一种毕赤酵母无糖培养基及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于培养基技术领域，具体涉及一种毕赤酵母无糖培养基及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
在生物发酵技术中，毕赤酵母作为重要甲醇利用型真核细胞宿主，可以在甲醇单一碳源培养条件下表达多种具有复杂三级及四级结构的外源蛋白。以醇氧化酶aox启动子引导的外源基因表达表达调控是毕赤酵母工程菌驯化的主要手段，有效地激活aox启动子可大大提高毕赤酵母工程菌外源蛋白的表达能力。实验证明，aox对于外源基因表达的调控作用由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制。细胞在甲醇碳源培养基中生长时，醇氧化酶aox丰度达细胞可溶性蛋白的30％，外源基因被大量表达；而在葡萄糖、甘油或乙醇碳源培养细胞中则不表达；在非甲醇碳源培养基中加入甲醇后，外源基因重新被诱导表达。同时，实验证明甲醇培养条件下糖异生过程旺盛，氨基酸合成量和细胞干重都高于糖类碳源培养。故以甲醇为主要碳源有利于提高毕赤酵母工程菌外源蛋白的表达能力。而需要高表达外源蛋白就需要启动丙酮酸代谢通路，激活aox启动子，目前这一问题领域中难以解决。


技术实现要素：

[0003]
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型的毕赤酵母无糖培养基。本发明的培养基以低浓度甲醇作为主要碳源代替糖类碳源，同时加入非糖类碳源甘油作为补充碳源，可以有效的激活aox启动子，并解决由于甲醇生物毒性导致的碳源不足问题，有利于毕赤酵母工程菌生长效率和外源蛋白表达效率的提高。
[0004]
本发明提供所述赤酵母无糖培养基的制备方法和应用。
[0005]
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种毕赤酵母无糖培养基，主要由甲醇、甘油、ynb和去离子水组成，所述毕赤酵母无糖培养以去离子水为溶剂，使得培养基中甲醇最终浓度为8-8.5g/l，甘油最终浓度为45-49g/l，ynb最终浓度为13-13.4g/l。
[0006]
作为优选，所述甲醇最终浓度为8.5g/l，甘油最终浓度为49g/l，ynb最终浓度为13.4g/l。
[0007]
进一步地，所述毕赤酵母无糖培养基中还包括vb
7
，其最终浓度为0～400μg/l。
[0008]
上述三种情况为赤酵母无糖液体培养基，当需要配制赤酵母无糖固体培养基时需要加入琼脂糖。
[0009]
更进一步地，所述毕赤酵母无糖培养基为固体培养基时其中还包括琼脂糖，琼脂糖最终成胶浓度为15～20g/l。
[0010]
作为优选，所述培养基中甲醇最终浓度为8-8.5g/l，甘油最终浓度为45-49g/l，ynb最终浓度为13-13.4g/l，vb
7
最终浓度为0～400μg/l，琼脂糖最终成胶浓度为15～20g/l。
[0011]
本发明所述的毕赤酵母无糖培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0012]
(1)配制碳源原液
[0013]
将甲醇、甘油溶于去离子水，使得甲醇和甘油的浓度分别为80-85g/l、450-490g/l，并用无菌滤菌膜除菌；
[0014]
(2)配制液体氮源
[0015]
将ynb溶于去离子水，配制ynb浓度为130-134g/l的10
×
液体氮源，并用无菌滤菌膜除菌；
[0016]
(3)将碳源原液和液体氮源溶于去离子水，使甲醇最终浓度为8-8.5g/l，甘油最终浓度为45-49g/l，ynb最终浓度为13-13.4g/l
[0017]
作为优选，步骤(1)中所述甲醇、甘油溶于去离子水为按照甲醇:甘油:去离子水的体积比为1:4:5的比例配制成10
×
碳源原液，使得甲醇和甘油的浓度分别为80-85g/l、450-490g/l；步骤(3)按照碳源原液:液体氮源:去离子水的体积比为1:1:8的比例配制成液体培养基，使甲醇最终浓度为8-8.5g/l，甘油最终浓度为45-49g/l，ynb最终浓度为13-13.4g/l。
[0018]
进一步地，步骤(3)最后加入vb
7
调节其最终浓度为0～400μg/l。
[0019]
更进一步地，步骤(3)先配制1.875％～2.5％g/ml的琼脂糖水溶液，灭菌，待琼脂糖溶液冷却至50℃～60℃后，将碳源原液和液体氮源溶于琼脂糖溶液，并加入vb7调节其最终浓度为0～400μg/l配成固体培养基，使得固体培养基中甲醇最终浓度为8-8.5g/l，甘油最终浓度为45-49g/l，ynb最终浓度为13-13.4g/l，琼脂糖最终浓度为15～20g/l。
[0020]
本发明所述的毕赤酵母无糖培养基在毕赤酵母工程菌的快速生长和外源蛋白高表达中的应用。
[0021]
本发明提出了一种极其简单但是比例配方特别的培养毕赤酵母的无糖培养基，其中本发明采用的甲醇浓度不用因甲醇的高生物毒性限制毕赤酵母培养基中毕赤酵母的生长，但是此安全浓度的甲醇不能够提供足量碳源用以供给其大量生长和蛋白表达，需添加充碳源，本发明的甘油作为一种非糖碳源，其代谢途径与甲醇代谢途径相关关联，能量效率高，有利于工程菌的快速大量生长且有利于外源蛋白表达，故加入甘油作为补充碳源，可提高毕赤酵母工程菌的生长效率和蛋白质表达效率。
[0022]
本发明另外一个重要发现就是本发明通过三种现有原料的特定浓度的组合，形成了一种即简单同时效果又好的全新的毕赤酵母的无糖培养基，有效地减少了毕赤酵母培养基的原料组成。
[0023]
本发明利用优化的无糖甲醇培养基进行毕赤酵母的生物发酵，本发明以甲醇作为主要碳源有效激活aox启动子以促进外源蛋白高效合成，以甘油作为补充碳源提供足量碳源保证菌体大量生长，从而实现甲醇利用型毕赤酵母基因工程菌的无糖培养，在提高其生长效率的同时使其外源蛋白的表达最优化。
[0024]
本发明的培养基可以有效通过激活丙酮酸代谢通路，激活aox启动子，明显增加了毕赤酵母的外源蛋白产率，经过检测，比现有培养基配方产率高两个数量级左右，是一类极为适合大规模生产外源性蛋白的培养基。
[0025]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0026]
本发明的毕赤酵母无糖培养基制备简单、材料常见、成本低廉，制备得到的培养基不易污染，不易变质，并且操作简便，可广泛应用于多种亚型的毕赤酵母工程菌的液体及固
体培养。
[0027]
本发明以非糖物质甲醇作为主要碳源，可高效特异性激活aox启动子，大大促进毕赤酵母工程菌对外源基因的表达；同时加入甘油作为补充碳源，在甲醇安全浓度内提高毕赤酵母工程菌生长效率和外源蛋白表达效率。因此本发明可广泛应用于甲醇利用型毕赤酵母基因工程菌的发酵培养。
附图说明
[0028]
图1为使用本发明培养基的蛋白产量，a为实施例1制备的毕赤酵母的无糖培养基，b、c、d为bmgy培养基、bmmy培养基、mgy培养基。
具体实施方式
[0029]
下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。
[0030]
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]
实施例1
[0032]
按照甲醇:甘油:去离子水的体积比为1:4:5的比例配制碳源原液(10
×
)并用0.22μm无菌滤菌膜滤菌。将ynb溶于去离子水配制成ynb浓度为134g/l的液体氮源(10
×
)并用0.22μm无菌滤菌膜滤菌。按照碳源原液:液体氮源:去离子水的体积比为1:1:8的比例配制成液体培养基，使甲醇最终浓度为8.5g/l，甘油最终浓度为49g/l，ynb最终浓度为13.4g/l，加入vb
7
使其最终浓度为400μg/l。从平板上挑毕赤酵母菌落于液体培养基中，置于29℃～32℃恒温摇床进行液体培养6天。
[0033]
实施例1的培养基培养毕赤酵母菌6天后，其效果明显优于同样条件下现有毕赤酵母的培养基，外源蛋白产率，经过检测，比现有培养基配方产率高两个数量级左右。
[0034]
实施例2
[0035]
按照甲醇:甘油:去离子水的体积比为1:4:5的比例配制碳源原液(10
×
)并用0.22μm无菌滤菌膜滤菌。将ynb溶于去离子水配制成ynb浓度为134g/l的液体氮源(10
×
)并用0.22μm无菌滤菌膜滤菌。将1.5g琼脂溶于80ml去离子水中，在115℃下灭菌20min。待冷却至50℃～60℃后，按照碳源原液:液体氮源:琼脂溶液的体积比为1:1:8的比例配制成固体培养基，同时加入vb
7
使其最终浓度为400μg/l，使甲醇最终浓度为8.5g/l，甘油最终浓度为49g/l，ynb最终浓度为13.4g/l，琼脂糖最终胶浓度为18.75g/l。倒平板，待琼脂糖凝固后，将50μl毕赤酵母菌液均匀涂布于平板，于28℃倒置培养6天。
[0036]
实施例3
[0037]
实施例3与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：培养基中甲醇最终浓度为8g/l，甘油最终浓度为45g/l，ynb最终浓度为13g/l，不含vb
7
。
[0038]
实施例4
[0039]
实施例4与实施例1的制备方法相同，不同之处在于：vb
7
使其最终浓度为200μg/l。
[0040]
实施例5
[0041]
实施例5与实施例2的制备方法相同，不同之处在于：琼脂糖最终胶浓度为20g/l。

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