一种改造的AMH基因序列及利用其制备AMH的方法与流程

一种改造的amh基因序列及利用其制备amh的方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物工程技术领域，具体地，本发明涉及改造的amh基因序列和氨基酸，以及其与受体蛋白amhrii共表达获得amh
n,c
及pro-amh蛋白。


背景技术：

[0002]
抗繆勒氏管激素(anti-m
ü
llerian hormone，amh)又称为繆勒氏管抑制物质(mis)，是转化生长因子β(tgf-β)超家族成员，amh主要是在初级卵泡和窦前期卵泡的颗粒细胞中合成，与卵巢功能及储备状态密切相关。它不受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，在月经周期中无周期性变化，水平恒定，相比较其他传统的生物学指标，amh是评价卵巢衰老，卵子质量最准确的生物标志物。
[0003]
amh为分子间二硫键连接的二聚体，分子量约140kda，人体内经弗林蛋白酶furin(pcsk3)或pcsk5/pc5酶切，amh被切开成110kda的n端二聚体蛋白(amh
n
)，和25kda的c端二聚体蛋白(amh
c
)。
[0004]
amh
n
和amh
c
以非共价键结合形成的蛋白复合物(amh
n,c
)，是功能活性蛋白。人体内同时还存在未被切开的共价键连接全长蛋白(pro-amh)，是低活性蛋白。天然蛋白纯化提取，收率极低，成本很高，而且这两种不同形式不同功能的amh蛋白无法区分分离(us005310880a)。重组表达amh
n,c
蛋白表达量低，难以获得。有文献及专利报道了重组表达amh
n,c
，(us005359033a；pnas,vol.93,pp.7711-7716,1996)主要策略是通过优化amh的furin(弗林蛋白酶)切点序列，促进酶切效率。通过与pc5共表达，促进酶切效率；通过建立和筛选cho稳转细胞株，提高amh
n,c
蛋白表达量。然而纯化制备获得毫克级别重组amh
n,c
蛋白仍然非常困难，无法满足抗体研发及ivd检测应用的需求。
[0005]
因此，本领域迫切需要解决提高amh的表达量的措施。


技术实现要素：

[0006]
为了解决上述本领域的不足，本发明通过将amh与受体蛋白amhrii共表达，显著提高了amh的表达量。通过对amh furin切点附近的序列设计，amh序列1与amhrii共表达可以获得amh
n,c
；amh序列2与amhrii共表达可以获得pro-amh。用哺乳细胞expi293瞬时转染摇瓶表达可以纯化获得毫克级别amh
n,c
及pro-amh蛋白。具体地，本发明提供了如下技术方案：
[0007]
在一个方面，本发明提供了一种改造的amh基因序列，其特征在于：改造的amh基因序列如seq id no:1或seq id no:2所示。
[0008]
优选的，所述amh基因序列无信号肽序列。
[0009]
优选的，seq id no:1或seq id no:2的信号肽序列可以替换为任何合适的信号肽序列，优选高表达外源信号肽。根据不同表达情况，选择合适的信号肽在本领域技术人员能力范围内，也在本发明的保护范围之内。
[0010]
在另一个方面，本发明提供了一种改造的amh氨基酸序列，其特征在于：改造的amh基因序列如seq id no:3或seq id no:4所示。
[0011]
优选的，所述amh氨基酸序列无信号肽序列。
[0012]
优选的，seq id no:3或seq id no:4的信号肽序列可以替换为任何合适的信号肽序列，优选高表达外源信号肽。根据不同表达情况，选择合适的信号肽在本领域技术人员能力范围内，也在本发明的保护范围之内。
[0013]
在又一个方面，本发明提供了一种表达载体，其特征在于：所述表达载体包含权利要求1所述的amh基因序列。
[0014]
优先地，所述表达载体为哺乳细胞表达载体。
[0015]
优先地，哺乳细胞表达载体可以选择pcdna3.1、pcmv以及其它任何表达载体。本领域技术人员能够根据实际情况，选择任何合适的表达载体，而不超出本发明的保护范围。
[0016]
在又一个方面，本发明提供了本发明所述的amh基因序列用于制备amh的用途。所述用途例如通过共表达的方式来制备amh。
[0017]
在又一个方面，本发明提供了一种制备amh的方法，其特征在于：将权利要求1所述的amh基因序列与受体蛋白amhrii基因序列共表达。
[0018]
优选地：所述方法包括：
[0019]
s1将权利要求1所述的amh基因序列和受体蛋白amhrii基因序列构建进哺乳细胞表达载体；
[0020]
s2将步骤s1的哺乳细胞表达载体瞬时转染哺乳细胞；
[0021]
s3表达amh
n,c
及pro-amh蛋白。
[0022]
优选地，所述amh基因序列和受体蛋白amhrii基因序列以4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4的比例共转染。
[0023]
更优选地，所述amh基因序列和受体蛋白amhrii基因序列以2：1的比例共转染。
[0024]
应该理解，本发明可以以任何合适的比例进行共转染，而不超出本发明的保护范围。
[0025]
优选地，所述哺乳细胞选自expi293细胞或cho细胞。应该理解，本发明可以采用任何合适的哺乳细胞，而不超出本发明的保护范围。
[0026]
本发明的显著技术效果：
[0027]
本发明方法采用amhrii与amh序列1或amhrii与amh序列2共表达，瞬时转染expi293细胞，细胞分泌上清经抗-his标记wb检测阳性。摇瓶放大细胞转染，可以纯化获得amh
n,c
和proamh。而在同等转染表达条件下，单独转染表达野生型(wt)amh序列，或表达文献中furin切点优化amh序列，或者单独表达amh序列1，amh序列2，wb均为阴性；参考文献及已有专利方法将上述所有序列分别与furin瞬时转染共表达，细胞分泌上清wb检测阴性。
[0028]
文献方法均为稳转细胞株表达制备amh，根据文献相关序列做哺乳细胞瞬时转染，wb检测阴性。本发明方法对amh序列1及amh序列2中furin切点及furin切点附近序列进行了设计优化，暴露出furin切点，expi293细胞内源性furin蛋白可以有效切开amh序列1。
[0029]
本发明方法采用amhrii<fc>融合蛋白与n端his tag融合的amh序列1及amh序列2分别共表达。amhrii<fc>或amhrii<fc>/amhc复合物蛋白可以通过protein a树脂亲和分离纯化。分离富集amhrii<fc>或amhrii<fc>/amhc复合物之后，细胞上清液再用ni螯合树脂纯化和富集amh
n,c
或proamh，经过进一步的离子柱或疏水柱精纯，可以获得重组蛋白amh
n,c
或proamh。
附图说明
[0030]
图1为amh
n,c
及proamh哺乳细胞expi293瞬时转染及蛋白表达检测结果。
[0031]
抗-his标记wb检测expi293哺乳细胞分泌上清，可以检测到<his>amh
n,c
和<his>proamh的分泌表达，
[0032]
泳道1：<his>amh
n,c
，还原电泳，
[0033]
泳道2：<his>proamh，还原电泳。
[0034]
图2为amh序列1与受体amhrii-fc共表达检查结果。
[0035]
amh序列1与受体amhrii-fc共表达，细胞表达上清先以protein a亲和柱纯化，amhrii-fc蛋白及amhrii-fc-amhc复合物得到富集挂柱。表明amh
n,c
获得表达，amhrii-fc竞争结合了一定量的amhc。如图2的泳道a和泳道b所示。
[0036]
上述protein a亲和柱流穿液<his tag>amh
n,c
再上ni螯合亲和柱纯化，ni柱洗脱蛋白经离子柱进一步纯化获得重组<his tag>amh
n,c
。如图2的泳道c和泳道d所示。
[0037]
protein a亲和柱纯化泳道a，泳道b，
[0038]
泳道a：amhrii-fc-amhc复合物，还原电泳，
[0039]
泳道b：amhrii-fc-amhc复合物，非还原电泳。
[0040]
箭头5指示sds-page泳道a中amhrii-fc蛋白，还原电泳，
[0041]
箭头6指示sds-page泳道b中amhrii-fc蛋白，非还原电泳。
[0042]
泳道a中可以观察到箭头1指示的amhc蛋白，还原电泳，
[0043]
泳道b中可以观察到箭头2指示的amhc蛋白，非还原电泳。
[0044]
泳道a箭头5指示amhrii-fc过量表达，结合了一定量的amhc蛋白(箭头1指示)，
[0045]
泳道b箭头6指示amhrii-fc非还原样品形成二聚体；箭头2指示amhc非还原样品形成二聚体。
[0046]
ni螯合亲和柱纯化泳道c，泳道d，
[0047]
泳道c:<his>amh
n,c
复合物，还原电泳，
[0048]
泳道d:<his>amh
n,c
复合物，非还原电泳。
[0049]
泳道c中可以观察到箭头3指示的amh
n
蛋白，箭头1指示的amhc蛋白，还原电泳，
[0050]
泳道d中可以观察到箭头4指示的amh
n
二聚体蛋白，箭头2指示的amh c
二聚体蛋白，非还原电泳。
[0051]
图3为amh序列2与受体amhrii-fc共表达检查结果。
[0052]
amh序列2与受体amhrii-fc共表达，细胞表达上清先以proteina亲和柱纯化，amhrii-fc蛋白得到富集挂柱。protein a亲和柱纯化流穿，再上ni螯合亲和柱纯化，ni柱洗脱蛋白经离子柱进一步纯化获得重组pro-amh蛋白(含有his tag亲和标签)如下面sds-page(图3)所示，还原电泳表观分子量70kda，非还原电泳样品蛋白为二硫键连接二聚体形式，表观分子量140kda。
具体实施方式
[0053]
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本发明，并不对发明内容进行限定。
[0054]
实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或
容易获得或制得。
[0055]
实验材料：
[0056]
expi293
tm expression system kit高密度细胞哺乳表达体系：thermo fisher scientific
[0057]
protein a树脂：ge healthcare
[0058]
镍-装载的imac树脂：ge healthcare
[0059]
phenyl-hp预装柱：ge healthcare
[0060]
蛋白a280浓度测定nanodrop:thermo fisher scientific
[0061]
咪唑(imidazole)：sigma-aldrich
[0062]
磷酸盐，tris-base，nacl等化学试剂：国药集团
[0063]
sds-page凝胶电泳系统：tanon上海天能科技有限公司
[0064]
抗-his标记抗体：金斯瑞生物科技有限公司
[0065]
millipore 3kda cutoff浓缩管：merck。
[0066]
实施例1.基因合成及哺乳细胞表达载体构建
[0067]
amh序列1与amh序列2基因由通用生物系统(安徽)有限公司合成。起始密码子atg前面加kozac序列，以ecori/hindiii酶点构建进ptt5哺乳细胞表达载体。测序正确。
[0068]
外源信号肽不仅限于本专利公开的优选信号肽，可以通过哺乳细胞表达检测，筛选出对amh序列1与amh序列2蛋白分泌表达效果好的信号肽。
[0069]
哺乳细胞表达载体可以选择pcdna3.1，pcmv等其它表达载体。
[0070]
实施例2.哺乳细胞expi293瞬时转染及蛋白表达检测
[0071]
expi293细胞培养及转染采用expi293表达体系产品手册中建议的实验条件(ref:man0007814)。细胞转染后第2天补料，第6天收获，10000rpm离心获得细胞上清。
[0072]
amh序列1表达质粒与amh rii-fc表达质粒以2：1的比例混合后共转染，质粒比例可以调整变化以促进amh序列1的表达。
[0073]
amh序列2表达质粒与amh rii-fc表达质粒以2：1的比例混合后共转染，质粒比例可以调整变化以促进amh序列2的表达。
[0074]
小试表达(即1-5ml细胞瞬时转染表达)收获的细胞表达上清经一步镍-charged imac树脂富集，洗脱，抗-his标记wb结果如图1。以判断amh
n,c
及pro-amh的表达情况。当确定目的蛋白成功表达之后，放大细胞转染，1-10l细胞转染。采取步骤3的纯化方法，纯化获得蛋白。
[0075]
amh序列1的furin切点附近序列设计，hlqssrhrrald附图蛋白表达wb检测泳道1(图1)显示，expi293细胞内源furin蛋白已足以将amh序列1切开，形成amh
n,c
，wb检测可以检测到<his>amh
n
，条带，amh
n
与amh
c
已完全被切开。wb没有检测到未被切开的amh序列1蛋白。
[0076]
amh序列2中furin切点附近序列hlqsgggggald，wt amh序列中的furin切点序列raqr被gggg四个氨基酸取代，附图蛋白表达wb检测泳道2(图1)显示，proamh获得分泌表达。
[0077]
本专利amh序列1和amh序列2可用于建立cho稳转表达株，进一步提高蛋白表达量。
[0078]
实施例3.amh
n,c
及pro-amh蛋白纯化
[0079]
一、amh
n,c
蛋白纯化
[0080]
a.摇瓶瞬时转染expi293细胞，收获分泌上清1l，以5ml柱体积的proteina预装柱，
挂柱，平衡缓冲液为20mm pb，500mm nacl，ph7.4，分泌上清上样后以平衡缓冲液冲洗5个柱体积，protein a柱上富集的蛋白以0.1m甘氨酸，ph2.9缓冲液洗脱，以1m tris-base缓冲液中和。洗脱蛋白透析到pbs，ph7.4缓冲液，以3kda cutoff浓缩管浓缩，得到amh rii-fc/amh
c
复合物蛋白。如图2泳道a，b所示。
[0081]
b.上一纯化步骤a.中，proteina柱的挂柱流穿液，以5ml柱体积的镍-装载的imac预装柱，挂柱，平衡缓冲液为20mm pb，500mm nacl，ph7.4，以20mm pb，500mm nacl，20mm咪唑，ph7.4缓冲液冲洗5个柱体积，以20mm pb，500mm nacl，50mm咪唑，ph7.4缓冲液冲洗5个柱体积。以20mm pb，500mm nacl，500mm咪唑，ph7.4缓冲液洗脱。洗脱蛋白透析到pbs，ph7.4缓冲液，以3kda cutoff浓缩管浓缩，得到amh
n,c
复合物蛋白。如图2泳道c，d所示。
[0082]
amh
n,c
复合物蛋白纯化收率0.5mg/l。
[0083]
二、pro-amh蛋白纯化
[0084]
a.摇瓶瞬时转染expi293细胞，收获分泌上清1l，以5ml柱体积的镍-装载的imac预装柱挂柱，平衡缓冲液为20mm pb，500mm nacl，ph7.4.，分泌上清上样后分别以20mm pb，500mm nacl，20mm咪唑，ph7.4缓冲液冲洗5个柱体积，以20mm pb，500mm nacl，50mm咪唑，ph7.4缓冲液冲洗5个柱体积.以20mm pb，500mm nacl，500mm咪唑，ph7.4缓冲液洗脱。
[0085]
b.上一纯化步骤a.洗脱蛋白(6-10ml)，透析到20mm pb，3m nacl，ph7.4.缓冲液中，以1ml柱体积的phenyl-hp预装柱挂柱，以20mm pb，ph7.4缓冲液梯度洗脱(salt gradient)。目的蛋白pro-amh在20mm pb，ph7.4缓冲液1m-500mm盐浓度梯度条件下被洗脱。洗脱蛋白透析到pbs，ph7.4缓冲液，以3kda cutoff浓缩管浓缩，得到proamh复合物蛋白。如图3泳道n，r所示。
[0086]
pro-amh蛋白纯化收率为0.2mg/l.
[0087]
本发明的amh蛋白制备方法可以稳定获得amh
n,c
及proamh蛋白0.2-0.5mg/l的纯化收率。
[0088]
优选高表达外源信号肽，furin切点附近序列设计以及amhrii受体共表达策略，是本发明能够得到amh蛋白关键的三个因素，也是本发明的创新点。
[0089]
amh序列1(seq id no:3)
[0090][0090][0091]
单下划线是外源信号肽；双下划线序列是本申请人特殊设计，rhrr为本申请人选
用的furin切点。斜体表示furin切点附近的序列设计。
[0092]
amh序列2(seq id no:4)
[0093][0094]
单下划线是外源信号肽；双下划线序列部分没有furin切点，斜体表示furin切点附近的序列设计。amh序列2无法被furin切开，从而形成proamh。
[0095]
wt序列https://www.uniprot.org/uniprot/p03971
[0096]
ptm/加工
[0097]
分子加工
[0098]
特征关键词位置描述信号肽1-18序列分析前肽(pro_0000033746)19-25序列分析链
i
(pro_0000033747)26-560繆勒氏管抑制因子
[0099][0100]
amh序列1基因序列(seq id no:1)：
[0101]
atgtggtggagactgtggtggctgctgctgctgctcctgctgctgtggcccatggtgtgggcccaccaccaccaccatcaccaccacagagctgaagaacccgctgtgggaacatctggcctgatcttcagagaggacctggattggcctcctggcagccctcaagaacctctgtgtctggttgctctgggcggagatagcaatggaagcagcagccctcttagagtggttggagctctgagcgcttacgaacaggcttttctgggagccgtgcaaagagctagatggggccctagagacctggctaccttcggcgtttgtaacaccggcgatagacaggctgctctgcctagccttagaagactgggcgcttggctgagagatcctggaggacagagactggtggtgctgcatctggaagaggtgacctgggaacctacccctagcctgagatttcaagagcctcctcctggaggcgctggacctcctgaactggctctgctggtgctgtatcctggacctggccctgaagtgacagtgacaagagctggactgcctggagctcaaagcctgtgtcccagcagagacaccagatacctggtgctggctgtggatagacctgccggagcttggagaggatctggactggctcttacactgcaacccagaggcgaggattctagactgagcaccgccagactgcaagctctgctgttcggcgatgaccacagatgcttcaccagaatgacccc
tgccctgctgcttcttcctagaagcgagcctgcccctcttcctgctcatggacagcttgacacagtgccctttcctcctcctagacccagcgctgaactggaagaaagcccccctagcgctgatccctttctggagaccctgaccagacttgtgagagccctgagagtgcctcctgctagagctagcgctcctagactggctctggatcccgatgctctggctggattccctcaaggactggtgaacctgtctgatcccgccgctctggaaagactgctggatggcgaagaacctctgctgctgctgcttagacctacagctgctaccacaggagatcccgcccctctgcatgatcctacaagcgccccttgggctacagctctggctagaagagtggctgccgaactgcaggctgccgctgctgaacttagaagcctgcctggactgcctcctgctacagcccctctgcttgctagactgctggctctgtgtcctggcggacctggaggactgggagatcctctgagagctctgctgctgctgaaagctctgcaaggcctgagagtggagtggagaggcagagatcacctgcagagctccaggcacaggagggccctggatagcgccggcgctacagccgctgacggcccttgtgccctgagggagctgtccgtggatctgagggccgagagatccgtgctgatccctgagacctaccaggccaacaattgccagggcgtgtgcggctggcctcagtccgacaggaaccctagatacggcaaccacgtggtgctgctgctgaagatgcaggtgagaggcgccgccctggccaggcctccttgttgtgtgcctacagcctacgccggcaagctgctgatctccctgagcgaggagagaatctccgcccaccacgtgcccaacatggtggccaccgagtgtggctgtagatga。
[0102]
amh序列2基因序列(seq id no:2)：
[0103]
atgtggtggagactgtggtggctgctgctgctgctcctgctgctgtggcccatggtgtgggcccaccaccaccaccatcaccaccacagagctgaagaacccgctgtgggaacatctggcctgatcttcagagaggacctggattggcctcctggcagccctcaagaacctctgtgtctggttgctctgggcggagatagcaatggaagcagcagccctcttagagtggttggagctctgagcgcttacgaacaggcttttctgggagccgtgcaaagagctagatggggccctagagacctggctaccttcggcgtttgtaacaccggcgatagacaggctgctctgcctagccttagaagactgggcgcttggctgagagatcctggaggacagagactggtggtgctgcatctggaagaggtgacctgggaacctacccctagcctgagatttcaagagcctcctcctggaggcgctggacctcctgaactggctctgctggtgctgtatcctggacctggccctgaagtgacagtgacaagagctggactgcctggagctcaaagcctgtgtcccagcagagacaccagatacctggtgctggctgtggatagacctgccggagcttggagaggatctggactggctcttacactgcaacccagaggcgaggattctagactgagcaccgccagactgcaagctctgctgttcggcgatgaccacagatgcttcaccagaatgacccctgccctgctgcttcttcctagaagcgagcctgcccctcttcctgctcatggacagcttgacacagtgccctttcctcctcctagacccagcgctgaactggaagaaagcccccctagcgctgatccctttctggagaccctgaccagacttgtgagagccctgagagtgcctcctgctagagctagcgctcctagactggctctggatcccgatgctctggctggattccctcaaggactggtgaacctgtctgatcccgccgctctggaaagactgctggatggcgaagaacctctgctgctgctgcttagacctacagctgctaccacaggagatcccgcccctctgcatgatcctacaagcgccccttgggctacagctctggctagaagagtggctgccgaactgcaggctgccgctgctgaacttagaagcctgcctggactgcctcctgctacagcccctctgcttgctagactgctggctctgtgtcctggcggacctggaggactgggagatcctctgagagctctgctgctgctgaaagctctgcaaggcctgagagtggagtggagaggcagagatcacctgcagagcggaggaggaggcggagccctggatagcgccggcgctacagccgctgacggcccttgtgccctgagggagctgtccgtggatctgagggccgagagatccgtgctgatccctgagacctaccaggccaacaattgccagggcgtgtgcggctggcctcagtccgacaggaaccctagatacggcaaccacgtggtgctgctgctgaagatgcaggtgagaggcgccgccctggccaggcctccttgttgtgtgcctacagcctacgccggcaagctgctgatctccctgagcgaggagagaatctccgcccaccacgtgcccaacatggtggccaccgagtgtggctgtagatga。
[0104]
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接
确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除