基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒的制作方法

2021-02-02 13:02:20|

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基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒
技术领域
[0001]
本发明属于核酸检测领域，尤其是涉及一种基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒。

背景技术：

[0002]
新冠病毒可以通过人传人传播，并且有14天左右的潜伏期，因此对新冠病毒的快速、高灵敏筛查非常必要。
[0003]
现有的新冠病毒检测“金标准”主要是基于反转录pcr的检测方法。但是该方法仪器复杂，成本高，非便携，不适用于对新冠病毒的现场快速检测。新兴的恒温扩增方法如重组聚合酶扩增(rpa)、环介导恒温扩增(lamp)、交叉引物恒温扩增(cpa)可在单一温度下进行，大大降低了对仪器的要求，但是其检测灵敏度有待提高。
[0004]
基于crispr的检测方法通过扩增子被向导rna识别激活cas12a酶，利用 cas12a酶的旁系切割活性切割探针实现对检测信号的二次放大，检测灵敏度可达到单分子水平。快速pcr和crispr结合的核酸检测方法被开发(ultrafast visualnucleic acid detection with crispr/cas12a and rapid pcr in single capillary，doi： https://doi.org/10.1016/j.snb.2020.128618)。但是现有的基于crispr的检测方法操作复杂，并且两步法容易造成扩增子气溶胶污染，并且有较高的背景信号干扰。
[0005]
因此开发操作简便、灵敏度高的核酸检测方法对新冠病毒的核酸现场检测有着非常重要的作用。

技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种新型的基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒 rna核酸检测试剂盒。
[0007]
本发明的试剂盒基于反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)和crispr一体化反应，能够实现对新冠病毒rna的逆转录恒温扩增和crispr的一体化、可视化检测。
[0008]
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009]
本发明提供一种基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒，包括两个部分：反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)体系和crispr切割体系，两者在反应前物理分隔成溶液不连通的两部分。
[0010]
在rt-rpa扩增完成后将反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)体系和crispr 切割体系混匀，混匀体系中的各试剂浓度称为工作浓度。
[0011]
进一步地，反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)体系的体积尽可能不小于混匀后总反应体积的4/5，crispr切割体系的体积尽可能不大于混匀后总反应体积的 1/5。
[0012]
进一步地，以25ul总反应体积为例，rt-rpa体系的体积为20-25ul，crispr 切割体系的体积不大于5ul。
[0013]
进一步地，rt-rpa体系中含有rpa酶冻干粉，rehydration rpa buffer，neb
buffer 2.1，反转录酶，rnase inhibitor，醋酸镁，引物，模板。
[0014]
进一步地，crispr切割体系中含有cas12a酶，向导rna(crrna)，单链 dna荧光猝灭探针(ssdna荧光猝灭探针)。
[0015]
进一步地，以反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)体系和crispr切割体系混匀后的混匀体系体积为25ul时，
[0016]
(1)rpa酶冻干粉和rehydration rpa buffer均来自于twist商业化试剂盒，两者的工作浓度均为1x。
[0017]
(2)反转录酶的添加量为0.5ul-1ul。
[0018]
(3)neb buffer 2.1的添加量为2ul。
[0019]
(4)醋酸镁将总反应体系中的镁离子工作浓度补足至10-14mm。
[0020]
(5)rnase inhibitor的添加量为4-10unit。
[0021]
(6)引物的工作浓度为0.1-0.5um。
[0022]
(7)cas12a酶的工作浓度为0.1-0.5um。
[0023]
(8)crrna的工作浓度为cas12a酶工作浓度的1-10倍，crrna的工作浓度为0.1-5um。
[0024]
(9)ssdna荧光猝灭探针的工作浓度为0.2um-1um。
[0025]
进一步地，rt-rpa引物序列为：
[0026]
sars-cov-2f:atgatatcctttcacgtcttgacaaagttgagg
[0027]
sars-cov-2r:gaaggacataagatgatagccctttccacaaaaa
[0028]
crrna序列为： gaauuucuacuguuguagau-guagcagcaagauuagcagaagcu；
[0029]
ssdna荧光猝灭探针序列为：5
’
6-fam-ttatt-3
’
bhq。
[0030]
反转录重组聚合酶扩增(rt-rpa)体系和crispr切割体系物理分隔的方式包括但不限于将rt-rpa体系置于管底部，crispr切割体系置于管盖内；或者将 rt-rpa体系和crispr体系分别置于两个相连的管中。
[0031]
优选地，将rt-rpa体系置于管底部，crispr切割体系置于管盖内，这样检测试剂盒整个反应可以在同一管中进行，只在加样时开盖一次，大大简化了操作并且避免了扩增子干扰的风险，检测灵敏度可达单分子水平，并且只需要一个简单的热块和便携蓝光灯即可实现检测，适用于对新冠病毒的现场快速高灵敏筛查。
[0032]
此外，本发明还提供基于rt-rpa和crispr的可视化新冠病毒rna核酸检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0033]
(1)配置rt-rpa体系：rpa酶冻干粉和rehydration rpa buffer均来自于twist 商业化试剂盒且工作浓度均配置为1x，反转录酶的添加量为0.5ul-2ul，neb buffer 2.1的添加量为2ul，醋酸镁将总反应体系中的镁离子工作浓度补足至10-14mm， rnase inhibitor的添加量为4-10unit，引物的工作浓度为0.36-0.4um；
[0034]
(2)配置crispr切割体系：cas12a酶的工作浓度为0.1-0.5um，crrna的工作浓度为cas12a酶工作浓度的1-10倍，crrna的工作浓度为0.1-5um，ssdna 荧光猝灭探针的工作浓度为0.2um-1um；
[0035]
(3)将样品加入，rt-rpa扩增的反应条件为37℃反应10-30min，然后通过甩动或离心将crispr体系与rt-rpa体系混匀，置于37℃继续反应10-30min；
[0036]
(4)反应完成后在蓝光激发下(400-480nm波长)用肉眼观察结果并拍照记录，若反应后呈现出眼可见的荧光，则表示样品中含有新冠病毒rna，若反应后无荧光产生，则表示为样品中无新冠病毒rna。
[0037]
与现有技术相比，本发明的新冠病毒rna检测试剂盒中，所述的各物质添加量及工作浓度是经过反复试验得出的优选方案，偏离该方案将导致检测效果差甚至无法获得有效的检测结果。
附图说明
[0038]
图1、实施例1中不同浓度新冠病毒核酸rna的可视化检测效果图，结果展示了超高的单分子检测灵敏度。
[0039]
图2、实施例2中检测新冠病毒阳性样本(左，+)和阴性样本(右，-)的可视化检测结果。
[0040]
图3、实施例3中检测新冠病毒阳性样本(左，+)和阴性样本(右，-)的可视化检测结果。
[0041]
图4、实施例4中检测新冠病毒阳性样本(左，+)和阴性样本(右，-)的可视化检测结果。
[0042]
图5、实施例5中检测新冠病毒阳性样本(左，+)和阴性样本(右，-)的可视化检测结果。
具体实施方式
[0043]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0044]
实施例1
[0045]
对新冠病毒rna的s基因进行可视化检测。
[0046]
rt-rpa引物序列：
[0047]
sars-cov-2f:atgatatcctttcacgtcttgacaaagttgagg
[0048]
sars-cov-2r:gaaggacataagatgatagccctttccacaaaaa
[0049]
crrna序列：
[0050]
gaauuucuacuguuguagau-guagcagcaagauuagcagaagcu
[0051]
ssdna荧光猝灭探针序列：5
’
6-fam-ttatt-3
’
bhq
[0052]
具体操作：
[0053]
rt-rpa体系：rehydration rpa buffer 14.75ul(购自twist公司，货号：twistampbasic kit)，rpa酶冻干粉一半(购自twist公司，货号：twistamp basic kit)， sars-cov-2f和r引物各0.36um(生工dna合成)，rnase inhibitor 4unit(购自takara公司，货号2313q)，neb buffer 2.1 2ul(购自neb公司，货号m0653)，反转录酶0.5ul(购自takara公司，货号rr036a)，280mm醋酸镁0.53ul使得总反应体系中镁离子的工作浓度为14mm(购自twist公司，货号：twistamp basic kit)，提取纯化的sars-cov-2rna模板1ul，用水补足至20ul。为了测定该方法的灵敏度，首先对储存浓度的模板采用rnase-free去离子水进行十倍梯度稀释，然后对稀释得到的梯度浓度的模板分别取出1ul加入反应体系中做模板，同时采用1ul的rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna模板加入反应体系中作为阴性对
照样本。
[0054]
crispr切割体系：cas12a 0.25μm(购自neb公司，货号m0653)，crrna 0.5 μm(生工rna合成),ssdna荧光猝灭探针1μm(生工dna合成修饰)，用水补足至5ul。
[0055]
将rt-rpa体系置于管底，将crispr体系置于管盖内部。将反应管置于37℃ 反应30min，然后通过甩动或离心将crispr体系与rt-rpa体系混匀，置于37℃ 继续反应10min，蓝光灯采用肉眼观察结果并拍照记录。
[0056]
结果：如图1所示。
[0057]
结论：开发的试剂盒检测结果肉眼可见，并且检测灵敏度可达单分子水平，因此适用于对新冠病毒rna的高灵敏、可视化检测。
[0058]
实施例2
[0059]
反转录酶的添加量为2ul，采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna 做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0060]
结果：如图2所示。阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0061]
结论：反转录酶的添加量为2ul时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0062]
实施例3
[0063]
280mm的醋酸镁添加量为0.18ul，使得总反应体系中镁离子的工作浓度为 10mm。采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0064]
结果：如图3所示。阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0065]
结论：总反应体系中镁离子的工作浓度为10mm时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0066]
实施例4
[0067]
rnase inhibitor的添加量为10unit，采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2 rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0068]
结果：如图4所示。阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0069]
结论：rnase inhibitor的添加量为10unit时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0070]
实施例5
[0071]
引物的浓度均为0.5um，采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0072]
结果：如图5所示。阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0073]
结论：引物的浓度均为0.5um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0074]
实施例5
[0075]
引物的浓度均为0.1um，其他反应条件均同实施例4。
[0076]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0077]
结论：引物的浓度均为0.1um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0078]
实施例6
[0079]
cas12a酶的工作浓度为0.1um采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna 做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0080]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0081]
结论：cas12a酶的工作浓度为0.1um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0082]
实施例7
[0083]
cas12a酶的工作浓度为0.5um采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna 做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0084]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0085]
结论：cas12a酶的工作浓度为0.5um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0086]
实施例8
[0087]
cas12a和crrna的工作浓度均为0.1um，采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2 rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0088]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0089]
结论：cas12a和crrna的工作浓度均为0.1um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0090]
实施例9
[0091]
crrna的工作浓度为5um，采用每微升含有5x10
3
拷贝的sars-cov-2rna 做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0092]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0093]
结论：crrna的工作浓度为5um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0094]
实施例10
[0095]
ssdna荧光猝灭探针的工作浓度为0.2um，采用每微升含有5x10
3
拷贝的 sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2 rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0096]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0097]
结论：ssdna荧光猝灭探针的工作浓度为0.2um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0098]
实施例11
[0099]
ssdna荧光猝灭探针的工作浓度为1um，采用每微升含有5x10
3
拷贝的 sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2 rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0100]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0101]
结论：ssdna荧光猝灭探针的工作浓度为1um时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0102]
实施例11
[0103]
rt-rpa的反应时间为10min，混匀后cas12a的切割时间为10min，采用每微升含有5x10
5
拷贝的sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0104]
结果：阳性对照中呈现出眼可见的荧光，阴性对照中无荧光产生。
[0105]
结论：rt-rpa的反应时间为10min，混匀后cas12a的切割时间为10min时可用于对新冠病毒rna的可视化检测。
[0106]
对比实施例1
[0107]
混匀后的cas12a切割体系中镁离子的工作浓度为8mm，采用每微升含有5x10
5
拷贝的sars-cov-2rna做阳性对照模板(+)，采用rnase-free去离子水代替 sars-cov-2rna做阴性对照模板。其他反应条件均同实施例1。
[0108]
结果：阳性对照和阴性对照中均无荧光产生。
[0109]
结论：混匀后的cas12a切割体系中镁离子的工作浓度为8mm时，cas12a切割反应无法实现，因此无法实现对阳性样本和阴性样本的有效区分。
[0110]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

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