一种用于检测转基因大豆g10evo-epsps基因的数字PCR方法与流程

一种用于检测转基因大豆g10evo-epsps基因的数字pcr方法
技术领域
[0001]
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测转基因大豆g10evo-epsps基因的数字pcr方法。


背景技术：

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大豆是人类生产领域中最重要的农作物之一，也是植物蛋白和植物油的重要来源之一。大豆起源于我国，已有5000多年的栽培历史。大豆在农业、工业、医学等方面都有极为重要的用途。大豆营养丰富，种子含有40％蛋白质和20％脂肪，还有丰富的异黄酮、卵磷脂、维生素e、皂素等生理活性物质。转基因技术作为一项新兴的生物技术，为生物新品种的培育提供了新的技术手段。转基因技术被广泛应用于大豆育种中，培育出了有重要经济价值的大豆新品种。转基因大豆也成为世界上商品化时间最早、推广应用速度最快的转基因作物。
[0003]
草甘膦是一种优秀的广谱灭生性除草剂，具有除草性能优异、成本低廉、容易降解等优点，栽培抗草甘膦作物可大幅度降低杂草防治成本，因此培育抗草甘膦转基因作物成为转基因作物研发的重点。如中国发明专利申请(申请号：cn201110009329.0)公开了高抗草甘膦的g10evo-epsps基因是由杭州瑞丰生物科技有限公司研发、拥有自主知识产权的功能基因，目前已成功导入到玉米、大豆、棉花和水稻等作物中，并在其中稳定地整合和表达。但是，仍需要对转基因大豆草甘膦抗性外源基因表达量和外源基因插入拷贝数等进行定量检测分析，才能进一步满足我国转基因生物安全监管需求，为转基因生物新品种培育重大专项的顺利实施提供保障和支撑，推动我国农业转基因研究与应用健康发展。
[0004]
数字pcr是继实时定量pcr之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个dna分子转移入独立的反应室，pcr扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。数字pcr技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。


技术实现要素：

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为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的数字pcr方法，利用根据大豆g10evo-epsps基因设计的特异性引物对和探针进行数字pcr扩增，具有特异性好、准确度和灵敏度高等优势，可以很好的应用于转基因大豆g10evo-epsps基因的定量检测。
[0006]
为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：
[0007]
一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的数字pcr方法，该方法包括如下的步骤：
[0008]
1)提取转基因大豆基因组dna；
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2)在微滴生成卡中加入pcr体系和微滴生成油生成微滴，将生成的微滴转移到pcr
管中进行pcr扩增反应；所述pcr扩增引物对和探针序列如下：正向引物f4：ttaccgtgagaggtggtagacct；反向引物r4：gtggtatcaccctcagcgaag；探针p4：5
′
fam-ttccttcaccgacgcc-mgb3
′
。
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3)扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用软件quantasoft version 1.6.6.0320分析实验数据，获得绝对定量结果。
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优选，该方法采用的微滴式数字pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火45s，共进行45次循环，温度速率2℃/s；60℃延伸1min；4℃保存；
[0012]
pcr反应体系如下：
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本申请由于采用了以上的技术方案，提供了一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的数字pcr方法，该方法采用了一种针对大豆中g10evo-epsps基因设计的特异性引物对和探针，所述引物对和探针具备很高的特异性和灵敏度，同时采用的数字pcr反应技术比实时荧光定量pcr方法具有更准确和灵敏的优势，因此本发明在转基因大豆g10evo-epsps基因检测应用中具有良好的发展前景。
附图说明
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图1五种引物荧光定量pcr标准曲线。
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图2 g10evo-epsps-4荧光定量pcr结果。
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图3 g10evo-epsps引物探针浓度筛选。
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图4数字pcr退火温度优化pcr扩增热图。
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图5 lectin特异性检测反应热图。
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图6g10evo-epsps转化体特异性检测反应热图。
具体实施方式
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实施例1实验设计引物探针序列
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针对g10evo-epsps基因导入大豆后，设计了五组该基因的特异性引物/探针序列，如表1。
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表1 g10evo-epsps基因引物及探针序列
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f:正向引物，r:反向引物，p：探针
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以转基因大豆g10evo-epsps为样品，利用五组g10evo-epsps基因引物对及探针进行荧光定量pcr反应，同时利用内标引物对内标基因lectin进行荧光定量pcr反应，分别得到五组g10evo-epsps标准曲线和一组lectin标准曲线，如图1所示，lectin、g10evo-epsps-1、g10evo-epsps-2、g10evo-epsps-3、g10evo-epsps-4和g10evo-epsps-5的扩增效率e分别为93.6％、92％、91.8％、94.9％、93.3％和99.9％。根据实验结果五种引物探针效果均较好，但和内标准基因lectin引物探针相比较，第四对引物探针(g10evo-epsps-4)扩增效率和内标准基因引物探针更为接近，另外根据图2所示，g10evo-epsps-4引物的荧光定量pcr扩增曲线质量很好，因此选用g10evo-epsps-4即第四对引物探针进行后续检测方法的建立以及特异性等实验。
[0027]
实施例2数字pcr方法
[0028]
2.1引物探针浓度筛选，反应条件的优化
[0029]
如图3所示，转基因大豆g10evo-epsps作为检测样品，通过引物/探针几种浓度配比进行微滴数字pcr，优化反应体系中引物/探针的终浓度，设置了引物/探针浓度的不同组合如表2。对反应效率进行考察后确定了本项目后续测试引物浓度为0.5μmol/l，探针浓度为0.25μmol/l。
[0030]
表2引物探针浓度配比
[0031][0032]
pcr反应程序中退火温度的高低对微滴下雨现象有显著的影响，在反应程序的退火环节，设置了温度梯度，得到数据如表3所示。如图4所示，根据pcr反应的热图，g10evo-epsps以及lectin基因在不同的退火温度下，微滴的荧光强度存在较显著差异。比较不同退火温度的数字pcr扩增热图，发现在退火温度为60℃时，没有明显的下雨现象，确定数字pcr的最佳退火温度60℃。
[0033]
表3不同退火温度的优化
[0034][0035]
2.2微滴数字pcr检测反应体系和程序
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微滴数字pcr检测反应体系：
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表4微滴数字pcr检测反应体系
[0038][0039]
根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。
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pcr检测反应程序：
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95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火45s，共进行45次循环，温度速率2℃/s；60℃延伸1min；4℃保存。
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实施例3微滴数字pcr方法特异性检测
[0043]
以大豆g10evo-epsps(g10)、其他转基因大豆混样(gts40-3-2、mon89788、cv127、a5547-127、a2704-12、305423、356043、mon88302、73496、mon87769、mon87705、fg72、das68416-4、每种转化体含量为1％，以非转基因大豆为填充物)、转基因玉米(bt11、bt176、mon810、mon863、ga21、nk603、t25、tc1507、mon89034、mon88017、59122、mir604、3272、mon87460、mir162、das40278-9、双抗12-5、ie09s034、c0030.3.5、c0010.3.7、4114、mon87427、5307，每种转化体含量为1％，以非转基因玉米为填充物)、转基因水稻(tt51-1、科丰6号、克螟稻、m12、科丰8号、科丰2号、g6h1、t1c-19，每种转化体含量为1％，以非转基因水稻为填充物)、转基因油菜(ms1、ms8、rf1、rf2、rf3、t45、oxy235、topas19/2、mon88302、73496，每种转化体含量为1％，以非转基因油菜为填充物)、转基因棉花(mon531、mon1445、mon15985、llcotton25、mon88913、ghb614、cot102，每种转化体含量为1％，以非转基因棉花为填充物)和非转基因大豆为测试样品，应用引物及体系对g10evo-epsps大豆特异性检测进行测试。检测结果如图5和图6，表明仅抗草甘膦大豆g10evo-epsps(g10)获得了典型的数字pcr扩增热图，表明建立的微滴数字pcr方法具有很好的特异性。(说明：转基因玉米中双抗12-5含有g10evo-epsps基因，但因为本专利设计引物探针只针对大豆中的g10evo-epsps基因，因此，此引物探针在双抗12-5中不能进行扩增。)
[0044]
以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

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