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2021-02-02 13:02:08|
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起点商标网 专利名称：酶促制备成纤维细胞生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的酶促制备方法。
bFGF最初是作为146个氨基酸的多肽从脑和脑垂体中分离的(Esch et al.，PNAS USA 82，6507-6511，1985)。已克隆了牛bFGF的基因(Abraham et al.，Science，233，545-548，1986)。据核苷酸序列可推测出一个155氨基酸的bFGF转译产物。进一步的工作表明，在加入酶抑制物后可从正常脑垂体组织中连同146氨基酸bFGF一起分离到154氨基酸bFGF(Ueno et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.138，580-588，1986)而且脑和肝癌细胞中的酸性蛋白酶可裂解bFGF(Klagsbrun et al.，PNAS USA 84，1839-1843，1987)。
使用蛋白质工程技术有可能得到用于治疗目的的重组生长因子。然而，一旦这些生长因子得以表达，即可被加工成不同形式的混合物。在这方面，FGF也不例外(Barr et al，J.Biol.Chem.263，31，16471-16478，1988)。
我们现已设计了一种制备其末端被截短之bFGF的方法。可用该方法由更长形式的bFGF制得146氨基酸形式的bFGF，并由bFGF的混合物中产生出单一形式的bFGF。所得产物是纯的且不掺杂其他形式的bFGF。
因此，本发明提供了一种制备bFGF的方法，该方法包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro键的bFGF间形成加合物;
(ⅱ)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键;以及(ⅲ)由加合物中释放出如此制得的bFGF。
步骤(ⅰ)中可利用各自有9-10Leu-Pro键、从位置11到其各C末端有相同的氨基酸序列、且具有不同的N末端氨基酸序列的2种或多种bFGF的混合物。它们的氨基酸序列可只因有不同的N末端而有所差异。典型情况下，bFGF序列之间仅有的差异是N末端氨基酸残基的数目不同。一种bFGF不能比另一种bFGF多有一个或几个N末端氨基酸残基。另外，各bFGF间可能在第9位氨基酸之前的N末端序列中包含不同的残基。
因此，本发明方法有可能适用于任何下述bFGF的混合物，即混合物中各bFGF的氨基酸序列均以序列编号小于9的N末端氨基酸残基开始，且各bFGF具有不同的N末端。因此，应用于步骤(ⅰ)的混合物可由具有下列通式的bFGF组成NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-COOH其中AA是任何氨基酸残基，X是0或正整数，Y代表(11-155)bFGF的氨基酸序列。全长bFGF具有155个氨基酸残基并可定名为155-bFGF或(1-155)bFGF。人(1-155)bFGF的氨基酸序列示于SEQIDNO1中。因此本发明可应用于(1-155)bFGF至(8-155)bFGF之一或其中两种或多种的混合物，此时上述通式中的X分别是8至1的正整数，且(AA)x代表SEQ IDNOS2-6中之一所述的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。特别是，本发明可适用于154氨基酸残基bFGF〔(2-155)bFGF〕和153氨基酸残基bFGF〔(3-155)bFGF〕的混合物。
通常可用DNA重组技术制得bFGF或bFGF的混合物。在这样的混合物中，因为在其N末端加工各转译产物，故可得到不同形式的bFGF。所有的或各bFGF均可以是人、小鼠或啮齿动物bFGF。
可按常规方法在选自肝素和硫酸肝素的bFGF保护剂与bFGF之混合物间形成加合物。保护剂和bFGF大多都是以水溶液形式提供的。该溶液可以是经过缓冲的。可以加入二硫苏糖醇等抗氧化剂以防止蛋白质氧化。bFGF保护剂的比例可以是从0.5∶1到10∶1(W/W)，如1∶1到5∶1(W/W)。作为加合物来保护bFGF，可防止在加入胃蛋白酶A时使之遭受进一步的水解。
然后是使胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)或组织蛋白酶D(EC3.4.23.5)与加合物接触，从而特异地裂解包含在加合物中之bFGF的9-10Leu-Pro键。可在加合物的溶液中提供酶，因此可将酶加到bFGF和保护剂内。一般酶是在调到PH4～6的溶液中提供的。
如在使用胃蛋白酶A的情况下，可将溶液保温30分钟至10小时，例如1至8小时。如使用组织蛋白酶，一般保温时间更长达90至130小时，较好为大约110小时。保温温度可从5℃至室温，例如10℃左右。保温直到反应完成为止。
另外，可将保护剂固定在载体上制成亲和柱。可使用任何一种适当的载体，如琼脂糖凝胶或交联的葡聚糖凝胶珠(例如Sepharose)。将bFGF的溶液加到柱上。bFGF与保护剂结合并保留在柱上。然后使酶溶液通过柱。最后，可从柱上洗脱被截短的单一形式的bFGF。此可用氯化钠水溶液的线性梯度来完成。
可按本发明的方法得到纯的bFGF，特别是可得到称为(10-155)bFGF的146氨基酸形式的bFGF。例如可用如此得到的bFGF治疗创伤和烧伤。可作为任何适当的配制品将bFGF应用于创伤或烧伤。因此这样的配制品可另外含有生理上可接受的载体或稀释剂。
提供下列实施例(包括制备实施例和比较实施例)进一步阐述本发明。
制备实施例制备154/153形式的bFGF按照欧洲专利申请EP-A-363675中所述的方法构建bFGF的合成DNA序列和携带这一序列的表达质粒。所用发酵和纯化方法如下所述(a)发酵方法用携带编码bFGF之人基因和四环素抗性基因的质粒转化得自Institute Pasteur collection的B型大肠杆菌菌株。使用该转化菌株来生产重组的非糖基化h-bFGF(人bFGF)。制备该菌株的主细胞库(15个冻干管)和工作细胞库(W.C.B.)(70个储存于-190℃液氮中的管)。用一管W.C.B作为发酵阶段的接种物。发酵过程在装有4升培养基的10升发酵罐内进行。向培养基内加入盐酸四环素以维持菌株选择条件。37℃发酵20小时后，最终生物量干重为42±Zg/L，以比较凝胶电泳法测得bFGF产率为2500±500mg/L。
为了使细菌生长良好，发酵期间须供入纯氧。
(b)初步纯化以离心法由总发酵液中分离细胞(微生物)。将所得沉淀物重新悬浮于含氯化钠的磷酸钠缓冲液中。为有效地破碎细胞，须使之至少三次通过高压匀浆器。离心澄清所得溶胞产物，收集上清作进一步的处理。
(c)纯化将澄清的上清液加到Sepharose(商品名)SFast Flow(阳离子交换剂)柱上，并使用磷酸盐缓冲液中渐增氯化钠浓度的梯度由柱上洗脱产物。然后在用磷酸盐缓冲液中渐增的氯化钠浓度梯度洗脱的肝素-Sepharose 6B柱上进一步纯化该产物。最后在Sephadex(商品名)G25树脂柱上进行缓冲液交换，得到溶于大量产物缓冲液(磷酸钠-EDTA)中的产物。
(d)柱消毒经用氢氧化钠溶液洗涤来消毒Sepharose S Fast Flow和Sephadex G25柱。另外可用PH8.5和PH5.5的含3M氯化钠的溶液洗肝素-Sepharose。
以这种方式得到154/153形式的bFGF。亦即得到含下列组分的约50∶50混合物具有155个氨基酸的氨基酸序列的154氨基酸人bFGF〔(2-155)bFGF〕，其为Abraham等人所报导的、有SEQ ID NO∶1中所示序列但没有N末端Met残基的bFGF形式;和由SEQIDNO∶1中所示155个氨基酸之bFGF形式组成的但没有N末端Met和Ala残基的153氨基酸人bFGF〔(3-155)bFGF〕。
实施例1用硫酸肝素作保护剂;胃蛋白酶A1.蛋白质样品的制备在缓冲溶液10mM磷酸二氢钠、0.1mMEDTA二钠盐(PH6.0)中以1.8mg/ml的浓度提供制备实施例中得到的154/153形式的bFGF。
为避免蛋白质在控制的水解期间氧化，向1.8mg bFGF中加入20mg二硫苏糖醇。
2.bFGF的酶促水解程序a)保护剂的标准溶液溶液1∶20mg保护剂加在1mlH2O中。
b)bFGF和保护剂溶液的制备100ml蛋白质样品、9μl溶液1、3μl1M柠檬酸钠(PH3.0)、70μlH2O、18μg(18μl1)由猪小肠粘膜中制得的胃蛋白酶A，终体积200μl。
保护剂为硫酸肝素，且bFGF/保护剂比例为1∶1(W/W)。向bFGF和保护剂的溶液(PH4.0)中加入胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)，并于10℃下保温1小时。
3.酶促水解的动力学在不同时间经SDS-PAGE分析法监测水解过程。于1、20、40和60分钟后用SDS-PAGE法分析消化混合物的样品。使用Phast System(商标名，Pharmacia)装置在SDS-PAGE分析中分离154/153bFGF和146-bFGF。限定下述样品制备条件，以避免样品在高密度Phast凝胶的堆积带中形成蛋白质沉淀15μl蛋白质溶液，10μl的40mM Tris-HCl、4mM EDTA、10%SDS、20%巯基乙醇(PH8.0)，3μl DMSO(二甲基亚砜)和1μl溴酚兰(0.3%)。
将样品于100℃下加热5分钟使之变性。样品分析结果表明，在取自1小时后消化混合物的样品中，154/153-bFGF片段已完全消失。得到一个大片段，它与作为参考使用的146-bFGF重组片段完全相符。
4.bFGF的纯化将反应混合物直接加到用10mM Tris缓冲液(PH8.0)、0.5M NaCl预平衡的肝素-琼脂糖柱上。使用0.5M至3M Nacl的梯度在浓度梯度为1.5M NaCl时洗脱bFGF。使用154/153bFGF作为参考，以Bradford方法测定蛋白质浓度。
5.对146氨基酸形式bFGF的电吸印分析用于该电吸印分析的程序与Ploug等人(Anal.Biochem181，33-39，1989)所述者相似。使用的膜是Immobilon PVDF膜(Millipore)。
电泳后，将凝胶置于转移缓冲液(10mM CAPS(3-〔环己基氨基〕-1-丙磺酸)PH11.0、20%甲醇)中平衡10分钟。先用纯甲醇将Immobilon PVDF膜润湿，然后在转移缓冲液中平衡备用。使用半干吸印装置(Kyhse-Andersen，J.Biochem.Biophys.Methods，10，203-209，1984)。电转移过程以0.2mA/Cm2进行2小时。
用水冲洗PVDF膜，然后用加在50%(V/V)甲醇中的0.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250染色1分钟。用水简单洗涤除去过多的染料，然后在含10%(V/V)醋酸的40%(V/V)甲醇中脱色5-10分钟。将PVDF膜再次在水中小心冲洗后用于序列分析。
6.氨基末端序列分析切下PVDF膜上含着染之蛋白质的区域，并作为单层置于Polybrene限制之滤膜的顶上。使用配有120A型PTH-氨基酸分析仪的470A型Applied Biosystems序列分析仪进行序列测定。
在这些条件下，测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu。这些氨基酸相当于146-bFGF之氨基末端的三个氨基酸。
7.激光扫描光密度分析进行这一分析是为了确定在154/153-bFGF经胃蛋白酶A水解1小时后所产生之146-bFGF的百分率。1小时后，将50μl反应混合物与50μlSDS变性缓冲液混合。在同样条件下，对不同蛋白质浓度的bFGF样品作SDS变性处理。在PAA4/30凝胶(Pharmacia)上电泳分离这些样品。使用LKB BROMA2220记录积分仪分析各峰的光密度值。利用在这些条件制备的标准曲线，测得146-bFGF的浓度相当于原154/153-bFGF浓度的91%。
8.亲和层析纯化后的146-bFGF产率在肝素一琼脂糖柱上纯化146-bFGF后测定酶促水解反应产物的得率。将得自上述步骤2的1.64mg反应混合物加在已用10mMTris(PH8)、0.5MNaCl预平衡的肝素一琼脂糖柱上。在PH8、胃蛋白酶A完全无活性且硫酸肝素与bFGF的复合物失去了稳定性的情况下，使bFGF吸附到以过量存在于培养基中的肝素一琼脂糖上。以1.5MNaCl浓度洗脱bFGF。回收到1.14mg146-bFGF。
在使用硫酸肝素作为保护剂进行有控制的水解及亲和柱层析纯化之后，所得146-bFGF的总得率为73%。
实施例2用肝素作保护剂;蛋白质酶A重复实施例1所述的程序，不同的是用肝素作保护剂，bFGF-肝素比例为5∶1(W/W)，于2分钟和4、6、8小时后分析消化混合物的等分样品，且总保温时间为8小时。bFGF和肝素的溶液由下列组分构成100μl蛋白质样品，18μl溶液2，3μl1M柠檬酸钠(PH3.0)，70μlH2O，18μg胃蛋白酶A，终体积200μl。
其中溶液2由100μl溶液1和900μlH2O组成。在这些条件下，保温8小时后也是只得到1个片段。用SDS-PAGE分析法测得该片段表现分子量为16，200。
经氨基末端序列分析，得到同实施例1中所述的三个N末端氨基酸Pro-Ala-Leu。
实施例3用肝素作保护剂;胃蛋白酶A在肝素-琼脂糖柱上纯化146-bFGF片段后，测定由肝素保护的bFGF经控制的水解作用所获产物的得率。在实施例2中所述的相同条件下水解7小时后，将含有1.54mgbFGF的反应介质加到用10mM磷酸钠缓冲液(PH8.0)和0.5MNaCl预平衡的肝素-琼脂糖柱上。在1.5MNaCl梯度时洗脱出1.02mg146-bFGF。
使用肝素作保护剂，经亲和柱层析后所得146-bFGF形式产物的总收率为69%。
实施例4用固定于琼脂糖上的肝素作保护剂;胃蛋白酶A1.bFGF酶促水解方法用10mM磷酸钠、0.1mMEDTA、0.5MNaCl(PH4.0)于10℃下预平衡肝素-琼脂糖柱(7ml凝胶，含5.6mg肝素)。将154/153-bFGF装填于该亲和柱上。然后再将在同样磷酸盐溶液中稀释的0.18mg胃蛋白酶A加到柱顶。该酶以0.5ml/分钟的流速反复循环过柱6小时。
在时间达6小时时，先用10mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)0.1mMEDTA、0.5MNaCl(三倍体积)洗柱，然后再用0.5至3MNaCl梯度洗柱。bFGF在NaCl梯度为1.5M时洗脱。
2.氨基末端序列分析电泳后，按实施例1所述使用半干吸印装置将凝胶电吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含着染之蛋白质的PVDF膜区域，并作为单层置于Polybrene限制之滤膜的顶上。在这些条件下，测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu，它们相当于146-bFGF之氨基末端部分的三个氨基酸。
3.146-bFGF回收率定量分析由肝素-琼脂糖柱上洗出的146-bFGF片段后，检测水解反应产物的回收率。结果回收到1.28mg146-bFGF。在肝素-琼脂糖柱上经过控制的水解后，所得146-bFGF氨基酸形式产物(MW＝16，200)的总得率为81%。
实施例5用肝素作保护剂;组织蛋白酶D1.bFGF酶促水解方法重复实施例2，但不同的是用得自牛脾脏的组织蛋白酶D代替胃蛋白酶A，并且保温时间为110小时。
2.反应动力学虽然酶促水解期间得到的146-bFGF片段显现很不清楚，但1小时后仍可用SDS-PAGE分析法检测到。72小时后，154-153-bFGF水解作用尚未完成，此时向反应介质中加入36μg组织蛋白酶D。40小时后反应方可完成。这是由于组织蛋白酶D的活性低(10单位/mg)。
3.氨基末端序列分析电泳后，按实施例1所述使用半干吸印装置将凝胶电吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含有着色之蛋白质的PVDF膜区域并作为单层置于Polybrene限制的滤膜上。用配有120A型PTH-氨基酸分析仪的470A型APPlied Biosystems序列仪进行序列分析。在这些条件测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu。
比较实施例1胃蛋白酶A;没有保护剂重复实施例1，但不同的是不加保护剂。在几分钟内用胃蛋白酶A完全消化154/153形式的bFGF。
比较实施例2组织蛋白酶D;没有保护剂重复实施例5，但不同的是反应中不存在保护剂。在几分钟内用组织蛋白酶D完全消化154/153形式的bFGF。
比较实施例3α-胰凝乳蛋白酶重复实施例1，但不同的是用α-胰凝乳蛋白酶代替胃蛋白酶A，并且不加保护剂。在几分钟内用α-胰凝乳蛋白酶完全消化154/153形式的bFGF。因此试验了不同的阴离子化合物保护bFGF免受α-胰凝乳蛋白酶水解的能力。
1.肝素3，000(Sigma，H7516)bFGF/保护剂比例＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝4小时。
使用肝素3，000作为保护剂，如用SDS-PAGE分析法测出的，主要得到一个表现分子量为14，000的片段，以及一些其他较低分子量的片段。
2.肝素(Sigma，H3125)bFGF/保护剂比例(W/W)＝5;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝4小时使用这一品级的肝素作保护剂，不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
3.硫酸软骨素bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
4.硫酸皮肤素bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
5.聚天冬氨酸bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时使用聚天冬氨酸作保护剂不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
实施例6用肝素或硫酸肝素作保护剂;胃蛋白酶A或组织蛋白酶D
1.实施程序在溶液中对可溶性bFGF-肝素和bFGF-硫酸肝素复合物作蛋白水解处理在10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH4.0)中，使1.6mg154/153氨基酸形式的bFGF与1.6mg肝素或硫酸肝素于10℃下复合。保温1小时后，向溶液内加入160μg胃蛋白酶A(Sigma P-6887，3200-4500单位/mg蛋白质)。于不同时间取反应混合物样品并于4℃下直接加到用10mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)/0.5NaCl预平衡过的肝素-Sepharose柱上。然后用同样的缓冲液彻底洗柱并用加在10mM磷酸缓冲液(PH8.0)中的3MNaCl洗脱bFGF。合并的各部分在预先用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡过的Sephadex G25柱上脱盐后进行SDS-PAGE分析。使用硫酸肝素作保护剂，1小时后即可得到一定量回收率的146-bFGF。用胃蛋白酶处理bFGF-肝素复合物时，则于保温6.5小时时达到同样的收率。
用胃蛋白酶A处理结合到肝素-Sepharose柱上的bFGF取50mgbFGF(154/153)以2.5ml/分钟的流速过预先在25mM柠檬酸盐缓冲液(PH4.0)/0.5M NaCl(4℃)平衡过的肝素-Sepharose柱(Pharmacia)(2.6×22.5cm)。4℃下使680单位/ml溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的猪胃蛋白酶A(Sigma)溶液以2.5ml/分钟的流速连续反复通过柱3小时。然后用25mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)/0.5MNaCl彻底洗柱以失活并除去酶。用加在25mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)中的3MNaCl逐步洗脱bFGF。收集含bFGF的各管，在Amicon PM10膜上超滤浓缩，并在预先用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡的Sephadex G25柱(Pharmacia)上除盐。
N末端序列分析在配有120A型PTH-氨基酸分析仪的477A型脉冲液相序列仪(Applied Biosystems，CA，USA)上进行自动N末端序列分析。使用稍加改动的Normal-1程序。所有序列分析材料和试验剂均购自Applied Biosystems。
C末端序列分析在室温下，在10mM醋酸钠缓冲液(PH3.8)/0.05%Brij-35中研究羧肽酶P消化bFGF的时间过程，其中所用酶对底物的比例为大约1∶100(W/W)(Lu et al，J.Chromatogr.447，351-364，1988)。
用0.1-0.2μgCpP(Boehringer)将0.5-1nmol蛋白质消化2小时;加入N-亮氨酸作为内部标准。于不同时间抽取10/100μl等分样品，在420A型衍生仪(APPlied Biosystems)上用PITC自动衍生，并注入配有130A型分析仪的RP-HPLC柱中后进行氨基酸分析。在PTC-C8柱(P/N0711-0204，220×2.1mm，5μ，Applied Biosystems)上分离衍生的PTC氨基酸。
生物学试验使用由牛主动脉得到的内皮细胞株(BAEC)研究bFGF诱导的增殖反应。将细胞悬浮在由添加了13%胎牛血清(FBS)(Gibco，UK)的Dubecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)组成的完全培养基中，并以每孔2500个细胞铺敷在96孔微量滴定板中。附着后，将上述完全培养基换成由添加了0.5%胎牛血清(FBS)、0.1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，USA)和所需浓度之bFGF(Erbamont)的DMEM组成的实验培养基。培养物被保温3天时，用福尔马林固定并用结晶紫染色。染色后，彻底冲洗各孔以除去未掺入的染料。向各孔内加入甲醇(95%;0.1ml/孔)以提取染料，达到与各孔内生长之细胞量成正比。将平板移到配有540nm滤光片的微平板分光光度阅读器上以自动读出测定结果。
为合成血纤维蛋白溶酶原激活剂，将悬浮于完全生长培养基中的BAEC(每孔0.2ml含3×104个细胞)接种于96孔微量滴定板中，细胞附着后将培养基换成添加了0.5%FBS、0.1%BSA和试验浓度bFGF的DMEM。保温28小时后，洗涤培养物并用含有0.5%Triton X-100的溶液溶解破碎细胞。使用进行酰胺水解试验的生色底物(Spectrozyme PL)和血纤维蛋白溶酶原(两种试剂均购自American Diagnostica Inc。)检测细胞溶胞产物之等分样品的血纤维蛋白溶酶原激活剂活性。
结果对bFGF的控制的酶促加工纯化的重组154/153混合物与两种不同的天冬氨酸蛋白酶即胃蛋白酶A和组织蛋白酶D一同保温。于不同时间取反应混合物的等分样品进行SDS-PAGE分析，结果显示，在没有任何保护剂的情况下，bFGF很快被消化成小肽。相反，在肝素或硫酸肝素(1∶1W/W)存在下，用胃蛋白酶A处理bFGF(154/153)(底物bFGF对酶比例10∶1W/W;PH4.0;10℃)，则可使154/153氨基酸形式逐步并完全转化成与我们的146/145氨基酸形式标准样品共迁移的较低分子量形式。
电吸印到PDVF膜上后，在脉冲液相序列分析仪上对酶促消化产生的低分子量带进行自动N末端序列分析。前三次循环得出一个单的同源序列Pro-Ala-Leu，其相当于已知146氨基酸形式的完整N末端。当延长形式的bFGF与肝素或硫酸肝素复合时，尽管bFGF分子上存在三个Leu-Pro位点，但并没有检测出其他序列，这表明用胃蛋白酶A消化只能特异地裂解Leu9-Pro10肽键。
可在用组织蛋白酶D消化后实现对如用胃蛋白酶A处理所得到的“肝素保护的”NH2末端延长之bFGF分子的控制的蛋白水解性裂解，但这一蛋白水解反应需要较长的时间，此可能是由于所用的酶制剂的比活性较低。当在PH7.5的相似条件下加入胰凝乳蛋白酶时，可在对保温混合物进行凝胶电泳后测得分子量约14，000道尔顿的单一肽，而没有存在146氨基酸形式之bFGF的证据。
在肝素-Sepharose柱上批量酶促加工bFGF用结合到肝素-Sepharose柱上的延长之bFGF的154/153混合物进行大批量加工，以进一步证实在溶液中和小批量反应中得到的结果。为此，将50mgbFGF(154/153)加到预先用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH4.0)平衡过的肝素-Sepharose柱上。4℃下使胃蛋白酶A的溶液连续通过柱3小时。然后在碱性PH下用磷酸盐缓冲液洗柱，以失活并除去酶。用加在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中的3MNaCl由柱上洗脱所得到的多肽。收集含bFGF部分并在Sephadex G25柱上脱盐。
合并的各管经SDS-PAGE分析后，显示出一条分子量相当于146/145bFGF标准品的单一带。反相HPLC分析也出现单一峰。N末端序列分析得到一个相当于146氨基酸bFGF之正确的完整N末端，即Pro-Ala Leu-。C末端分析则显示出bFGF分子之预期的羧基末端，即-Ala-Lys-Ser。因此，当bFGF同样结合于肝素-Sepharose树脂柱上时，胃蛋白酶A也能在Leu9-Pro10键上特异地裂解该分子，产生146氨基酸形式的同源序列。
对bFGF的体外生物学分析比较按所述蛋白水解方法得到的146氨基酸形式之bFGF混合物与154/153氨基酸形式之bFGF的生物学活性。用牛主动脉内皮细胞(BAEC)研究其诱导增殖反应及合成血纤维蛋白酶原激活剂这两种活性。两种检测法均进一步证实酶促水解所得到的146氨基酸形式的bFGF与154/153氨基酸形式的bFGF相比，两者在体外具有彼此相当的生物学活性。
序 列 列 示(1)SEQ ID NO∶1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度155个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶1Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155(2)SEQ ID No∶2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶2Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(3)SEQ ID No∶3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶3Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(4)SEQ ID No∶4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶4Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(5)SEQ ID No∶5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶5Gly Ser Ile Thr Thr1 5(6)SEQ ID No∶6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶6Ser Ile Thr Thr权利要求
1.制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的方法，其包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro链的bFGF之间形成加合物；(ⅱ)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键；以及(ⅲ)由加合物中释放出如此得到的bFGF。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(ⅰ)中使用的是其中氨基酸序列不同仅在于有不同N末端的两个或多个所说之bFGF的混合物。
3.根据权利要求2的方法，其中所说的混合物是由具有下列通式的bFGF组成的NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-CooH其中AA是任何氨基酸残基，X是0或正整数，且Y代表(11-155)bFGF的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的方法，其中(AA)x代表SEQ ID Nos，2至6中所示的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。
5.根据权利要求3的方法，其中所说的混合物是由(2-155)bFGF和(3-155)bFGF组成的。
6.根据前述权利要求中之任一项的方法，其中所有的或各bFGF均为人、小鼠或啮齿动物bFGF。
7.根据前述权利要求中之任一项的方法，其中在步骤(ⅰ)中肝素或硫酸肝素以及所有的或各bFGF是在缓冲的水溶液中提供的，且在步骤(ⅱ)中将胃蛋白酶A或组织蛋白酶D加入所得溶液中。
8.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中在步骤(ⅰ)中肝素或硫酸肝素被固定在载体上以形成亲和柱，将所说之bFGF的溶液加到该柱上，在步骤(ⅱ)中使胃蛋白酶A或组织蛋白酶D的溶液通过如此装填的柱，且在步骤(ⅲ)中由柱上洗脱如此得到的截短的单一形式的bFGF。
9.根据前述权利要求中之任一项的方法，其进一步包括将如此得到的单一形式的bFGF与药用载体或稀释剂一起配制。
全文摘要
公开了制备bFGF的方法，其包括(i)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro键的bFGF间形成加合物；(ii)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键；以及(iii)由加合物中释放出如此得到的bFGF。该方法可用于由较长形式的bFGF制备146个氨基酸形式的bFGF。其也可用于由bFGF的混合物中产生单一形式的bFGF，所说bFGF混合物中各bFGF之氨基酸序列的差异仅在于它们具有不同的N末端。
文档编号C07K1/00GK1058597SQ91105269
公开日1992年2月12日 申请日期1991年8月2日 优先权日1990年8月2日
发明者P·蒙森, F·保罗, D·贝特贝德, P·萨密托斯 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司
技术领域：
本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的酶促制备方法。
bFGF最初是作为146个氨基酸的多肽从脑和脑垂体中分离的(Esch et al.，PNAS USA 82，6507-6511，1985)。已克隆了牛bFGF的基因(Abraham et al.，Science，233，545-548，1986)。据核苷酸序列可推测出一个155氨基酸的bFGF转译产物。进一步的工作表明，在加入酶抑制物后可从正常脑垂体组织中连同146氨基酸bFGF一起分离到154氨基酸bFGF(Ueno et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.138，580-588，1986)而且脑和肝癌细胞中的酸性蛋白酶可裂解bFGF(Klagsbrun et al.，PNAS USA 84，1839-1843，1987)。
使用蛋白质工程技术有可能得到用于治疗目的的重组生长因子。然而，一旦这些生长因子得以表达，即可被加工成不同形式的混合物。在这方面，FGF也不例外(Barr et al，J.Biol.Chem.263，31，16471-16478，1988)。
我们现已设计了一种制备其末端被截短之bFGF的方法。可用该方法由更长形式的bFGF制得146氨基酸形式的bFGF，并由bFGF的混合物中产生出单一形式的bFGF。所得产物是纯的且不掺杂其他形式的bFGF。
因此，本发明提供了一种制备bFGF的方法，该方法包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro键的bFGF间形成加合物;
(ⅱ)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键;以及(ⅲ)由加合物中释放出如此制得的bFGF。
步骤(ⅰ)中可利用各自有9-10Leu-Pro键、从位置11到其各C末端有相同的氨基酸序列、且具有不同的N末端氨基酸序列的2种或多种bFGF的混合物。它们的氨基酸序列可只因有不同的N末端而有所差异。典型情况下，bFGF序列之间仅有的差异是N末端氨基酸残基的数目不同。一种bFGF不能比另一种bFGF多有一个或几个N末端氨基酸残基。另外，各bFGF间可能在第9位氨基酸之前的N末端序列中包含不同的残基。
因此，本发明方法有可能适用于任何下述bFGF的混合物，即混合物中各bFGF的氨基酸序列均以序列编号小于9的N末端氨基酸残基开始，且各bFGF具有不同的N末端。因此，应用于步骤(ⅰ)的混合物可由具有下列通式的bFGF组成NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-COOH其中AA是任何氨基酸残基，X是0或正整数，Y代表(11-155)bFGF的氨基酸序列。全长bFGF具有155个氨基酸残基并可定名为155-bFGF或(1-155)bFGF。人(1-155)bFGF的氨基酸序列示于SEQIDNO1中。因此本发明可应用于(1-155)bFGF至(8-155)bFGF之一或其中两种或多种的混合物，此时上述通式中的X分别是8至1的正整数，且(AA)x代表SEQ IDNOS2-6中之一所述的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。特别是，本发明可适用于154氨基酸残基bFGF〔(2-155)bFGF〕和153氨基酸残基bFGF〔(3-155)bFGF〕的混合物。
通常可用DNA重组技术制得bFGF或bFGF的混合物。在这样的混合物中，因为在其N末端加工各转译产物，故可得到不同形式的bFGF。所有的或各bFGF均可以是人、小鼠或啮齿动物bFGF。
可按常规方法在选自肝素和硫酸肝素的bFGF保护剂与bFGF之混合物间形成加合物。保护剂和bFGF大多都是以水溶液形式提供的。该溶液可以是经过缓冲的。可以加入二硫苏糖醇等抗氧化剂以防止蛋白质氧化。bFGF保护剂的比例可以是从0.5∶1到10∶1(W/W)，如1∶1到5∶1(W/W)。作为加合物来保护bFGF，可防止在加入胃蛋白酶A时使之遭受进一步的水解。
然后是使胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)或组织蛋白酶D(EC3.4.23.5)与加合物接触，从而特异地裂解包含在加合物中之bFGF的9-10Leu-Pro键。可在加合物的溶液中提供酶，因此可将酶加到bFGF和保护剂内。一般酶是在调到PH4～6的溶液中提供的。
如在使用胃蛋白酶A的情况下，可将溶液保温30分钟至10小时，例如1至8小时。如使用组织蛋白酶，一般保温时间更长达90至130小时，较好为大约110小时。保温温度可从5℃至室温，例如10℃左右。保温直到反应完成为止。
另外，可将保护剂固定在载体上制成亲和柱。可使用任何一种适当的载体，如琼脂糖凝胶或交联的葡聚糖凝胶珠(例如Sepharose)。将bFGF的溶液加到柱上。bFGF与保护剂结合并保留在柱上。然后使酶溶液通过柱。最后，可从柱上洗脱被截短的单一形式的bFGF。此可用氯化钠水溶液的线性梯度来完成。
可按本发明的方法得到纯的bFGF，特别是可得到称为(10-155)bFGF的146氨基酸形式的bFGF。例如可用如此得到的bFGF治疗创伤和烧伤。可作为任何适当的配制品将bFGF应用于创伤或烧伤。因此这样的配制品可另外含有生理上可接受的载体或稀释剂。
提供下列实施例(包括制备实施例和比较实施例)进一步阐述本发明。
制备实施例制备154/153形式的bFGF按照欧洲专利申请EP-A-363675中所述的方法构建bFGF的合成DNA序列和携带这一序列的表达质粒。所用发酵和纯化方法如下所述(a)发酵方法用携带编码bFGF之人基因和四环素抗性基因的质粒转化得自Institute Pasteur collection的B型大肠杆菌菌株。使用该转化菌株来生产重组的非糖基化h-bFGF(人bFGF)。制备该菌株的主细胞库(15个冻干管)和工作细胞库(W.C.B.)(70个储存于-190℃液氮中的管)。用一管W.C.B作为发酵阶段的接种物。发酵过程在装有4升培养基的10升发酵罐内进行。向培养基内加入盐酸四环素以维持菌株选择条件。37℃发酵20小时后，最终生物量干重为42±Zg/L，以比较凝胶电泳法测得bFGF产率为2500±500mg/L。
为了使细菌生长良好，发酵期间须供入纯氧。
(b)初步纯化以离心法由总发酵液中分离细胞(微生物)。将所得沉淀物重新悬浮于含氯化钠的磷酸钠缓冲液中。为有效地破碎细胞，须使之至少三次通过高压匀浆器。离心澄清所得溶胞产物，收集上清作进一步的处理。
(c)纯化将澄清的上清液加到Sepharose(商品名)SFast Flow(阳离子交换剂)柱上，并使用磷酸盐缓冲液中渐增氯化钠浓度的梯度由柱上洗脱产物。然后在用磷酸盐缓冲液中渐增的氯化钠浓度梯度洗脱的肝素-Sepharose 6B柱上进一步纯化该产物。最后在Sephadex(商品名)G25树脂柱上进行缓冲液交换，得到溶于大量产物缓冲液(磷酸钠-EDTA)中的产物。
(d)柱消毒经用氢氧化钠溶液洗涤来消毒Sepharose S Fast Flow和Sephadex G25柱。另外可用PH8.5和PH5.5的含3M氯化钠的溶液洗肝素-Sepharose。
以这种方式得到154/153形式的bFGF。亦即得到含下列组分的约50∶50混合物具有155个氨基酸的氨基酸序列的154氨基酸人bFGF〔(2-155)bFGF〕，其为Abraham等人所报导的、有SEQ ID NO∶1中所示序列但没有N末端Met残基的bFGF形式;和由SEQIDNO∶1中所示155个氨基酸之bFGF形式组成的但没有N末端Met和Ala残基的153氨基酸人bFGF〔(3-155)bFGF〕。
实施例1用硫酸肝素作保护剂;胃蛋白酶A1.蛋白质样品的制备在缓冲溶液10mM磷酸二氢钠、0.1mMEDTA二钠盐(PH6.0)中以1.8mg/ml的浓度提供制备实施例中得到的154/153形式的bFGF。
为避免蛋白质在控制的水解期间氧化，向1.8mg bFGF中加入20mg二硫苏糖醇。
2.bFGF的酶促水解程序a)保护剂的标准溶液溶液1∶20mg保护剂加在1mlH2O中。
b)bFGF和保护剂溶液的制备100ml蛋白质样品、9μl溶液1、3μl1M柠檬酸钠(PH3.0)、70μlH2O、18μg(18μl1)由猪小肠粘膜中制得的胃蛋白酶A，终体积200μl。
保护剂为硫酸肝素，且bFGF/保护剂比例为1∶1(W/W)。向bFGF和保护剂的溶液(PH4.0)中加入胃蛋白酶A(EC3.4.23.1)，并于10℃下保温1小时。
3.酶促水解的动力学在不同时间经SDS-PAGE分析法监测水解过程。于1、20、40和60分钟后用SDS-PAGE法分析消化混合物的样品。使用Phast System(商标名，Pharmacia)装置在SDS-PAGE分析中分离154/153bFGF和146-bFGF。限定下述样品制备条件，以避免样品在高密度Phast凝胶的堆积带中形成蛋白质沉淀15μl蛋白质溶液，10μl的40mM Tris-HCl、4mM EDTA、10%SDS、20%巯基乙醇(PH8.0)，3μl DMSO(二甲基亚砜)和1μl溴酚兰(0.3%)。
将样品于100℃下加热5分钟使之变性。样品分析结果表明，在取自1小时后消化混合物的样品中，154/153-bFGF片段已完全消失。得到一个大片段，它与作为参考使用的146-bFGF重组片段完全相符。
4.bFGF的纯化将反应混合物直接加到用10mM Tris缓冲液(PH8.0)、0.5M NaCl预平衡的肝素-琼脂糖柱上。使用0.5M至3M Nacl的梯度在浓度梯度为1.5M NaCl时洗脱bFGF。使用154/153bFGF作为参考，以Bradford方法测定蛋白质浓度。
5.对146氨基酸形式bFGF的电吸印分析用于该电吸印分析的程序与Ploug等人(Anal.Biochem181，33-39，1989)所述者相似。使用的膜是Immobilon PVDF膜(Millipore)。
电泳后，将凝胶置于转移缓冲液(10mM CAPS(3-〔环己基氨基〕-1-丙磺酸)PH11.0、20%甲醇)中平衡10分钟。先用纯甲醇将Immobilon PVDF膜润湿，然后在转移缓冲液中平衡备用。使用半干吸印装置(Kyhse-Andersen，J.Biochem.Biophys.Methods，10，203-209，1984)。电转移过程以0.2mA/Cm2进行2小时。
用水冲洗PVDF膜，然后用加在50%(V/V)甲醇中的0.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250染色1分钟。用水简单洗涤除去过多的染料，然后在含10%(V/V)醋酸的40%(V/V)甲醇中脱色5-10分钟。将PVDF膜再次在水中小心冲洗后用于序列分析。
6.氨基末端序列分析切下PVDF膜上含着染之蛋白质的区域，并作为单层置于Polybrene限制之滤膜的顶上。使用配有120A型PTH-氨基酸分析仪的470A型Applied Biosystems序列分析仪进行序列测定。
在这些条件下，测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu。这些氨基酸相当于146-bFGF之氨基末端的三个氨基酸。
7.激光扫描光密度分析进行这一分析是为了确定在154/153-bFGF经胃蛋白酶A水解1小时后所产生之146-bFGF的百分率。1小时后，将50μl反应混合物与50μlSDS变性缓冲液混合。在同样条件下，对不同蛋白质浓度的bFGF样品作SDS变性处理。在PAA4/30凝胶(Pharmacia)上电泳分离这些样品。使用LKB BROMA2220记录积分仪分析各峰的光密度值。利用在这些条件制备的标准曲线，测得146-bFGF的浓度相当于原154/153-bFGF浓度的91%。
8.亲和层析纯化后的146-bFGF产率在肝素一琼脂糖柱上纯化146-bFGF后测定酶促水解反应产物的得率。将得自上述步骤2的1.64mg反应混合物加在已用10mMTris(PH8)、0.5MNaCl预平衡的肝素一琼脂糖柱上。在PH8、胃蛋白酶A完全无活性且硫酸肝素与bFGF的复合物失去了稳定性的情况下，使bFGF吸附到以过量存在于培养基中的肝素一琼脂糖上。以1.5MNaCl浓度洗脱bFGF。回收到1.14mg146-bFGF。
在使用硫酸肝素作为保护剂进行有控制的水解及亲和柱层析纯化之后，所得146-bFGF的总得率为73%。
实施例2用肝素作保护剂;蛋白质酶A重复实施例1所述的程序，不同的是用肝素作保护剂，bFGF-肝素比例为5∶1(W/W)，于2分钟和4、6、8小时后分析消化混合物的等分样品，且总保温时间为8小时。bFGF和肝素的溶液由下列组分构成100μl蛋白质样品，18μl溶液2，3μl1M柠檬酸钠(PH3.0)，70μlH2O，18μg胃蛋白酶A，终体积200μl。
其中溶液2由100μl溶液1和900μlH2O组成。在这些条件下，保温8小时后也是只得到1个片段。用SDS-PAGE分析法测得该片段表现分子量为16，200。
经氨基末端序列分析，得到同实施例1中所述的三个N末端氨基酸Pro-Ala-Leu。
实施例3用肝素作保护剂;胃蛋白酶A在肝素-琼脂糖柱上纯化146-bFGF片段后，测定由肝素保护的bFGF经控制的水解作用所获产物的得率。在实施例2中所述的相同条件下水解7小时后，将含有1.54mgbFGF的反应介质加到用10mM磷酸钠缓冲液(PH8.0)和0.5MNaCl预平衡的肝素-琼脂糖柱上。在1.5MNaCl梯度时洗脱出1.02mg146-bFGF。
使用肝素作保护剂，经亲和柱层析后所得146-bFGF形式产物的总收率为69%。
实施例4用固定于琼脂糖上的肝素作保护剂;胃蛋白酶A1.bFGF酶促水解方法用10mM磷酸钠、0.1mMEDTA、0.5MNaCl(PH4.0)于10℃下预平衡肝素-琼脂糖柱(7ml凝胶，含5.6mg肝素)。将154/153-bFGF装填于该亲和柱上。然后再将在同样磷酸盐溶液中稀释的0.18mg胃蛋白酶A加到柱顶。该酶以0.5ml/分钟的流速反复循环过柱6小时。
在时间达6小时时，先用10mM磷酸钠缓冲液(PH7.0)0.1mMEDTA、0.5MNaCl(三倍体积)洗柱，然后再用0.5至3MNaCl梯度洗柱。bFGF在NaCl梯度为1.5M时洗脱。
2.氨基末端序列分析电泳后，按实施例1所述使用半干吸印装置将凝胶电吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含着染之蛋白质的PVDF膜区域，并作为单层置于Polybrene限制之滤膜的顶上。在这些条件下，测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu，它们相当于146-bFGF之氨基末端部分的三个氨基酸。
3.146-bFGF回收率定量分析由肝素-琼脂糖柱上洗出的146-bFGF片段后，检测水解反应产物的回收率。结果回收到1.28mg146-bFGF。在肝素-琼脂糖柱上经过控制的水解后，所得146-bFGF氨基酸形式产物(MW＝16，200)的总得率为81%。
实施例5用肝素作保护剂;组织蛋白酶D1.bFGF酶促水解方法重复实施例2，但不同的是用得自牛脾脏的组织蛋白酶D代替胃蛋白酶A，并且保温时间为110小时。
2.反应动力学虽然酶促水解期间得到的146-bFGF片段显现很不清楚，但1小时后仍可用SDS-PAGE分析法检测到。72小时后，154-153-bFGF水解作用尚未完成，此时向反应介质中加入36μg组织蛋白酶D。40小时后反应方可完成。这是由于组织蛋白酶D的活性低(10单位/mg)。
3.氨基末端序列分析电泳后，按实施例1所述使用半干吸印装置将凝胶电吸印到Immobilon PVDF膜上。切下含有着色之蛋白质的PVDF膜区域并作为单层置于Polybrene限制的滤膜上。用配有120A型PTH-氨基酸分析仪的470A型APPlied Biosystems序列仪进行序列分析。在这些条件测知蛋白质NH2末端部分的前三个氨基酸是Pro-Ala-Leu。
比较实施例1胃蛋白酶A;没有保护剂重复实施例1，但不同的是不加保护剂。在几分钟内用胃蛋白酶A完全消化154/153形式的bFGF。
比较实施例2组织蛋白酶D;没有保护剂重复实施例5，但不同的是反应中不存在保护剂。在几分钟内用组织蛋白酶D完全消化154/153形式的bFGF。
比较实施例3α-胰凝乳蛋白酶重复实施例1，但不同的是用α-胰凝乳蛋白酶代替胃蛋白酶A，并且不加保护剂。在几分钟内用α-胰凝乳蛋白酶完全消化154/153形式的bFGF。因此试验了不同的阴离子化合物保护bFGF免受α-胰凝乳蛋白酶水解的能力。
1.肝素3，000(Sigma，H7516)bFGF/保护剂比例＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝4小时。
使用肝素3，000作为保护剂，如用SDS-PAGE分析法测出的，主要得到一个表现分子量为14，000的片段，以及一些其他较低分子量的片段。
2.肝素(Sigma，H3125)bFGF/保护剂比例(W/W)＝5;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝4小时使用这一品级的肝素作保护剂，不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
3.硫酸软骨素bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
4.硫酸皮肤素bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
5.聚天冬氨酸bFGF/保护剂比例(W/W)＝1;温度＝10℃;
PH＝7.5;保温时间＝2小时使用聚天冬氨酸作保护剂不能发挥适当的保护作用，而得到许多片段。
实施例6用肝素或硫酸肝素作保护剂;胃蛋白酶A或组织蛋白酶D
1.实施程序在溶液中对可溶性bFGF-肝素和bFGF-硫酸肝素复合物作蛋白水解处理在10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH4.0)中，使1.6mg154/153氨基酸形式的bFGF与1.6mg肝素或硫酸肝素于10℃下复合。保温1小时后，向溶液内加入160μg胃蛋白酶A(Sigma P-6887，3200-4500单位/mg蛋白质)。于不同时间取反应混合物样品并于4℃下直接加到用10mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)/0.5NaCl预平衡过的肝素-Sepharose柱上。然后用同样的缓冲液彻底洗柱并用加在10mM磷酸缓冲液(PH8.0)中的3MNaCl洗脱bFGF。合并的各部分在预先用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡过的Sephadex G25柱上脱盐后进行SDS-PAGE分析。使用硫酸肝素作保护剂，1小时后即可得到一定量回收率的146-bFGF。用胃蛋白酶处理bFGF-肝素复合物时，则于保温6.5小时时达到同样的收率。
用胃蛋白酶A处理结合到肝素-Sepharose柱上的bFGF取50mgbFGF(154/153)以2.5ml/分钟的流速过预先在25mM柠檬酸盐缓冲液(PH4.0)/0.5M NaCl(4℃)平衡过的肝素-Sepharose柱(Pharmacia)(2.6×22.5cm)。4℃下使680单位/ml溶于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中的猪胃蛋白酶A(Sigma)溶液以2.5ml/分钟的流速连续反复通过柱3小时。然后用25mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)/0.5MNaCl彻底洗柱以失活并除去酶。用加在25mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)中的3MNaCl逐步洗脱bFGF。收集含bFGF的各管，在Amicon PM10膜上超滤浓缩，并在预先用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡的Sephadex G25柱(Pharmacia)上除盐。
N末端序列分析在配有120A型PTH-氨基酸分析仪的477A型脉冲液相序列仪(Applied Biosystems，CA，USA)上进行自动N末端序列分析。使用稍加改动的Normal-1程序。所有序列分析材料和试验剂均购自Applied Biosystems。
C末端序列分析在室温下，在10mM醋酸钠缓冲液(PH3.8)/0.05%Brij-35中研究羧肽酶P消化bFGF的时间过程，其中所用酶对底物的比例为大约1∶100(W/W)(Lu et al，J.Chromatogr.447，351-364，1988)。
用0.1-0.2μgCpP(Boehringer)将0.5-1nmol蛋白质消化2小时;加入N-亮氨酸作为内部标准。于不同时间抽取10/100μl等分样品，在420A型衍生仪(APPlied Biosystems)上用PITC自动衍生，并注入配有130A型分析仪的RP-HPLC柱中后进行氨基酸分析。在PTC-C8柱(P/N0711-0204，220×2.1mm，5μ，Applied Biosystems)上分离衍生的PTC氨基酸。
生物学试验使用由牛主动脉得到的内皮细胞株(BAEC)研究bFGF诱导的增殖反应。将细胞悬浮在由添加了13%胎牛血清(FBS)(Gibco，UK)的Dubecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)组成的完全培养基中，并以每孔2500个细胞铺敷在96孔微量滴定板中。附着后，将上述完全培养基换成由添加了0.5%胎牛血清(FBS)、0.1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，USA)和所需浓度之bFGF(Erbamont)的DMEM组成的实验培养基。培养物被保温3天时，用福尔马林固定并用结晶紫染色。染色后，彻底冲洗各孔以除去未掺入的染料。向各孔内加入甲醇(95%;0.1ml/孔)以提取染料，达到与各孔内生长之细胞量成正比。将平板移到配有540nm滤光片的微平板分光光度阅读器上以自动读出测定结果。
为合成血纤维蛋白溶酶原激活剂，将悬浮于完全生长培养基中的BAEC(每孔0.2ml含3×104个细胞)接种于96孔微量滴定板中，细胞附着后将培养基换成添加了0.5%FBS、0.1%BSA和试验浓度bFGF的DMEM。保温28小时后，洗涤培养物并用含有0.5%Triton X-100的溶液溶解破碎细胞。使用进行酰胺水解试验的生色底物(Spectrozyme PL)和血纤维蛋白溶酶原(两种试剂均购自American Diagnostica Inc。)检测细胞溶胞产物之等分样品的血纤维蛋白溶酶原激活剂活性。
结果对bFGF的控制的酶促加工纯化的重组154/153混合物与两种不同的天冬氨酸蛋白酶即胃蛋白酶A和组织蛋白酶D一同保温。于不同时间取反应混合物的等分样品进行SDS-PAGE分析，结果显示，在没有任何保护剂的情况下，bFGF很快被消化成小肽。相反，在肝素或硫酸肝素(1∶1W/W)存在下，用胃蛋白酶A处理bFGF(154/153)(底物bFGF对酶比例10∶1W/W;PH4.0;10℃)，则可使154/153氨基酸形式逐步并完全转化成与我们的146/145氨基酸形式标准样品共迁移的较低分子量形式。
电吸印到PDVF膜上后，在脉冲液相序列分析仪上对酶促消化产生的低分子量带进行自动N末端序列分析。前三次循环得出一个单的同源序列Pro-Ala-Leu，其相当于已知146氨基酸形式的完整N末端。当延长形式的bFGF与肝素或硫酸肝素复合时，尽管bFGF分子上存在三个Leu-Pro位点，但并没有检测出其他序列，这表明用胃蛋白酶A消化只能特异地裂解Leu9-Pro10肽键。
可在用组织蛋白酶D消化后实现对如用胃蛋白酶A处理所得到的“肝素保护的”NH2末端延长之bFGF分子的控制的蛋白水解性裂解，但这一蛋白水解反应需要较长的时间，此可能是由于所用的酶制剂的比活性较低。当在PH7.5的相似条件下加入胰凝乳蛋白酶时，可在对保温混合物进行凝胶电泳后测得分子量约14，000道尔顿的单一肽，而没有存在146氨基酸形式之bFGF的证据。
在肝素-Sepharose柱上批量酶促加工bFGF用结合到肝素-Sepharose柱上的延长之bFGF的154/153混合物进行大批量加工，以进一步证实在溶液中和小批量反应中得到的结果。为此，将50mgbFGF(154/153)加到预先用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH4.0)平衡过的肝素-Sepharose柱上。4℃下使胃蛋白酶A的溶液连续通过柱3小时。然后在碱性PH下用磷酸盐缓冲液洗柱，以失活并除去酶。用加在磷酸盐缓冲液(pH8.0)中的3MNaCl由柱上洗脱所得到的多肽。收集含bFGF部分并在Sephadex G25柱上脱盐。
合并的各管经SDS-PAGE分析后，显示出一条分子量相当于146/145bFGF标准品的单一带。反相HPLC分析也出现单一峰。N末端序列分析得到一个相当于146氨基酸bFGF之正确的完整N末端，即Pro-Ala Leu-。C末端分析则显示出bFGF分子之预期的羧基末端，即-Ala-Lys-Ser。因此，当bFGF同样结合于肝素-Sepharose树脂柱上时，胃蛋白酶A也能在Leu9-Pro10键上特异地裂解该分子，产生146氨基酸形式的同源序列。
对bFGF的体外生物学分析比较按所述蛋白水解方法得到的146氨基酸形式之bFGF混合物与154/153氨基酸形式之bFGF的生物学活性。用牛主动脉内皮细胞(BAEC)研究其诱导增殖反应及合成血纤维蛋白酶原激活剂这两种活性。两种检测法均进一步证实酶促水解所得到的146氨基酸形式的bFGF与154/153氨基酸形式的bFGF相比，两者在体外具有彼此相当的生物学活性。
序 列 列 示(1)SEQ ID NO∶1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度155个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶1Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155(2)SEQ ID No∶2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶2Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(3)SEQ ID No∶3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶3Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(4)SEQ ID No∶4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶4Ala Gly Ser Ile Thr Thr1 5(5)SEQ ID No∶5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶5Gly Ser Ile Thr Thr1 5(6)SEQ ID No∶6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度4个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链形式单股(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No∶6Ser Ile Thr Thr权利要求
1.制备碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的方法，其包括(ⅰ)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro链的bFGF之间形成加合物；(ⅱ)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键；以及(ⅲ)由加合物中释放出如此得到的bFGF。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(ⅰ)中使用的是其中氨基酸序列不同仅在于有不同N末端的两个或多个所说之bFGF的混合物。
3.根据权利要求2的方法，其中所说的混合物是由具有下列通式的bFGF组成的NH2-(AA)x-Leu-Pro-Y-CooH其中AA是任何氨基酸残基，X是0或正整数，且Y代表(11-155)bFGF的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的方法，其中(AA)x代表SEQ ID Nos，2至6中所示的序列、IleThrThr、ThrThr或Thr。
5.根据权利要求3的方法，其中所说的混合物是由(2-155)bFGF和(3-155)bFGF组成的。
6.根据前述权利要求中之任一项的方法，其中所有的或各bFGF均为人、小鼠或啮齿动物bFGF。
7.根据前述权利要求中之任一项的方法，其中在步骤(ⅰ)中肝素或硫酸肝素以及所有的或各bFGF是在缓冲的水溶液中提供的，且在步骤(ⅱ)中将胃蛋白酶A或组织蛋白酶D加入所得溶液中。
8.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中在步骤(ⅰ)中肝素或硫酸肝素被固定在载体上以形成亲和柱，将所说之bFGF的溶液加到该柱上，在步骤(ⅱ)中使胃蛋白酶A或组织蛋白酶D的溶液通过如此装填的柱，且在步骤(ⅲ)中由柱上洗脱如此得到的截短的单一形式的bFGF。
9.根据前述权利要求中之任一项的方法，其进一步包括将如此得到的单一形式的bFGF与药用载体或稀释剂一起配制。
全文摘要
公开了制备bFGF的方法，其包括(i)使肝素或硫酸肝素与具有9-10Leu-Pro键的bFGF间形成加合物；(ii)用胃蛋白酶A或组织蛋白酶D处理该加合物，以裂解所说的键；以及(iii)由加合物中释放出如此得到的bFGF。该方法可用于由较长形式的bFGF制备146个氨基酸形式的bFGF。其也可用于由bFGF的混合物中产生单一形式的bFGF，所说bFGF混合物中各bFGF之氨基酸序列的差异仅在于它们具有不同的N末端。
文档编号C07K1/00GK1058597SQ91105269
公开日1992年2月12日 申请日期1991年8月2日 优先权日1990年8月2日
发明者P·蒙森, F·保罗, D·贝特贝德, P·萨密托斯 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司
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