一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌及应用的制作方法

[0001]
本发明涉及一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌及应用，属于微生物技术应用领域。


背景技术：

[0002]
乳糖耐受(lactose tolerance)，是指乳糖由人体内生成的乳糖酶分解，被人体消化吸收的状态。出现乳糖不耐受时，就会产生疾病症状，此时，人体的肠道中不能分泌分解乳糖的酶，无法使乳糖消化、吸收，为人所用。乳糖会在肠道中由细菌分解变成乳酸，从而破坏肠道的碱性环境。
[0003]
牛乳等大多数哺乳动物母乳中都含有乳糖。人类食用乳品中的乳糖后，主要由分布于小肠刷状缘细胞膜上的乳糖酶根皮苷水解酶所水解，但亚洲人群由于遗传背景和饮食差异等原因，90％以上的人乳糖酶缺乏，喝牛奶后会因缺乏半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而产生乳糖不耐受，食用乳制品后乳糖不能被消化和吸收，产生腹痛、腹胀、恶心和呕吐等乳糖不耐受的症状(husain2010)。
[0004]
嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属 (lactobacillus)，革兰氏阳性，不产芽抱，无鞭毛，不运动，同型发酵乳糖，不液化明胶，接触酶阴性，最适生长温度为35℃～38℃，最适ph值为 5.5－6.4，g+c含量为36.％－37.4％，是一类厌氧或兼性厌氧的微生物。嗜酸乳杆菌是栖息在人体肠道内的有益菌之一。
[0005]
半乳糖苷酶，俗称乳糖酶，能够体外水解乳品中的乳糖，从而有效避免乳糖不耐症患者由于自身乳糖酶缺乏而导致食用乳品产生的不良反应。此外，利用半乳糖苷酶水解乳制品中的乳糖，能够同时克服炼乳、奶粉及冰淇淋等乳制品的乳糖析出问题，延长货架期，提高乳制品的甜度。


技术实现要素：

[0006]
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌及应用，解决上述技术问题。
[0007]
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌的菌株编号为nm，分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus，保藏号为：cgmcc no 4472，保藏日期为2010年12月14日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0008]
本发明的有益效果是：本发明通过对于传统乳制品中菌群的筛选、鉴定，得到一种新的嗜酸乳杆菌，其具有半乳糖苷酶活性并可耐受乳糖，既可以制作成活菌制剂治疗乳糖不耐受产生的相关疾病症状，还可以制成活性发酵乳，相比于其他发酵乳更易于被人体吸收。
[0009]
本发明还涉及一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌在制备活菌制剂中的应用。
[0010]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0011]
进一步，所述活菌制剂由所述嗜酸乳杆菌培养得到菌泥后加入合适的辅料制备而成。
[0012]
进一步，所述活菌制剂为固体剂型。选用固体剂型的原因是因为活菌在液体中存活比较短。
[0013]
进一步，所述固体剂型包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂。
[0014]
本发明还涉及一种具有半乳糖苷酶活性可耐受乳糖的嗜酸乳杆菌在制备活性发酵乳中的应用。
[0015]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0016]
进一步，所述嗜酸乳杆菌单独作为发酵剂使用，形态为冷冻干燥活菌粉，其活菌数大于1.5.0
×
10
11
cfu/g。
[0017]
进一步，所述活性发酵乳的制备方法包括如下步骤：配料、均质灭菌、产品发酵、冷却及冷藏；其中，产品发酵时温度控制在35～38℃；所述配料中的原料重量百分比组成为：牛乳78～90％，氮源0.4～1.2％，碳源8.8～ 21.6％；所述嗜酸乳杆菌的添加量为2.0
×
10
6
cfu/ml～1.5
×
10
7
cfu/ml。
[0018]
进一步，所述氮源是酪蛋白水解物、酵母抽提物、蛋白胨中的一种或多种，所述碳源是白砂糖、葡萄糖、果葡糖浆中的一种或多种。
[0019]
进一步，所述活性发酵乳在冷链保存条件下，1个月内活菌可稳定在10 亿cfu/g。
具体实施方式
[0020]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0021]
实施例1：嗜酸乳杆菌nm分离筛选及鉴定
[0022]
从内蒙古自治区呼和浩特市土默特左旗收集自然发酵的内蒙古传统稀奶油，加水混匀并过滤后，取滤液涂布于mrs平板培养基上，37℃培养48h，分离培养，获得38株菌株。
[0023]
将得到的38株菌株分别接种于100mlmrs液体培养基中，37℃静置培养 48h，进行活化。
[0024]
采用api zym试剂盒(法国梅里埃公司)对活化后的菌株的半乳糖苷酶活性进行半定量分析。根据试剂盒操作说明，收集mrs液体培养液中生长的菌体细胞，用无菌水制备菌悬液用于下一步的酶活分析。加入菌体和试剂后，试剂条的色泽深度由浅到深分为0～5共6个等级，0相当于阴性反应，5为最强的反应。由色泽深度可知近似的菌体酶活，色泽1～5相当于释放的酶活浓度分别为5nmoles,10nmols,20nmols,30nmols和40nmols。
[0025]
检测结果是：在38株菌株中，有3株具有最高级别5的半乳糖苷酶活性，选择其中色泽最深的一株，标记编号为nm，其菌落形态呈白色、圆形，边缘完整，表面光滑。在光学显微镜下细胞形状为杆状，革兰氏染色呈阳性。测序，其16srdna序列与lactobacilus acidophilus序列相似性达95％以上，根据16srdna序列分析，菌株nm被鉴定为嗜酸乳杆菌(lactobacilusacidophilus)，将其保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no 4472，保藏日期为2010年12月14日。
[0026]
所得的嗜酸乳杆菌nm具有高半乳糖苷酶活性，使其可耐受乳糖，既可以制作成活
菌制剂治疗乳糖不耐受产生的相关疾病症状，还可以制成活性发酵乳，相比于其他发酵乳更易于被人体吸收。
[0027]
实施例2：利用嗜酸乳杆菌nm制备益生菌活菌制剂
[0028]
以上述筛选出的嗜酸乳杆菌nm制成药物制剂。将上述嗜酸乳杆菌nm用 mrs培养基培养；取培养14h的嗜酸乳杆菌nm菌液50ml，离心取菌泥，然后溶于1ml无菌pbs中，得菌泥；将菌泥搅拌均匀，然后按照常规的方法加入合适的辅料制成临床可接受的固体剂型。所述固体剂型包括散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂等各种剂型。
[0029]
方案1：散剂。散剂是指一种或数种药物均匀混合而成的粉末状制剂，可内服也可外用。散剂制备的一般工艺环节包括物料前处理、粉碎、筛分、混合、分剂量、质量检验、包装贮存等。
[0030]
方案2：颗粒剂。颗粒剂是指药物与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂。其特点是可以直接吞服或冲水饮用，携带方便，溶出和吸收速度快。颗粒剂一般采用湿法制粒的主要步骤制备，工艺流程包括粉碎、过筛、混合、制软材料、制粒、干燥、整粒、分级或包衣、分剂量、包装。其中，制软材料是指将药物与适当的稀释剂、崩解剂充分混匀，加入水或其他粘合剂后制成软材。
[0031]
方案3：胶囊剂。胶囊剂是指将药物填装在空心硬质胶囊中或密封于弹性软质胶囊中制成的固体制剂。可以掩盖药物的嗅味，提高药品稳定性，保护药物的药效，胶囊包衣还可以达到定位释放的目的。其生产可以分成胶囊壳的制备以及药物的填充两个方面，工艺环节包括各组成的粉碎、过筛、混合、胶囊填充、胶囊除尘清洗、质量检查、包装。质量检查包括外观、水分、装量差异、崩解度与溶出度等。
[0032]
方案4：片剂。片剂指药物与适宜的辅料混合均匀后，通过制剂技术压制而成的圆片状或异性片状的固体制剂。片剂能适应医疗预防用药的要求，剂量准确，使用方便，且体积小，携带方便。片剂的的生产需要借助压片机设备进行压片处理，还需要通过包衣机进行包衣，并完成药品的包装。
[0033]
实施例3：利用嗜酸乳杆菌nm制备活性发酵乳
[0034]
1.嗜酸乳杆菌nm凝乳能力评价
[0035]
凝乳能力是乳制品发酵剂的另一重要性能。将嗜酸乳杆菌nm按 10
7
cfu/ml分别添加于10％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉+0.25％酵母抽提物、10％脱脂奶粉+0.25％酪蛋白水解物、10％脱脂奶粉+0.25％蛋白胨、以及 10％脱脂奶粉+1％葡萄糖中，于37℃培养，评估凝乳时间。
[0036]
经检测，嗜酸乳杆菌nm可在添加有氮源(如添加酵母抽提物、酪蛋白水解物和蛋白胨)的10％脱脂奶粉中快速凝乳，可进一步作为发酵剂应用于活性发酵乳中。
[0037]
2.嗜酸乳杆菌nm冷冻干燥活菌粉的制备
[0038]
嗜酸乳杆菌nm经一级种子液和二级种子液培养后，添加于发酵罐中培养发酵，经离心、冷冻干燥后制成嗜酸乳杆菌nm菌粉。适用于活性发酵乳制备的嗜酸乳杆菌nm菌粉，活菌数大于1.5
×
10
11
cfu/g。
[0039]
3.嗜酸乳杆菌nm活性发酵乳的制备
[0040]
方案1：
[0041]
原料组成为：牛乳78％，酪蛋白水解物0.4％，白砂糖8％，葡萄糖 13.6％，嗜酸乳
杆菌nm的添加量为1.5
×
10
7
cfu/ml。
[0042]
在牛乳中加入酪蛋白水解物、白砂糖和葡萄糖后，搅拌均匀，均质灭菌冷却至37℃后，按1.5
×
10
7
cfu/ml的接种量加入嗜酸乳杆菌nm，37℃发酵至滴定酸度80
°
t后，冷却至20℃。将冷却后的活性发酵乳灌装至包装容器，并迅速转入冷库保存。
[0043]
该活性发酵乳，产品呈均匀一致的乳白色，组织状态均匀，口感细腻滑爽，嗜酸乳杆菌活菌含量1.7
×
10
9
cfu/g。且在4℃条件下保存1个月后，活菌含量为1.2
×
10
9
cfu/g。
[0044]
方案2：
[0045]
原料组成为：牛乳85％，酪蛋白水解物1％，葡萄糖14％，嗜酸乳杆菌 nm的添加量为5.5
×
10
6
cfu/ml。
[0046]
在牛乳中加入酪蛋白水解物、白砂糖和葡萄糖后，搅拌均匀，均质灭菌冷却至37℃后，按5.5
×
10
6
cfu/ml的接种量加入嗜酸乳杆菌nm，37℃发酵至滴定酸度80
°
t后，冷却至20℃。将冷却后的活性发酵乳灌装至包装容器，并迅速转入冷库保存。
[0047]
该活性发酵乳，产品呈均匀一致的乳白色，组织状态均匀，口感细腻滑爽，嗜酸乳杆菌活菌含量2.1
×
10
9
cfu/g。且在4℃条件下保存1个月后，活菌含量为1.3
×
10
9
cfu/g。
[0048]
方案3：
[0049]
原料组成为：牛乳90％，酪蛋白水解物1.2％，白砂糖4％，葡萄糖4.8％，嗜酸乳杆菌nm的添加量为1.5
×
10
7
cfu/ml。
[0050]
在牛乳中加入酪蛋白水解物、白砂糖和葡萄糖后，搅拌均匀，均质灭菌冷却至37℃后，按2.0
×
10
6
cfu/ml的接种量加入嗜酸乳杆菌nm，37℃发酵至滴定酸度80
°
t后，冷却至20℃。将冷却后的活性发酵乳灌装至包装容器，并迅速转入冷库保存。
[0051]
该活性发酵乳，产品呈均匀一致的乳白色，组织状态均匀，口感细腻滑爽，嗜酸乳杆菌活菌含量1.9
×
10
9
cfu/g。且在4℃条件下保存1个月后，活菌含量为1.2
×
10
9
cfu/g。
[0052]
嗜酸乳杆菌nm可作为单独发酵剂，应用于活性发酵乳的制备，该活性发酵乳益生菌活菌数大于10亿cfu/g,且在冷链条件下保存一个月，活菌数还能稳定在10亿cfu/g。该活性发酵乳可补充益生菌，发挥嗜酸乳杆菌nm 的健康功能。
[0053]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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