照的进行，配合物逐渐发生py-so
3
配体解离，形成典型的ru(-)(bpy)双水合物[ru(bpy)
2
(h
2
o)
2
]
2+
，1mlct最大吸收峰出现在490nm。
[0055]
2、聚戊烯醇金属配合物光控抗肿瘤性能的评价
[0056]
人体肺癌细胞a549在含有10％胎牛血清，1％青霉素和1％链霉素的dmem培养基(dulbecco
’
s modified eagle
’
s medium，dmem)中培养。培养箱温度为37℃，co
2
浓度为5％。a549细胞按每孔2
×
10
5
的浓度种在96孔板中，生长24h。加入含有不同金属配合物浓度(0-100μm)培养基，培养12h后，用15w led灯(470nm)光照30min。再将细胞培养48h后，加入cell titer glo(promega)试剂盒测定细胞存活率。用multimode plate reader(enspire)仪器检测最终的发光，数据用如下公式处理分析：
[0057][0058]
其中，y是不同浓度配合物所对应的荧光强度，d代表不同配合物浓度，e
0
和e
inf
分别是测试浓度区间内荧光强度的最大值和最小值，ec
50
是细胞半数抑制浓度(ec
50
＝ic
50
)，hs是斜率(hs＝1)。
[0059]
利用mtt法对合成的氨基聚戊烯醇金属配合物的抗肿瘤活性进行了评价，其浓度与肿瘤细胞抑制率关系如图6所示。结果表明，配合物对a549肿瘤细胞的半数抑制浓度为29.3μm，说明配合物对具有较好的抗肿瘤活性。
[0060]
需要说明的是肿瘤细胞可以为a549、hips、s180、ec和heps等多种肿瘤细胞。
[0061]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0062]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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