一种等温核酸扩增方法及应用与流程

[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来自埃希氏杆菌属rb69病毒的三种酶在等温核酸扩增中应用。


背景技术：

[0002]
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)是体外核酸扩增最常用的方法，自发明之日起，在生命科学研究等方面得到广泛应用。pcr反应一般包括三个步骤：变性、退火和延伸，通过不断重复该步骤，可以使少量的dna片段得到指数级的扩增，从而达到可以检测的水平。pcr技术可以将少量核酸分子进行扩增，使目的dna达到可以检测的水平，因此在多个领域被迅速应用，诸如疾病诊断、有害微生物检测、转基因检测等等。
[0003]
但pcr也有自身一些弊端，pcr的每一个循环都包括变性、退火和延伸，因此，必须需要用精密的控温热循环仪器来实现，一般都是在实验室条件下完成，难以在床旁或户外应用，由于热循环仪器体积大，价格高使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。并且pcr的操作也相对复杂，需要专业人员来进行操作，也使应用受到一定的限制。为了解决pcr的这一局限性，等温核酸扩增技术悄然兴起，等温核酸扩增技术只需要一个恒定的温度，不受热循环仪器的制约，正逐渐成为pcr的最佳替代方法。
[0004]
自二十世纪九十年代初以来，发展了很多等温核酸扩增方法，如链置换扩增(strand displacement amplification，sda)、环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification，lamp)、解旋酶依赖等温扩增(helicase dependent amplification，hda)、滚环扩增(rolling circle amplification，rca)等，这些方法的共同特点是扩增反应均在一个特定的温度下简单快速反应，从而大大的降低了对仪器的要求。但这些方法所扩增的产物多数和pcr扩增产物差异较大，从某种程度上也限制了其应用。而pcr经过几十年的发展，已经在各个领域有着广泛应用，如果扩增产物和pcr的扩增产物一样，都是双链dna，无缝对接pcr核酸检测方法，将会极大的扩大等温核酸扩增的应用范围。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)，是最接近等温pcr的方法，其扩增产物也为双链dna。国内也有类似的重组酶介导的等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification,raa)，两者都是利用重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶在等温条件下进行核酸扩增的技术。raa与rpa的区别在于raa的重组酶的来源是细菌或真菌，而rpa是以t4噬菌体dna复制机制为原理，两者的性能指标基本相似，目前已经在细菌和病毒的检测中广泛应用，但rpa和raa技术的最佳的扩增产物为500bp以内，对于对长片段扩增效果不佳，限制了其进一步的应用。
[0005]
本发明采用噬菌体rb69来源的相关蛋白，旨在扩增更长的片段，是恒温技术更广泛的应用在分子生物领域中，为表示和rpa和raa的区别，本方法称为重组酶和聚合酶等温核酸检测(recombinase and polymerase isothermal detection,rapid)方法，即rapid方法。


技术实现要素：

[0006]
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的rpa和raa技术的最佳的扩增产物为500bp以内，由于对长片段扩增效果不佳，限制了其进一步的应用的缺陷，从而提供一种用于等温核酸扩增的重组酶组合物、包括所述的重组酶组合物的等温扩增体系、一种用于等温核酸扩增试剂盒及相关应用。
[0007]
一种用于等温核酸扩增的重组酶组合物，所述组合物由uvsx蛋白、uvsy蛋白和gp32蛋白组成；所述uvsx蛋白的氨基酸序列如seq id no:17所示，所述uvsy蛋白的氨基酸序列如seq id no:18所示，所述gp32蛋白的氨基酸序列如seq id no:19所示。
[0008]
所述uvsx蛋白、uvsy蛋白和gp32蛋白的质量比为1：(0.2-4.6)：(0.77-2.3)，优选为：1：(0.34-4.6)：(0.96-1)；更优选为260:88:250。
[0009]
包括上述的重组酶组合物的等温核酸扩增体系，所述反应体系还包括反应启动剂、金黄色葡萄球菌的dna聚合酶大片段、dntp、atp、tris缓冲液、磷酸肌酸；肌酸激酶；聚乙二醇35000。
[0010]
进一步的，所述反应启动剂为二价锰离子；优选的，为1mm-10mm的二价锰离子
[0011]
50μl等温扩增体系：模板dna、每条引物420nm、260ng/μl rb69来源的uvsx蛋白、88ng/μl rb69来源的uvsy蛋白、250ng/μl rb69来源的gp32蛋白以及90ng/μl金黄色葡萄球菌的dna聚合酶大片段、240μm dntp、3mm atp、100mm tris缓冲液、40mm磷酸肌酸、90ng/μl肌酸激酶、20％(w/v)聚乙二醇35000和反应启动剂。进一步地，所述反应启动剂为2mm的二价锰离子。
[0012]
模板dna为基因组dna，其浓度为0.78-78ng/μl，优选为7.8ng/μl-78ng/μl；
[0013]
一种用于等温核酸扩增试剂盒，所述试剂盒包括上述的重组酶组合物或等温核酸扩增体系。
[0014]
一种等温核酸扩增方法，将引物和模板加入上述的等温核酸扩增体系或等温核酸扩增试剂盒，于25-45℃，恒温反应20-60min。
[0015]
进一步地，扩增的目的核酸为dna或rna。
[0016]
进一步地，扩增的目的核酸为rna时，还需在体系中加入逆转录酶m-mlv。
[0017]
上述的重组酶组合物，等温核酸扩增体系，试剂盒或方法在用于等温核酸扩增中的应用，其特征在于，扩增的目的基因片段长度为100-2000bp；优选为510-2000bp；更优选为1019-2000bp。
[0018]
重组酶组合物中各个蛋白的获得方法为：将核苷酸序列如seq id no:1所示的dna分子导入pet-28a表达载体的ndei和saci酶切位点之间，将重组载体转入大肠杆菌，将大肠杆菌培养，收集菌体，将菌体破碎，提取蛋白，纯化得到uvsx蛋白；将核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子导入pet-28a表达载体的ndei和bamhi酶切位点之间，将重组载体转入大肠杆菌，将大肠杆菌培养，收集菌体，将菌体破碎，提取蛋白，纯化得到uvsy蛋白；将核苷酸序列如seq id no:3所示的dna分子导入pet-28a表达载体的ndei和hindiii酶切位点之间，将重组载体转入大肠杆菌，将大肠杆菌培养，收集菌体，将菌体破碎，提取蛋白，纯化得到gp32蛋白。
[0019]
本发明具备如下优点：
[0020]
1、本发明中的重组酶组合物、扩增体系及试剂盒用于等温核酸扩增时，实现可长
达2000pb左右的目的片段的扩增。
[0021]
2、本发明提供的重组酶和聚合酶恒温核酸检测方法，不需要大型仪器设备，可在短时间内，实现可长达2000pb左右的目的片段的扩增，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]
图1为实施例4中添加不同金属离子的扩增结果。
[0024]
图2为实施例5中不同长度目的片段的扩增结果。
具体实施方式
[0025]
实施例1uvsx蛋白的获取
[0026]
(1)构建表达载体
[0027]
在ncbi上查找埃希氏杆菌属rb69病毒(enterobacteria phage rb69)编码重组酶uvsx的基因序列，genbank序列号为nc_004928.1，uvsx基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，uvsx基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:17所示。人工合成得到uvsx基因全长片段(核苷酸序列如seq id no:1所示)，并克隆到t载体上，然后用ndei和saci双酶切，并将此片段克隆至pet-28a表达载体的ndei和saci酶切位点之间，构建表达载体pet-28a-uvsx。
[0028]
(2)构建重组工程菌及发酵
[0029]
将重组表达载体pet-28a-uvsx转化到大肠杆菌bl21(de3)中，并涂于含30μg/ml kan平板上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1l终浓度为30μg/ml的kan的lb液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.7mm的iptg诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。
[0030]
(3)uvsx蛋白纯化
[0031]
首先用缓冲液将其菌体进行超声破碎，取上清，10000rpm离心30min，使用ni swpharose
tm 6fast flow(购买的公司及货号：ge，11-0008-87af)纯化，用缓冲液冲洗至基线水平，然后用含咪唑浓度为250mm的缓冲液洗脱蛋白，洗脱后的蛋白经过sephadex g25(ge,17-0033-01)色谱柱脱盐最终得到蛋白，-70℃保存，得到纯化后的uvsx蛋白。
[0032]
实施例2uvsy蛋白的获取
[0033]
(1)构建表达载体
[0034]
在ncbi上查找埃希氏杆菌属rb69病毒(enterobacteria phage rb69)编码重组酶uvsy的基因序列，genbank序列号为nc_004928.1。uvsy基因的核苷酸序列如seq id no:2所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:18所示，人工合成uvsy基因并克隆到t载体上，然后用ndei和bamhi双酶切，酶切得到的片段克隆至pet-28a表达载体的ndei和bamhi酶切位点之间，构建得到pet-28a-uvsy表达载体。
[0035]
(2)构建重组工程菌及发酵
[0036]
将重组表达载体uvsy转化到大肠杆菌bl21(de3)中，并涂于含30μg/ml kan平板上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1l终浓度为30μg/ml的kan的lb液体培养基中培养4h，加入终浓度为0.5mm的iptg诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。
[0037]
(3)uvsy蛋白纯化
[0038]
同实施例1，得到纯化后的uvsy蛋白。
[0039]
实施例3gp32蛋白的获取
[0040]
(1)构建表达载体
[0041]
在ncbi上查找埃希氏杆菌属rb69病毒(enterobacteria phage rb69)编码重组酶gp32的基因序列，genbank序列号为nc_004928.1。gp32基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no:19所示。人工合成gp32基因并克隆到t载体上，然后用ndei-hindiii双酶切,并将此片段克隆至pet-28a表达载体的ndei和hindiii酶切位点之间，构建表达载体pet-28a-gp32。
[0042]
(2)构建重组工程菌及发酵
[0043]
将重组表达载体pet-28a-gp32转化到大肠杆菌bl21(de3)中，并涂于含30μg/ml kan平板上，37℃培养12h-16h，挑取单克隆菌株，加入1l终浓度为30μg/ml的kan的lb液体培养基中培养4h，加入终浓度为1mm的iptg诱导，30℃过夜培养，收取菌液，5000rpm离心30min，得到菌体。
[0044]
(3)gp32蛋白的纯化
[0045]
同实施例1，得到纯化后的gp32蛋白。
[0046]
实施例4重组酶(噬菌体rb69来源的uvsx蛋白、rb69来源的uvsy蛋白、rb69来源的gp32蛋白)用于等温核酸扩增
[0047]
(1)拟南芥基因组dna提取
[0048]
采用takara的植物dna提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取拟南芥叶片的基因组dna。
[0049]
(2)本实验中选择引物f1(seq id no:4)和r3(seq id no:11)，进行下述反应，引物对的靶标序列见seq id no:16的662-1099位。
[0050]
(3)反应体系
[0051]
配置反应体系(50μl体系)：1μl模板dna、每条引物420nm、260ng/μl rb69来源的uvsx蛋白、88ng/μl rb69来源的uvsy蛋白、250ng/μl rb69来源的gp32蛋白以及90ng/μl金黄色葡萄球菌的dna聚合酶大片段(北京百奥莱博科技有限公司，货号mt0192)、240μm dntp、3mm atp、100mm tris缓冲液、40mm磷酸肌酸；90ng/μl肌酸激酶；20％(w/v)聚乙二醇35000。
[0052]
(4)进行以下组反应：
[0053]
(a1)(3)中反应体系的dna模板为双蒸水，加入终浓度为14mm的醋酸镁启动剂；
[0054]
(a2)(3)中反应体系的dna模板为双蒸水,加入终浓度为2mm的氯化锰启动剂；
[0055]
(b1)(3)中反应体系的dna模板为拟南芥基因组dna原液(78ng/μl)，加入终浓度为14mm的醋酸镁启动剂；
[0056]
(b2)(3)中反应体系的dna模板为拟南芥基因组dna原液,加入终浓度为2mm的氯化
锰启动剂；
[0057]
(c1)(3)中反应体系的dna模板为10倍体积稀释的拟南芥基因组dna，加入终浓度为14mm的醋酸镁启动剂；
[0058]
(c2)(3)中反应体系的dna模板为10倍体积稀释的拟南芥基因组dna,加入终浓度为2mm的氯化锰启动剂；
[0059]
(d1)(3)中反应体系的dna模板为100倍体积稀释的拟南芥基因组dna，加入终浓度为14mm的醋酸镁启动剂；
[0060]
(d2)(3)中反应体系的dna模板为100倍体积稀释的拟南芥基因组dna,加入终浓度为2mm的氯化锰启动剂；
[0061]
几组反应体系在37℃，反应40min。
[0062]
(5)结果检测
[0063]
反应结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝聚电泳结果如图1所示，泳道m为marker，其中泳道1-4为使用醋酸镁为启动剂的扩增情况，泳道5-8为使用氯化锰为启动剂的扩增情况。具体的，泳道1为(a1)、泳道5为(a2)、泳道2为(d1)、泳道6为(d2)、泳道3为(c1)、泳道7为(c2)，泳道4为(b1)、泳道8为(b2)。
[0064]
结果表明，本实施例的重组酶和聚合酶等温核酸检测(rapid)使用重组酶(噬菌体rb69来源的uvsx蛋白、rb69来源的uvsy蛋白、rb69来源的gp32蛋白)，采用二价锰离子作为启动剂时，扩增的效果要比镁离子好。
[0065]
实施例5不同基因长度片段扩增
[0066]
(1)拟南芥基因组dna提取
[0067]
采用takara的植物dna提取试剂盒，按照使用说明书对提取拟南芥叶片的基因组dna。
[0068]
(2)引物序列
[0069]
上游引物f1(seq id no:4)、上游引物f2(seq id no:5)、上游引物f3(seq id no:6)、上游引物f4(seq id no:7)、上游引物f5(seq id no:8)、下游引物r1(seq id no:9)、下游引物r2(seq id no:10)、下游引物r3(seq id no:11)、下游引物r4(seq id no:12)、下游引物r5(seq id no:13)、下游引物r6(seq id no:14)、下游引物r7(seq id no:15)。
[0070]
(3)反应体系
[0071]
50μl体系：1μl拟南芥基因组dna(没有稀释)、每条引物的浓度为420nm、260ng/μl rb69来源的uvsx蛋白、88ng/μl rb69来源的uvsy蛋白、250ng/μl rb69来源的gp32蛋白以及90ng/μl金黄色葡萄球菌的dna聚合酶大片段、240μm dntp、3mm atp、100mm tris缓冲液、40mm磷酸肌酸；90ng/μl肌酸激酶；20％(w/v)聚乙二醇35000。
[0072]
(4)反应设置
[0073]
配置10个反应体系，每个反应体系中加入下表中的1个引物对。
[0074]
引物对目的条带大小(bp)引物对目的条带大小(bp)f1/r1242f3/r4661f1/r2355f3/r5816f1/r3438f2/r61019f2/r2510f5/r72004
f2/r3593f4/r51036
[0075]
(5)启动反应
[0076]
加入终浓度为2mm的氯化锰启动反应，37℃，反应40min。
[0077]
(6)结果检测
[0078]
反应结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝聚电泳结果如图2所示，图1中泳道m为marker，泳道1为f1/r1引物的扩增情况，泳道2为f1/r2引物的扩增情况，泳道3为f1/r3引物的扩增情况，泳道4为f2/r2引物的扩增情况，泳道5为f2/r3引物的扩增情况，泳道6为f3/r4引物的扩增情况，泳道7为f3/r5引物的扩增情况，泳道8为f2/r6引物的扩增情况，泳道9为f5/r7引物的扩增情况，泳道10为f4/r5引物的扩增情况。
[0079]
结果表明，本实施例的重组酶和聚合酶等温核酸检测(rapid)法对拟南芥基因组有很好的扩增效果，并且可以有效的扩增200-2000bp的基因片段。
[0080]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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