枯草芽孢杆菌、菌剂、筛选方法及应用与流程

[0001]
本发明涉及菌株培育技术领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌、菌剂、筛选方法及应用。


背景技术：

[0002]
嗜水气单胞菌广泛存在于养殖水体中，是淡水鱼类养殖过程中的主要致病菌。其中，肠道是鱼类重要的感染途径，侵入鱼体的嗜水气单胞菌，可通过肠道进入血液循环，进而导致鱼体全身性感染。嗜水气单胞菌能够造成草鱼的肠道炎症及结构的破坏；还会造成鱼类抗氧化能力降低及脂质过氧化的发生。
[0003]
使用抗生素能够有效地控制疾病的发生和蔓延，但是它干扰养殖环境中和水产动物肠道中有益微生物菌群的正常生长和繁殖，导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是病原菌的耐药性增强。利用益生菌来调节动物体内的微生态平衡，恢复机体正常生理功能、防治病害、增进健康，正逐渐成为世界范围内的热潮，由于益生菌制品无毒，没有残留，也不会产生抗药性，所以用益生菌替代抗生素有着很好的前景。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ch9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2020380。
[0005]
具体的，所述枯草芽孢杆菌ch9的16s rdna序列如seq id no.1所示。
[0006]
本发明还提供一种所述的枯草芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0007]
s1、从草鱼肠道中分离和纯化得到芽孢杆菌；
[0008]
s2、将s1得到的芽孢杆菌经过胞外产酶筛选，筛选出具有胞外产酶能力的菌株，即为所述枯草芽孢杆菌ch9。
[0009]
所述酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
[0010]
本发明还提供一种枯草芽孢杆菌菌剂，由所述的枯草芽孢杆菌菌株经活化、发酵培养制备得到。
[0011]
本发明还提供所述的枯草芽孢杆菌或其菌剂在草鱼养殖上的应用。
[0012]
本发明至少具有以下有益效果：
[0013]
本发明菌株分离自健康的草鱼肠道，具有较强的产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶的能力。将发明菌株应用到草鱼养殖中，在生长上，可以显著提高草鱼的特定生长率，降低饵料系数；减少因高脂日粮和嗜水气单胞菌感染造成的肝脏损伤，维持肝脏正常脂质代谢功能，减少脂质在肝脏中的累积。在免疫保护上，能抑制嗜水气单胞菌对草鱼肠上皮细胞的黏附，减弱嗜水气单胞菌对细胞的损伤，并对嗜水气单胞菌造成的肠粘膜结构损伤有一定的保护作用。
附图说明
[0014]
图1为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9喂养草鱼后其肝脏的油红o染色图；注：400
×
倍放大比例，各组(对照组、ah组、ah+bs组和bs+ah组)的第28d(a-d图)和第56d(e-h图)。
[0015]
图2为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9喂养草鱼后其肝脏的脂质沉积的结果图；i图：用image-pro plus 6.0软件统计的染色区域面积结果；j图：肝脏的脂肪含量；图中数值用平均值
±
标准误(n＝6)表示。不同的上标字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)。*表示28d与56d之间有显著差异(p<0.05)。
[0016]
图3为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌对草鱼肠粘膜结构的影响(200
×
放大比例)；注：a～b属于对照组的分组，c～e属于ah组的分组，c
′
～e
′
属于ah+bs组的分组；1、3、4、5、6、7分别代表感染后的天数；如图中，a-1代表a对照组的第1天的微观图，b-3代表b对照组的第3天的微观图；另外图中，s代表上皮细胞变性、坏死或脱落，i代表炎性细胞浸润，bi代表出血，g代表杯状细胞增多。
[0017]
图4为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌对草鱼肠粘膜结构的影响(200
×
放大比例)；注：f～h属于ah组的分组，f
′
～h
′
属于ah+bs组的分组；1、3、4、5、6、7分别代表感染后的天数；如f-4代表f组(ah组的分组)的第4天的微观图，f
′-
4代表f
′
组(ah+bs组的分组)的第4天的微观图；另外图中，s代表上皮细胞变性、坏死或脱落，i代表炎性细胞浸润，bi代表出血，g代表杯状细胞增多。
[0018]
图5为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞超微结构的影响的超微结构图(5000
×
)；注：对照组(a，b)，ah组(c，d)，ah+bs组(e，f)；tj代表紧密连接，er代表内质网，m代表线粒体。
[0019]
图6为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9对草鱼肠上皮细胞微丝骨架的影响的超微结构图(200
×
放大比例)；注：a-b：对照组，c-e：ah组，c
′-
e
′
：ah+bs组；1、3、7分别代表感染后的天数；v：纹状缘处微丝呈现绿色雾状。
[0020]
图7为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9对caco-2细胞形态的影响微观图(200
×
)；a：对照组，b：bs组，c：ah组，d：ah+bs组；3、6、9分别代表感染后的时间(h)。
[0021]
图8为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9对caco-2细胞超微结构的影响微观图(10000
×
)；a：对照组，b：bs组，c：ah组，d：ah+bs组；tj：紧密连接。
[0022]
图9为本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9对caco-2细胞微丝骨架的影响微观图(400
×
)；a：对照组，b：bs组，c：ah组，d：ah+bs组，1、3、6分别代表感染后的时间。
具体实施方式
[0023]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]
枯草芽孢杆菌ch9的筛选
[0025]
本发明的一实施方面，提供一株枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)ch9，于2020年7月30日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2020380，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路299号。枯草芽孢杆菌ch9的16s rdna
序列如seq id no.1所示。
[0026]
1、筛选相关材料
[0027]
筛选来源：平均体重草鱼约250g，取自汤逊湖渔场，取样前置于水族箱中暂养3d。
[0028]
培养基：fwa培养基；
[0029]
测定菌株产蛋白酶的培养基：酪蛋白10g；na
2
hpo
4 2g；琼脂13g；水1000ml；0.4％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml；ph＝7.2-7.4。
[0030]
测定菌株产脂肪酶的培养基：蛋白胨10g；nacl 5g；cacl
2 0.1g；tween-80 10ml；琼脂13g；水1000ml；ph＝7.2-7.4。
[0031]
测定菌株产淀粉酶的培养基：蛋白胨5g；酵母膏10g；nacl 5g；可溶性淀粉10g；琼脂13g；水1000ml；ph＝7.2-7.4。
[0032]
测定菌株产纤维素酶的培养基：(nh
4
)
2
so
4 2g；mgso
4 0.5g；k
2
hpo
4
1g；nacl 0.5g；羧甲基纤维素钠(cmc-na)2g；刚果红0.4g；琼脂13g；水1000ml；自然ph值。
[0033]
2、筛选方法
[0034]
s1、芽孢杆菌分离与纯化
[0035]
各取3尾鱼按无菌操作分离前肠、中肠、后肠，匀浆，采用10倍稀释法，取10-4
、10-5
、10-6
三个稀释度涂板分离细菌，分离用培养基为淡水琼脂培养基(fwa培养基)。在细菌的分离平板上，选取清晰、分散良好的菌落，纯化后接种到fwa斜面上，28℃培养24-28h后置4℃保存备用。
[0036]
s2、胞外产酶菌筛选
[0037]
将s1纯化后的细菌，分别在下述四种筛选平板(前文提供的产蛋白酶的培养基、产脂肪酶的培养基、产淀粉酶的培养基和产纤维素酶的培养基)上通过划线法形成单菌落。28℃培养48h后观察并测量水解圈直径和菌落直径。细菌分泌胞外酶能力的大小，通过比较水解圈直径/菌落直径(h/d)数值来判断，该值越大，菌株产酶能力越强，每个菌株测定5个菌落，重复3次，以确定产酶的稳定性。
[0038]
选取在每种筛选平板上均有水解圈，且水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株，即为最终筛选得到的枯草芽孢杆菌ch9。结果如表1所示，枯草芽孢杆菌ch9对能够同时产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。
[0039]
表1菌株ch9产消化酶能力
[0040][0041]
本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9的发酵液的制备包括：将枯草芽孢杆菌ch9接种在液体发酵培养基中，在25-30℃进行发酵培养，摇床震荡2-4天，得到枯草芽孢杆菌ch9的发酵液。
[0042]
其中，摇床震荡的转速为180r/min。
[0043]
液体发酵培养基按照浓度包含以下组分：10g/l的胰蛋白胨，5g/l的酵母浸出膏，20g/l的蔗糖，5g/l的nacl。液体发酵培养基在制备时的ph值为7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。
[0044]
菌株鉴定
[0045]
16s rdna序列分析：
[0046]
利用试剂盒提取ch9的dna，用引物
[0047]
27f：5
′-
agagtttgatcctggctcag-3
′
，如seq id no.2所示；
[0048]
1492r：5
′-
tacggytaccttgttacgactt-3
′
，seq id no.3所示；
[0049]
进行pcr扩增，pcr反应体系组成：2
×
taq pcr master mix 12.5μl，引物27f和1492r各1μl，模板dna 1μl，最后用灭菌双蒸水补充至25μl。反应程序为：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃2.5min，共35个循环；最后72℃10min，4℃结束反应。pcr扩增产物经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，产物经切胶回收后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。枯草芽孢杆菌ch9的16s rdna序列如seq id no.1所示。序列在genbank上进行blast比对，鉴定结果表明，本菌株与枯草芽孢杆菌(b.subtilis)高度同源，确定并命名为枯草芽孢杆菌ch9，枯草芽孢杆菌ch9的16s rdna序列如seq id no.1所示，于2020年7月30日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2020380，保藏地址湖北省武汉市武昌区八一路299号。
[0050]
应用
[0051]
本发明实施例进行了枯草芽孢杆菌ch9及其发酵液对草鱼养殖中进行应用研究，研究内容如下。
[0052]
1、对草鱼生长、肝脏脂质代谢的影响
[0053]
1.1试验方法
[0054]
试验分组：对实验鱼饥饿24h，测量体长和体重，即开始正式实验，选取外观健康、规格一致(平均体重为50.53
±
0.70g)的草鱼随机分配到12个容量为300l的养殖缸(一共4个组，每组三个重复，如表2)，每缸25尾。
[0055]
表2实验分组
[0056][0057]
表3基础饲料配方及营养成分
[0058][0059][0060]
注：
1
维生素预混料(mg/kg)：维生素a，6500iu；维生素d
3
，4500iu；维生素c，120mg；维生素e，25mg；维生素k
3
，5mg；维生素b
1
，12.5mg；维生素b
2
，12.5mg；维生素b
6
，15.0mg；维生素b
12
，0.025mg；烟酰胺，50mg；泛酸，40mg；肌醇，75mg；叶酸，2.5mg；生物素，0.08mg。
2
矿物质预混料(mg/kg)：氯化钠，1.0；硫酸镁，15.0；磷酸二氢钠，25.0；六水合氯化铝，0.06；磷酸二氢钾，32.0；磷酸二氢钙，20.0；柠檬酸铁，2.5；乳酸钙，3.5；七水硫酸锌，0.353；四水硫酸锰，0.162；五水硫酸铜，0.031；六水合氯化钴，0.001；碘酸钾，0.003；纤维素，0.39。
[0061]
投喂程序：将对照组、ah组、ah+bs组投喂基础饲料28d，bs+ah组投喂含有枯草芽孢杆菌ch9的基础饲料(其中，ch9的含量为10
7
cfu/g)28d；
[0062]
然后将对照组的草鱼于腹腔注射0.1ml pbs，继续投喂基础饲料至56d；ah组于腹腔注射嗜水气单胞菌a.hydrophila的菌悬液(菌浓度为10
5
cfu/ml)，继续继续投喂基础饲料至56d；ah+bs组的草鱼于腹腔注射a.hydrophila的菌悬液(菌浓度为10
5
cfu/ml)，继续投喂含有枯草芽孢杆菌ch9的基础饲料(其中，ch9的含量为10
7
cfu/g)至56d；bs+ah组草鱼于腹腔注射a.hydrophila的菌悬液(菌浓度为10
5
cfu/ml)后，继续投喂基础饲料至56d。
[0063]
上述含枯草芽孢杆菌ch9的基础饲料是将枯草芽孢杆菌ch9的菌粉混入基础饲料中制成的。
[0064]
枯草芽孢杆菌ch9的菌粉制备方法包括：将枯草芽孢杆菌ch9由斜面接种至上述实施例提供的液体培养基中，液体发酵培养基按照浓度包含以下组分：10g/l的胰蛋白胨，5g/l的酵母浸出膏，20g/l的蔗糖，5g/l的nacl。液体发酵培养基在制备时的ph值为7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。发酵18-24h，至菌体终浓度不低于10
9
cfu/ml后，添加保护剂等，冷冻干燥制成菌粉备用。
[0065]
取样：分别在养殖28d和56d后，将草鱼饥饿24h。用ms-222麻醉后，将每缸鱼计数并称重。然后，每组随机选择24尾鱼取样(即每个缸取8尾鱼)。用其中6尾鱼测量个体的体长、
体重，然后从尾静脉取血以获得血清，用于血清生化指标的分析，最后在冰上解剖并分离出内脏和肝脏，称得内脏重量和肝脏重量；6尾鱼立即用无菌剪分离肝脏并迅速在液氮中冷冻，存储在-80℃(不超过2w)用于总rna提取及抗氧化酶的测定；6尾鱼取其肝脏用于肝脏脂质含量的测定；6尾鱼取肝脏放入多聚甲醛固定液固定以备后续冰冻切片。
[0066]
表4缩略词表
[0067][0068]
表4中，
[0069]
1)成活率(survival rate,sr,％)＝100
×
(终尾数/初尾数)
[0070]
2)体增重(weight gain,wg,g)＝末体重-初体重
[0071]
3)体增重率(weight gain rate,wgr,％)＝100
×
(末体重-初体重)/初体重
[0072]
4)特定生长率(special growth rate,sgr,％/d)＝100
×
(ln末体重-ln初体重)/饲养天数
[0073]
5)摄食量(food intake,fi,g/fish)＝饲料消耗量(g,干重)/鱼数量
[0074]
6)饲料系数(feed conversion rate,fcr)＝每缸投喂饲料总量/每缸鱼体总增重量
[0075]
1.2油红o染色分析
[0076]
肝脏样品用多聚甲醛固定48h后，分别先后使用15％和30％的蔗糖溶液脱水，再用oct包埋剂进行包埋，使用冷冻切片机切片(厚度8μm)，用油红o进行染色；在显微镜下拍照，如图1所示。
[0077]
从每个样本中随机选取10个视野，用image-pro plus 6.0软件计算肝组织中染成红色的脂滴的相对面积，采用双盲法统计各图，汇总得到结果，如图2所示。
[0078]
1.3脂肪含量的测定
[0079]
将肝脏样品在-50℃冷冻干燥24h，然后用索氏抽提法测定肝脏的粗脂肪含量。将风干试样质量记为m，已恒重的抽提后滤纸质量记为m1，已恒重的抽提后滤纸和脱脂样品的质量记为m2，用公式：脂肪含量(％)＝100％
×
(m+m1-m2)/m，计算肝脏粗脂肪含量。
[0080]
1.4血清生化指标测定
[0081]
血清胆固醇(cho)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)含量以及血清谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)活性采用荷兰威图全自动生化分析仪测定，试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。结果如表4所示。
[0082]
1.5结果
[0083]
图1中肝脏组织切片经染色后，脂质呈红色，细胞核呈蓝色。
[0084]
图2中：
[0085]
1、油红o染色结果(a-h)及对油红o染色的脂质滴所占相对面积统计结果(i)显示：28d时油红o染色的脂质滴面积在ah组显著增加(p<0.05)，而在bs+ah组及ah+bs组变化无统计学差异(p>0.05)；第56d时各组脂质滴面积无显著差异(p>0.05)。
[0086]
2、j图为肝脏脂肪含量测定结果：第28d时，ah组的脂肪含量显著高于对照组(p<0.05)，ah+bs和bs+ah组脂肪含量与ah组相比显著降低(p<0.05)。第56d时，各组肝脏脂肪含量均无统计学差异(p>0.05)。对照组、bs+ah组及ah+bs组在第56d时的肝脏脂肪含量显著高于第28d时的脂肪含量(p<0.05)。
[0087]
肝脏的脂肪含量及油红o染色结果表明，嗜水气单胞菌能够造成草鱼肝脏的脂质积累，而通过饲料中添加枯草芽孢杆菌可以改善这种状况，减少脂质在草鱼肝脏中的积累。具体体现为第28d时，ah+bs和bs+ah组草鱼肝脏脂肪含量显著低于ah组，且与对照组肝脏脂肪含量处于同一水平。
[0088]
表5枯草芽孢杆菌ch9对草鱼生长性能及摄食量的影响
[0089][0090][0091]
注：表中数值用平均值
±
标准误(n＝3重复缸)表示。每行数值后不同的字母表示差异显著(p<0.05)。
[0092]
表5得出，从第28d开始，投喂了益生菌饲料的草鱼表现出更好的生长性能，且在第
56d时，无论是在注射嗜水气单胞菌前投喂益生菌(bs+ah组)还是在注射嗜水气单胞菌后投喂益生菌(ah+bs组)，生长性能都显著优于未投喂益生菌的组(对照组和ah组)，且ah+bs组的fcr(饲料系数)最小，表明饲料中添加枯草芽孢杆菌ch9能促进草鱼生长，并提高饲料利用效率。
[0093]
表6益生枯草芽孢杆菌对草鱼血清生化指标的影响
[0094][0095]
注：表中数值用平均值
±
标准误(n＝6)表示。每行数值后不同的字母表示差异显著(p<0.05)。
[0096]
表6血清生化指标结果显示，ah组相对于对照组，在注射嗜水气单胞菌后第28d，tg显著降低，至第56d时cho和ldl-c显著降低，hdl-c也有降低的趋势；而ah+bs组和bs+ah组的结果表明，无论是注射嗜水气单胞菌之前投喂枯草芽孢杆菌饲料还是注射之后投喂枯草芽孢杆菌饲料，均能改善这种血脂降低的状况，使血脂恢复到与对照组相同的水平。另外，ah+bs组和bs+ah组的结果表明，添加枯草芽孢杆菌后，此二组别的血清中ast和alt活性较ah组显著下降，表明枯草芽孢杆菌ch9可能减少了嗜水气单胞菌对肝脏的损害。
[0097]
2、对草鱼肠上皮细胞结构损伤的保护
[0098]
2.1体内实验
[0099]
2.1.1实验方法
[0100]
选取平均体重为(70.0
±
5.0)g的健康实验草鱼随机分成3组，分别为
①
对照组：口灌无菌pbs 0.3ml/尾后投喂不含益生菌的饲料7d；
②
ah组：口灌嗜水气单胞菌菌液0.3ml/尾(1.0
×
10
7
cfu/ml)后投喂不含益生菌的饲料7d；
③
ah+bs(枯草芽孢杆菌ch9)饲料组：口灌嗜水气单胞菌菌液0.3ml/尾后投喂含1.0
×
10
7
cfu/g bs的实验饲料7d；每组设3个重复，组间重量无显著性差异。实验鱼饲养于养殖系统中，每个缸容积300l，每缸20尾鱼。
[0101]
感染后随时观察鱼体发病情况，每组于口灌无菌pbs或嗜水气单胞菌菌液后的第1d开始取样，连续7d的同一时间段进行取样。
[0102]
2.1.2石蜡切片及组织学显微观察
[0103]
1)固定：取中肠中部新鲜组织块用冰冷的pbs洗涤，去除杂质后迅速用4％多聚甲醛固定24h以上。将肠组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀将其修平整，将修切好的肠组织和对应的标签一起放入脱水盒内。
[0104]
2)脱水：肠组织在脱水盒内依次经过不同梯度的酒精进行脱水。脱水程序：75％酒
精4h、85％酒精2h、90％酒精2h、95％酒精1h、无水乙醇i 30min、无水乙醇ii 30min、醇苯5～10min、二甲苯i 5～10min、二甲苯ii 5～10min、蜡i1h、蜡ii 1h、蜡iii 1h。
[0105]
3)包埋：将浸好蜡的肠组织于包埋框内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将肠组织取出按照包埋面的要求放入包埋框，并贴上对应的标签，于-20℃冻台冷却。待蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
[0106]
4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机温水(40℃)上将其展平，用载玻片将其捞起并放入60℃烘箱内烤片。待水烤干后取出，常温保存备用。
[0107]
5)石蜡切片脱蜡至水：将切片依次放入二甲苯i 20min、二甲苯ii 20min、无水乙醇i10min、无水乙醇ii 10min、95％酒精5min、90％酒精5min、80％酒精5min、70％酒精5min、蒸馏水洗。
[0108]
6)苏木素染细胞核：切片放入harris苏木素中染色3～8min，自来水冲洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
[0109]
7)伊红染细胞质：切片放入伊红染液中染色1～3min。
[0110]
8)脱水封片：将切片依次放入95％酒精i 5min、95％酒精ii 5min、无水乙醇i 5min、无水乙醇ii 5min、二甲苯i 5min、二甲苯ii 5min中脱水透明，将切片从二甲苯中取出后稍晾干，中性树胶封片。
[0111]
9)镜检拍照：组织切片于光学显微镜(zeiss，axio imager a2)下观察比较各组草鱼肠道粘膜结构的变化，并采集图片，如图3、图4所示。2.1.3超薄切片及超微结构观察
[0112]
1)取材：取中肠中部新鲜组织块(一般切成1cm3左右)迅速用2.5％戊二醛，于4℃保存。
[0113]
2)双固定：将固定好的肠组织浸入pbs(0.1m)中漂洗3次，离心去上清，每次20min。在4℃条件下，用预冷(4℃)的1％锇酸固定肠组织2-3h，再用pbs(0.1m)浸洗3次，每次20min。
[0114]
3)脱水：将固定好的肠组织依次用不同梯度的酒精(50％、70％、80％、85％、90％、95％、100％)进行脱水，每次10-20min(一般15min)，再用100％酒精彻底脱水2次，每次10min。
[0115]
4)渗透：渗透剂依次为丙酮：环氧树脂(2:1)、丙酮：环氧树脂(1:1)、环氧树脂，每次渗透过夜12h，37℃温箱。
[0116]
5)包埋：将渗透过的肠组织放入小胶囊中，加入包埋剂环氧树脂，固化48h，60℃温箱。
[0117]
6)切片及染色：将固化后的肠组织修整成合适的大小和形状，置于切片机(leica，em uc7)上切片，厚度约为60-100nm，再用铅和铀双染色。
[0118]
7)镜检拍照：组织切片于透射电镜(fei公司，tecnai g2 20 twin；加速电压：200kv)下观察比较各组草鱼肠上皮细胞紧密连接与超微结构的变化，并采集图片，如图5所示。
[0119]
2.1.4细胞骨架的观察
[0120]
参照石蜡切片及组织学显微观察中步骤1)-5)完成肠组织的固定、脱水、包埋、切片、石蜡切片脱蜡至水。
[0121]
6)抗原修复：组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液(ph9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火至沸后断电间隔10min后低火至沸，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0122]
7)鬼笔环肽荧光试剂染色：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按一定比例配好的鬼笔环肽荧光试剂(稀释比1:200)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
[0123]
8)dapi复染细胞核：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加dapi染液，避光室温孵育10min。
[0124]
9)封片：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
[0125]
10)镜检拍照：组织切片于正置荧光显微镜(zeiss，axio imager a2)下观察比较各组草鱼肠上皮细胞内微丝荧光强度的变化，并采集图片，如图6所示。
[0126]
2.1.5肠绒毛高度测定
[0127]
在草鱼按照2.1.1的实验方法，连续7天同一时间取样，解剖取肠道，经固定、脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、he染色、封片制成草鱼肠道组织切片。在光学显微镜下用测微尺测定肠绒毛高度，记录数据。结果如表7所示。
[0128]
2.1.6结果
[0129]
由图3、图4可知：
[0130]
1、对照组草鱼肠绒毛排列整齐，肠粘膜结构完整，未出现明显的病理变化(见图a-1，图b-3)。
[0131]
2、第1天，ah组、ah+bs组均出现了少量的炎性细胞浸润(如图c-1、图c
′-
1中“i”所示)及杯状细胞数量增多的现象(如图c-1、图c
′-
1中“g”所示)，ah组固有层轻微出血(图c-1中“bi”所示)，而ah+bs组无此现象(图c
′-
1)。
[0132]
3、第2天，ah组、ah+bs组均出现了部分上皮细胞轻微脱落(图d-2、图d
′-
2中“s”所示)及固有层出血现象(图d-2、图d
′-
2中“bi”所示)，并且ah组固有层出血现象较ah+bs组严重。
[0133]
4、第3天，ah组肠绒毛损伤程度较ah+bs组严重，粘膜上皮细胞大面积脱落(图e-3中“s”所示)，肠腔内有较多脱落的细胞碎片，且固有层水肿变粗；而ah+bs组只有部分上皮细胞出现脱落(图e
′-
3中“s”所示)。
[0134]
5、第4天，ah组、ah+bs组肠粘膜损伤程度较第3天有一定的改善。这两个组部分上皮细胞均有不同程度的脱落(图f-4、图f
′-
4中“s”所示)及粘膜层内可见炎性细胞浸润(图f-4、图f
′-
4中“i”所示)。ah组固有层轻微出血(图f-4中“bi”所示)，而ah+bs组未出现此现象(图f
′-
4所示)。
[0135]
6、第5～6天，ah组、ah+bs组肠绒毛损伤程度较第3-4d明显减轻，粘膜上皮细胞脱落、炎性细胞浸润现象均有明显改善。2个实验组均出现肠粘膜上皮杯状细胞增多(图g-5、图g
′-
5中“g”所示)，固有层出血的现象(图g-5、图g
′-
5中“bi”所示)。
[0136]
7、第7天，ah组肠绒毛损伤程度较ah+bs组严重，部分粘膜上皮细胞出现脱落(图h-7中“s”所示)，肠绒毛缩短变粗；而ah+bs组粘膜上皮细胞只是出现少量的坏死和轻微的脱落(图h
′-
7中“s”所示)。2个实验组均出现肠粘膜上皮杯状细胞增多(图h-7、图h
′-
7中“g”所示)。
[0137]
由图3、图4总体可知，ah组草鱼粘膜上皮细胞变性、坏死甚至脱落；杯状细胞增多，肠腔内有较多脱落的上皮细胞碎片和粘液；固有层出血、水肿变粗；粘膜层炎性细胞浸润。且上述病变在感染后的第3～4天较为严重，且第3d肠粘膜损伤程度最大，具体表现为肠粘膜上皮细胞大量脱落，肠腔内可见较多细胞碎片；固有层水肿变粗；粘膜层内有大量炎性细胞浸润。第5-6天上述病变有所改善，但第7d粘膜上皮细胞又出现脱落，肠绒毛缩短变粗。
[0138]
ah+bs组草鱼虽也有类似的症状出现，但与ah组相比，第3～4天粘膜上皮细胞脱落现象有所减轻。第5～7天上述病变明显改善，与ah组相比，肠粘膜结构损伤有很大的改善。
[0139]
图5可知：
[0140]
1、对照组紧密连接(图a中“tj”所示)结构清晰、整齐，中间没有缝隙；微绒毛密集且排列整齐，可见微绒毛内有丝状的微丝束，微丝束向胞质内延伸；胞浆内有较多的线粒体及内质网等，线粒体为圆杆状，嵴清晰(图b中“m”所示)。
[0141]
2、ah组(第4d)紧密连接结构严重受损，缝隙明显变宽(图c中“tj”所示)；微绒毛萎缩变短，数目减少，分布紊乱；微绒毛内的微丝束不清晰；线粒体可见明显肿胀、嵴减少(图d中“m”所示)，内质网明显扩张(图d中“er”所示)，溶酶体增多。
[0142]
3、ah+bs组(第4d)紧密连接结构损伤程度有所改善，缝隙明显变窄(图e中“tj”所示)；微绒毛数量增多且排列较整齐；线粒体数量较多，结构完整，无明显肿胀(图f中“m”所示)。
[0143]
图6可知：
[0144]
1、对照组肠上皮细胞中的微丝发出均匀的绿色荧光，且荧光强度比较强(见图a-1，b-3)。
[0145]
2、ah组第1～3天肠上皮细胞中的微丝荧光强度逐渐减弱，且第3d微丝荧光强度最弱，明显低于对照组(见图d～3)，肠上皮细胞纹状缘处的微丝呈现绿色雾状尤为明显；第4～7d微丝荧光强度(见图e-7)略有增加。
[0146]
3、ah+bs组第1～3天肠上皮细胞中的微丝荧光强度也逐渐降低，第4～7天微丝荧光强度逐渐增强(见图e
′-
7)，但微丝荧光强度均高于ah组(见图c
′-
1、图d
′-
3)。
[0147]
表7枯草芽孢杆菌对草鱼肠绒毛高度的影响
[0148][0149]
由表7可知，随着实验进行，ah组的肠绒毛高度显著降低，而对照组无明显变化；而ah+bs组的肠绒毛高度于第1～7天相对于对照组显著降低，但相对于ah组于第2～7天均有显著提升。这说明同时喂食本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9。上述体内实验表明，喂食本发
明提供的枯草芽孢杆菌ch9，对由于a.hydrophila引起的草鱼黏膜上皮细胞变性、脱落和出血等症状，具有改善作用。对于a.hydrophila引起草鱼肠绒毛的微连接结构、微绒毛数量和线粒体数量等损伤情况有改善作用。同时对于a.hydrophila引起草鱼肠上皮细胞中微丝结构破坏也具有保护作用，能够降低嗜水气单胞菌对草鱼肠绒毛的损伤，从而调节草鱼肠吸收功能，增强其分泌能力，使其小肠粘膜保持良好状态。
[0150]
2.2体外实验
[0151]
2.2.1 caco-2细胞的分组
[0152]
当caco-2细胞生长至80％-90％融合时，加入1ml左右的含0.3g/l edta+2.5g/l胰酶在37℃条件下消化细胞，1000r/min离心5min，再将细胞悬液接种于12孔细胞培养板内(每孔1ml细胞悬液)，37℃、5％co
2
条件下生长3～4d至细胞长成单层，弃去旧的细胞培养液，用无菌pbs(ph7.4)清洗细胞，再加入1ml无双抗dmem细胞培养液后进行以下实验。
[0153]
实验分为4组：
[0154]
①
对照组：先加入0.5ml无双抗dmem细胞培养液培养，再在1h时加入0.5ml无双抗dmem细胞培养液培养；
[0155]
②
芽孢杆菌组(bs组)：先加入0.5ml上述实施例提供的枯草芽孢杆菌ch9菌液(1.0
×
10
6
cfu/ml)培养，再在1h时加入0.5ml无双抗dmem细胞培养液培养；
[0156]
③
嗜水气单胞菌组(ah组)：先加入0.5ml嗜水气单胞菌菌液(1.0
×
10
6
cfu/ml)培养，再在1h时加入0.5ml无双抗dmem细胞培养液培养；
[0157]
④
嗜水气单胞菌+芽孢杆菌组(ah+bs组)：先加入0.5ml嗜水气单胞菌菌液(1.0
×
10
6
cfu/ml)培养，再在1h时加入0.5ml枯草芽孢杆菌ch9菌液(1.0
×
10
6
cfu/ml)培养；
[0158]
各处理组设3个重复，整个实验过程中细胞在37℃、5％co
2
条件下培养。
[0159]
2.2.2 caco-2细胞形态的观察
[0160]
各组分别在实验开始后3h、6h、9h时取样。取出12孔细胞培养板于倒置显微镜下观察各组细胞形态结构的变化，并拍照。如图7所示。
[0161]
2.2.3 caco-2细胞紧密连接(tj)及超微结构的观察
[0162]
当细胞在t25细胞培养瓶中生长7～10d至80％-90％融合时，弃去旧的细胞培养液，用无菌pbs(ph7.4)清洗细胞，再加入2ml无双抗dmem细胞培养液后进行以下实验。
[0163]
实验按照2.2.1将caco-2细胞的分组，各组加入的嗜水气单胞菌菌液、芽孢杆菌菌液浓度不变，仍为1.0
×
10
6
cfu/ml，剂量变为1ml，相应地各组加入的无双抗dmem细胞培养液的剂量变为1ml。
[0164]
取材：分别在实验开始后6h时取样，弃去培养液迅速加入2.5％戊二醛于4℃固定2～4h，0.1m磷酸缓冲液pbs(ph7.4)漂洗3次，每次15min，用细胞刮铲刮下，离心收集细胞沉淀(一般要求收集绿豆大小的细胞团块)。
[0165]
参照2.1.3超薄切片及超微结构观察中步骤2-7完成细胞的固定、脱水、渗透、包埋、切片及染色、镜检拍照，如图8所示。
[0166]
2.2.4 caco-2细胞微丝骨架的观察
[0167]
1)细胞的分组及取样：将细胞接种于内含无菌盖玻片的12孔细胞培养板内(每孔1ml细胞悬液)，37℃、5％co
2
条件下生长至单层，弃去旧的细胞培养液，用无菌pbs(ph7.4)清洗细胞，再加入1ml无双抗dmem细胞培养液后进行以下实验。实验按照2.2.1 caco-2细胞
的分组，分为上述4组。分别在实验开始后1h、3h、6h时取样，弃去培养基，用4％多聚甲醛固定30min，用pbs洗涤3次，每次5min。
[0168]
2)鬼笔环肽荧光试剂染色：爬片稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈(防止液体流走)，加50～100μl鬼笔环肽工作液，室温孵育2h，pbs洗涤3次，每次5min。
[0169]
3)dapi复染细胞核：爬片用pbs(ph7.4)洗涤3次，每次5min。去除pbs后在圈内滴加dapi染液，避光室温孵育10min。
[0170]
4)封片：爬片用pbs(ph7.4)洗涤3次，每次5min。爬片稍甩干后将有细胞的一面朝下用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上封片。
[0171]
5)拍照：切片于正置荧光显微镜下观察并采集图像，如图9所示。
[0172]
2.2.5结果
[0173]
图7可知：
[0174]
1、对照组和bs组的caco-2细胞均呈现多角形，单层生长呈铺路石状，在3h、6h、9h时细胞形态基本正常。
[0175]
2、ah组的caco-2细胞形态消失，细胞变圆，体积变小，在3h、6h、9h出现越来越严重的死亡、脱落现象，9h时由于大部分caco-2细胞死亡、脱落而形成了较大的空洞。
[0176]
3、ah+bs组caco-2细胞形态消失，细胞变圆，体积变小，在3h、6h、9h也出现了越来越严重的死亡、脱落现象，细胞由于死亡、脱落也形成了大小不一的空洞。但与同一时间点的ah组相比，caco-2细胞死亡、脱落的现象有明显减轻。
[0177]
图8可知：
[0178]
1、对照组和bs组的紧密连接结构整齐清晰，中间没有缝隙(图a、图b中“tj”所示)；微绒毛内可见丝状的微丝束；胞浆内有较多的线粒体及内质网等，线粒体嵴清晰。
[0179]
2、ah组(6h)紧密连接结构受到破坏，缝隙增宽，或紧密连接结构变得模糊(图c中“tj”所示)；微绒毛内的微丝束不清晰或者消失；线粒体可见明显肿胀、嵴减少或断裂甚至出现空泡化，内质网明显扩张；出现较多自噬体。
[0180]
3、ah+bs组(6h)紧密连接结构损伤程度较小，缝隙增宽不明显，紧密连接结构较ah组清晰(图d中“tj”所示)；线粒体结构完整，无明显肿胀；有少量自噬体。
[0181]
图9可知：
[0182]
1、caco-2细胞的细胞核在紫外的激发下为蓝光，微丝则为绿光。对照组、bs组细胞中的微丝发出均匀的绿色荧光，荧光主要分布在细胞膜处和细胞中央，且荧光强度较大。微丝在细胞之间的接触部位呈束状相互连接，轮廓清晰完整，无明显间隙，细胞界限清晰；细胞中央也可见不规则纤维丝，呈条索状散在分布(见图a，图b)。
[0183]
2、ah组在1h时细胞内荧光强度略有下降，部分细胞骨架条索状分布消失，微丝在细胞之间的接触部位变得模糊、毛糙不整齐(见图c-1)。在3h、6h时微丝在细胞核周围出现小区域聚集现象，其中心荧光强度很强；细胞周边部位荧光强度弱，微丝模糊呈雾状(图c-3和图c-6)。
[0184]
3、ah+bs组在1h时细胞内荧光强度略有下降，微丝在细胞之间的接触部位变得模糊、毛糙不整齐(见图c-1)。在3h、6h时微丝也出现在细胞核周围呈小区域聚集现象(图c-3和图c-6)，但与同一时间点的ah组相比，荧光强度和微丝聚集现象有一定的改善，微丝聚集
范围较ah组小，细胞膜处的微丝出现环点状断裂，微丝模糊呈雾状。
[0185]
上述体外实验表明，本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9、嗜水气单胞菌与caco-2细胞共培养时，能够减少嗜水气单胞菌致使caco-2细胞引起的死亡和脱落，还对caco-2细胞的微绒毛、线粒体和内质网等细胞器具有保护作用，同时还能改善嗜水气单胞菌引起的caco-2细胞膜出微丝断裂等损伤现状。
[0186]
由于caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同，其作为被广泛采用的小肠吸收的体外模型。由此可见，在与枯草芽孢杆菌ch9、嗜水气单胞菌与caco-2细胞共培养时，枯草芽孢杆菌ch9能够抑制嗜水气单胞菌对caco-2细胞的粘附，进而降低其引起的破坏，提供嗜水气单胞菌感染引起对caco-2细胞的氧化应激损伤的保护，从而反映出了枯草芽孢杆菌ch9的对肠上皮细胞的保护作用以及抗氧化能力。
[0187]
综上所述：
[0188]
1、本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9投喂草鱼，可减少因高脂日粮和嗜水气单胞菌感染造成的肝脏损伤以及脂质在肝脏中的累积，显著提高草鱼的特定生长率，降低饵料系数。
[0189]
2、本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9投喂草鱼，保护草鱼肠绒毛的完整性和紧密连接结构，能抑制草鱼体内由嗜水气单胞菌引起的炎症反应，对嗜水气单胞菌造成的肠粘膜结构损伤有一定的保护作用。
[0190]
3、本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9投喂草鱼，能有效地提高草鱼的抗氧化能力和免疫能力，使其免受由嗜水气单胞菌感染引起的氧化应激损伤。
[0191]
4、本发明提供的枯草芽孢杆菌ch9投喂草鱼可以抑制嗜水气单胞菌对鱼肠上皮细胞的黏附，并可减弱嗜水气单胞菌对细胞的损伤。
[0192]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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