高效表达重组hGH的重组工程菌及构建方法和应用与流程

高效表达重组hgh的重组工程菌及构建方法和应用
技术领域
[0001]
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及高效表达重组hgh的重组工程菌及构建方法和应用。


背景技术：

[0002]
人生长激素(human growth hormone, hgh)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。含有191个氨基酸残基，分子量为22kda左右，分子中无糖基化。人生长激素具有广泛的生理功能，几乎能影响所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。
[0003]
人生长激素(hgh)在人体生长发育过程中起着重要作用，能够促进骨骼、内脏和全身生长，还能促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢。hgh原来仅用于生长激素缺乏儿童矮小症，后因基因工程产品问世，临床用量足以保证，随后又将适应症范围扩大到成人生长激素缺乏、turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤恢复等症状。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。
[0004]
生长激素的种族特异性很强，动物的生长激素人类是不能应用的，只有人类自身的生长激素才具有临床治疗功能。因此过去临床应用只能从人脑垂体提取，来源十分有限，价格也非常昂贵。到了上世纪70年代后期随着分子生物学的发展，特别是基因工程技术的发展，使得利用基因工程手段大规模生产重组人生长激素成为现实。应用dna重组技术，在大肠杆菌细胞中表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径:一种是生产胞内型的重组人生长激素；另一种是生产分泌型的重组人生长激素。经实践验证，生产分泌型的hgh，虽然步骤简单，杂蛋白干扰较少，氧化型的环境利于蛋白折叠，但是其表达量很低，一般要和胞内型要差1个数量级以上。但是生产胞内型的蛋白却又存在工艺步骤复杂、杂蛋白干扰较多等缺点。此外，采用上述两种方法所得到的人生长激素还存在活性低、纯度低等缺点。因此，有必要提供一种高效表达重组hgh的重组工程菌及其构建方法。


技术实现要素：

[0005]
为实现上述目的，本发明提供一种高效表达重组hgh的重组工程菌及构建方法和应用，克服现有利用大肠杆菌表达重组hgh的方法均存在各自不同的缺点以及得到的hgh活性低、纯度低等问题。
[0006]
本发明采用如下技术方案：一方面，本发明提供一种人生长激素的编码基因，所述基因序列如seq id no：1所示：ttcccgaccatcccgctgtctcgtctgttcgacaacgctatgctgcgtgctcaccgtctgcaccagctggctttcgacacctaccaggaattcgaagaagcgtacatcccgaaagaacagaaatactctttcctgcagaacccgcagacctctctgtgcttctctgaatctatcccgaccccgtctaaccgtgaagaaacccagcagaaatctaacctggaactgctgcgtatctctctgctgctgatccagtcttggctggaaccggttcagttcctgcgttctgttttcgctaactctctggttta
cggtgcttctgactctaacgtttacgacctgctgaaagacctggaagaaggtatccagaccctgatgggtcgtctggaagacggttctccgcgtaccggtcagatcttcaaacagacctactctaaattcgacaccaactctcacaacgacgacgctctgctgaaaaactacggtctgctgtactgcttccgtaaagacatggacaaagttgaaaccttcctgcgtatcgttcagtgccgttctgttgaaggttcttgcggtttc另一方面，本发明提供一种表达基因片段，所述表达基因片段含有权利要求1所述的编码基因。
[0007]
进一步地，所述表达基因片段是通过将启动子、信号肽和人生长激素的编码基因通过蛋白融合表达后得到的。
[0008]
进一步地，所述信号肽的基因序列如seq id no：2或seq id no：3所示：seq id no：2(st-ii)：aaaaagaatatcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaatgcctatgcaseq id no：3(ompa)：aagaagacagctatagcaatagctgtagcactagctggatttgcaaccgtggcgcaggcg进一步地，所述启动子的基因序列如seq id no：4所示：atcaaatcggatttcactatataatctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagctagagaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatg一方面，本发明提供一种重组蛋白表达载体，所述重组蛋白表达载体含有如seq id no：1所示的编码基因。
[0009]
进一步地，所述重组蛋白表达载体通过将表达基因片段连接到表达载体获得。
[0010]
进一步地，所述重组蛋白表达载体的基因结构如下（实施例1，如图1所示）： lpp promoter+rbs+ st-ii+ hgh优化 + lpp terminator进一步地，所述重组蛋白表达载体的基因结构如下（实施例2，如图1所示） lpp promoter+rbs+ ompa+ hgh优化 + lpp terminator又一方面，本发明提供一种高效表达重组hgh的重组工程菌，其通过将重组蛋白表达载体导入宿主细胞后，筛选培养获得。
[0011]
进一步地，所述宿主细胞选自：bl21，包含bl21（de3）。
[0012]
一方面，本发明提供一种制备重组人生长激素的方法，包括如下步骤：步骤一：根据人生长激素全长序列进行优化，获得如seq id no：1的序列；对信号肽进行优化，获得如seq id no：2或seq id no：3所示的序列；步骤二：将优化后的人生长激素和信号肽连接得到表达基因片段；将表达基因片段与表达载体分别酶切后连接构建重组蛋白表达质粒；步骤三：将重组蛋白表达质粒转化至宿主细胞，经诱导培养表达，离心收集菌体；步骤四：将菌体破碎、离心收集上清液，获得含有人生长激素的抽提液。
[0013]
进一步地，所述表达载体为hgh表达质粒1（图1）或hgh表达质粒2（图2）。
[0014]
另一方面，本发明提供一种重组工程菌在用于生产人生长激素的用途。
[0015]
有益效果：
本发明提供的重组工程菌能高效提高蛋白产品，采用优化的hgh序列去除了稀有密码子的影响，提高了人生长激素的产量；优化了信号肽，使得hgh在合成重组蛋白表达载体过程的正确折叠，利于提高蛋白的活性。本发明的方法可兼顾表达产量，同时利于后续纯化，产物活性高。
[0016]
本发明通过设计改造了大肠杆菌外膜蛋白信号肽hgh密码子优化，并将hgh蛋白与stii信号肽或者ompa信号肽融合，将融合蛋白基因及信号肽与大肠杆菌脂蛋白lpp启动子和大肠杆菌lppt7终止子组合作为表达调控元件使重组hgh在大肠杆菌中得以高效分泌表达。
附图说明
[0017]
图1 本发明所述hgh表达质粒1载体的表达框（实施例1）；图2本发明所述hgh表达质粒2的表达框（实施例2）图3 本发明实施例1制备的重组人生长激素鉴定电泳图；图中：1.蛋白marker；2. hgh标准品；3. 表达菌株总蛋白（含重组hgh，发酵16小时）。
[0018]
图4 本发明实施例2制备的重组人生长激素鉴定电泳图；图中：1. hgh标准品；2.蛋白marker；3. 表达菌株总蛋白（含重组hgh，发酵12小时）；4. 表达菌株总蛋白（含重组hgh，发酵14小时）；5. 表达菌株总蛋白（含重组hgh，发酵16小时）。
具体实施方式
[0019]
本发明公开一种重组工程菌及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0020]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0021]
实施例1：1、优化基因的获得根据已知的hgh的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，对hgh蛋白的编码序列进行优化，获得如seq id no：1所示的dna序列。
[0022] 2、表达质粒的构建与转化宿主菌改造大肠杆菌外膜蛋白的信号肽，并以选出的大肠杆菌外膜蛋白的信号肽为前导肽引导hgh的表达，其中，所设计的信号肽如seq id no：2所示。
[0023]
用ndei和hindiii酶将合成的 st-ii-hgh基因（华大基因合成）酶切呈粘性末端，用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因；用ndei和hindiii酶酶切处理pet22b200211表达载体（将pet22b载体（来源于novagen）的pelb信号肽和t7启动子置换成plpp启动子，置换后载体命名为pet22b200211），用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因；
将回收的st-ii-hgh基因片段与回收的pet22b片段，加入t4dna连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌dh5a，涂含有100 μg/ml氨苄青霉素抗性的lb琼脂平板，经利用酶切和测序鉴定筛选连接正确的克隆，成功构建lpp-st-ii-hgh
-ꢀ
pet22b200211，命名为表达质粒1（图1），其基因结构详见图1。
[0024]
将构建的重组蛋白表达质粒hgh表达质粒1通过化学转化方法导入宿主细胞bl21中，涂含有100 μg/ml氨苄青霉素抗性的lb琼脂平板，经利用酶切和测序鉴定筛选连接正确的克隆，筛选出的正确克隆子接种到含20 ml lb种子液的250ml三角烧瓶中，培养8-12h，待od600达到0.8-1.0，按1∶10的比例接种于含200ml改良种子液的1000ml三角烧瓶中，培养8-10h左右，待od600达到1-2，按1∶10上罐发酵，流加碳源(甘油)、 镁盐、氨水调节ph6.8-7.0、温度37℃、do＞30％，待od600达到1-2，发酵结束。样品进行sds-page检测、测定蛋白含量。目的蛋白携带信号肽，周质表达后信号肽丢失，与标准品分子大小一致。如图3所示，结果显示hgh周质空间表达量最高为 8.7 % ，周质空间表达比可溶性表达，在表达量上会低，但便于后续蛋白的纯化。
[0025]
实施例21、优化基因的获得根据已知的hgh的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，对hgh蛋白的编码序列进行优化，获得如seq id no：1所示的dna序列。
[0026] 2、表达质粒的构建与转化宿主菌改造大肠杆菌外膜蛋白的信号肽，并以选出的大肠杆菌外膜蛋白的信号肽为前导肽引导hgh的表达，其中，所设计的信号肽如seq id no：3所示。
[0027]
用ndei和hindiii酶将合成的 ompa
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hgh基因酶切呈粘性末端，用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因；用ndei和hindiii酶酶切处理pet22b200211表达载体（将pet22b载体（来源于novagen）的pelb信号肽和t7启动子置换成plpp启动子，置换后载体命名为pet22b200211）），用1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因；将回收的ompa
ꢀ-
hgh基因片段与回收的pet22b200211片段，加入t4 dna连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌dh5a，涂含有100 μg/ml氨苄青霉素抗性的lb琼脂平板，经利用酶切和测序鉴定筛选连接正确的克隆，构建成功lpp
-ꢀ
ompa
ꢀ-
hgh
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pet22b200211，命名为hgh表达质粒2（图2），其基因结构详见图2。将构建的重组蛋白表达质粒hgh表达质粒2通过化学转化方法导入宿主细胞bl21中，涂含有100 μg/ml氨苄青霉素抗性的lb琼脂平板，经利用酶切和测序鉴定筛选连接正确的克隆，筛选出的正确克隆子接种到含20 ml lb种子液的250ml三角烧瓶中，培养8-12h，待od600达到0.8-1.0，按1∶10的比例接种于含200ml改良种子 液的1000ml三角烧瓶中，培养8-10h左右，待od600达到1-2，按1∶10上罐发酵，流加碳源(甘油)、 镁盐、氨水调节ph6.8-7.0、温度37℃、do＞30％，待od600达到1-2，发酵结束。样品进行sds-page检测、测定蛋白含量。目的蛋白携带信号肽，周质表达后信号肽丢失与理论大小一致。结果显示hgh周质空间表达量最高为 13.3 %，如图4所示。
[0028]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实
施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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