拟南芥叶绿素b合成基因CAO在番茄中的应用的制作方法

拟南芥叶绿素b合成基因cao在番茄中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及一种拟南芥叶绿素b合成基因cao在番茄中的应用，属于生物基因工程技术领域。


背景技术：

[0002]
高等植物中的叶绿素有2种：叶绿素a和叶绿素b，叶绿素a和叶绿素b具有不同的吸收光谱。在叶绿素合成的最后一个步骤中，叶绿素a和叶绿素b相互转换，称为叶绿素循环。在这个循环中，叶绿素a被叶绿素a加氧酶(cao)转化合成叶绿素b。叶绿素a和b相互转化可以严格调控叶绿素a/b的比例：在cao的催化下，叶绿素a合成足够的叶绿素b；当过量的叶绿素b产生时，叶绿素a/b的比例发生变化促使叶绿素b重新转化成叶绿素a。当植物由强光转移到弱光条件下，一定程度上会合成更多的叶绿素b，降低叶绿素a/b比例，增大光合系统的外围捕光系统，有利于吸收更多的光能进行光合作用。当植物由弱光转移到强光条件下，为了避免光损伤，在一定程度上会降解叶绿素b,提高叶绿素a/b比例，减小光合系统的外围捕光系统。但是，植物本身的调控能力有限，因此，当植物所处的光环境变化较大时，并不能完全适应这种光环境的变化，不能让光合作用效率处于最优状态。
[0003]
叶绿素a和叶绿素b结合在光合系统的蛋白中，与这些蛋白形成具有功能的复合体。叶绿素a存在光系统i和光系统ii的外围捕光复合体和核心复合体中，而叶绿素b只存在于光系统的外围捕光复合体中。光能的吸收及光合电子的传递需要达到平衡，而叶绿素的含量及叶绿素a/b比例的变化对于这个平衡的调节非常重要。在拟南芥高光合效率基因(hpe1)缺失突变体hpe1中，叶绿素总量在一定范围内下降，同时叶绿素a/b比例上升，然而植物光合作用效率得到提高，这表明优化叶绿素含量和比例，是改变光合作用效率及提高植物产量的有效策略；在叶绿素a加氧酶基因atcao缺失突变体ch1-1中过量表达atcao的bc区域后，叶绿素总量提高，叶绿素a/b比例下降至1.5左右，在短日照条件下，植物衰老被推迟；过量表达完整的atcao后，除了叶绿素含量及叶绿素a/b比例发生变化外，光系统ii的外围捕光复合体(lhcii)增大。用诱导性表达启动子在ch1-1中诱导表达atcao后，伴随着叶绿素b逐渐合成，叶绿素a/b比例逐渐下降，lhcii逐渐增加，光合作用效率逐渐提高。过量表达拟南芥atcao的烟草，无论是在强光还是弱光条件下，叶绿素b及叶绿素的合成总量都增加，同时淀粉等有机物质的积累量也明显增加。这些研究结果表明：利用基因工程技术改变叶绿素含量变化及叶绿素a/b比例具有提高植物光合作用潜力。
[0004]
番茄是我国南北方广泛栽培的果菜之一，且设施栽培番茄占有番茄总生产的较大比重。番茄喜光喜温，光饱和点为7
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10
4
lx，最适光照强度为3
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4-5
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lx。栽培过程中光照不足是设施番茄产量低下的主要原因之一。设施园艺栽培过程中，由于棚室遮挡覆盖及自身结构遮光，光照只有外部光照的1/2到1/3甚至更低；且由于季节及气候原因，光照时间短，使设施栽培番茄出现弱光胁迫，导致植株生长不壮甚至出现徒长，叶片黄化脱落，花期及结实期延迟，产量下降等问题。此外，番茄早熟栽培的育苗期正处在低温、弱光、短日照季节。光照不足是培育壮苗的限制因素。因此，培育能适应弱光，弱光下能高效吸收光能进
行光合作用的设施园艺专用番茄品种势在必行。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于能够提供一种在弱光条件下光合作用效率不受影响的番茄新种质，来提高番茄的实际产量，具体为一种拟南芥叶绿素b合成基因cao在番茄中的应用。本发明通过克隆拟南芥中叶绿素加氧酶atcao的bc区域，并利用农杆菌介导法转入番茄中，来提高番茄叶片及果实中的叶绿素b的含量并降低叶绿素a/b比例，及增加番茄叶片及果实中外围捕光天线的尺寸，最终提高番茄的光合作用效率。
[0006]
本发明的目的是这样实现的，一种拟南芥叶绿素b合成基因cao在番茄中的应用，其特征是，包括以下步骤：
[0007]
(1)克隆目标基因序列并构建质粒；分别克隆拟南芥中atcao基因的bc区域的序列、标签多肽flag的基因序列，将bc区域的序列与flag连接形成1个融合的基因片段bc-flag；构建p35s:bc-flag质粒，在番茄中转基因过量表达bc-flag；
[0008]
(2)检测番茄中atcao的表达；利用农杆菌介导法转化番茄，并在相应的选择培养基上筛选并获得转化成功的植株；利用pcr检测转基因株系中atcao的转录情况，并利用western-blotting，特异抗体anti-flag检测bc-flag的蛋白量；明确bc-flag在番茄中表达成功及表达量；
[0009]
(3)根据获得的转化成功的植株的目标基因的表达情况，筛选出叶绿素含量及叶绿素a/b不尽相同的代表性植株，进行后代群体的繁育，并最终筛选出稳定遗传的纯合株系。
[0010]
步骤(1)中：
[0011]
克隆atcao基因的bc区域的序列；实验室人工气候箱中种植拟南芥，然后剪取拟南芥叶片，使用rneasy plant mini kit(qiagen)提取高质量的总mrna，然后使用prime script rt reagent kit(takana)反转录得到cdna；根据tair数据库(www.arabidopsis.org)中atcao的基因序列设计特异引物，对atcao的bc区进行高保真扩增；从载体pearleygate302上高保真扩增flag序列，然后利用重叠pcr将bc与flag结合；
[0012]
构建p35s:bc-flag质粒并在番茄中过量表达；利用重叠pcr将35s与bc-flag基因片段连接，然后利用in-fusion将融合序列整合到pentr载体上，测序确定序列无误后，利用gateway方法将目标片段整合到二元表达载体pearleygate301；然后利用农杆菌gv3101pmp90介导转入番茄中。
[0013]
在实验室人工气候箱中种植拟南芥野生型columbia(col-0)；利用农杆菌gv3101 pmp90介导转入“浦红909”番茄中。
[0014]
步骤(2)中，番茄转基因株系中cao的表达量的测定；
[0015]
筛选bc-flag转基因成功的株系并在光照可控的培养箱中种植；采集t1单株的发育完全的叶片，一方面提取总mrna，反转录并利用rt-pcr检测目标基因的转录水平；另一方面，提取叶片中的总蛋白，利用sds-page/western blotting分离bc-flag蛋白，并用抗flag抗体检测cao的积累量，从而确定各株系中bc-flag的蛋白量；选取目标蛋白的量不同的代表株系，采用快速育种方法繁代，快速获得稳定纯合的转基因株系。
[0016]
bc-flag过量表达株系在弱光条件下的叶绿素含量的检测；采集bc-flag转基因成
功的株系中发育完全的叶片并称重，在液氮温度下，利用提前存储在零下20摄氏度下的100％的丙酮，通过研磨法提取叶绿素；利用紫外可见分光光度计法检测叶绿素a和叶绿素b的含量；根据叶绿素a和叶绿素b的量计算叶绿素a/b比例。
[0017]
本发明方法科学合理，通过本发明提供的一种拟南芥叶绿素b合成基因cao在番茄中的应用，(1)克隆目标基因序列并构建质粒。分别克隆拟南芥中atcao基因的bc区域的序列、标签多肽flag的基因序列。将bc区域的序列与flag连接形成1个融合的基因片段bc-flag。构建p35s:bc-flag质粒，在番茄中转基因过量表达bc-flag。(2)检测番茄中atcao的表达。利用农杆菌介导法转化番茄，并在相应的选择培养基上筛选并获得转化成功的植株。利用pcr检测转基因株系中atcao的转录情况，并利用western-blotting，特异抗体anti-flag检测bc-flag的蛋白量。明确bc-flag在番茄中表达成功及表达量。(3)根据获得的转化成功的植株的目标基因的表达情况，筛选出叶绿素含量及叶绿素a/b不尽相同的代表性植株，进行后代群体的繁育，并最终筛选出稳定遗传的纯合株系。
[0018]
有益效果：在番茄中过量表达atcao，以改变番茄的叶绿素含量及叶绿素a/b比例，研究创制出的新种质的光合系统的的变化，叶绿素荧光参数和光合作用效率的变化；并分析新种质的农艺性状的改变，从而获得整体光合作用效率得到显著提高且产量或品质得到显著提高的蔬菜株系，从而为设施园艺蔬菜提供能够适应弱光环境的优良种质资源。培育出新的能够适应设施栽培弱光环境的番茄新品种。该研究的实施，将有望将来大幅度提高设施番茄的产量及种植效益，满足消费者在不同季节对番茄的需求，增加菜农的经济收益。
[0019]
番茄是重要的蔬菜之一，通过提高叶绿素b的含量来提高番茄的光合作用效率，获得的新的番茄种质有望将来大幅度提高设施番茄的产量及种植效益，满足消费者在不同季节对番茄的需求，增加菜农的经济收益。
附图说明
[0020]
图1表示bc-f转基因株系pcr鉴定。
[0021]
图2表示bc-f转基因株系western blotting鉴定。
[0022]
图3表示bc-f转基因株系的叶绿素含量检测。
具体实施方式
[0023]
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0024]
(1)克隆atcao基因的bc区域的序列。实验室人工气候箱中种植拟南芥野生型columbia(col-0)，然后剪取拟南芥叶片，使用rneasy plant mini kit(qiagen)提取高质量的总mrna，然后使用prime script rt reagent kit(takana)反转录得到cdna。根据tair数据库(www.arabidopsis.org)中atcao的基因序列设计特异引物，对atcao的bc区进行高保真扩增。从载体pearleygate302上高保真扩增flag序列，然后利用重叠pcr将bc与flag结合。
[0025]
(2)构建p35s:bc-flag质粒并在番茄中过量表达。利用重叠pcr将35s与bc-flag基因片段连接，然后利用in-fusion将融合序列整合到pentr载体上，测序确定序列无误后，利用gateway方法将目标片段整合到二元表达载体pearleygate301。然后利用农杆菌gv3101 pmp90介导转入“浦红909”番茄中。
[0026]
(3)“浦红909”转基因株系中cao的表达量的测定。筛选bc-flag转基因成功的株系并在光照可控的培养箱中种植。采集t1单株的发育完全的叶片，一方面提取总mrna，反转录并利用rt-pcr检测目标基因的转录水平；另一方面，提取叶片中的总蛋白，利用sds-page/western blotting分离bc-flag蛋白，并用抗flag抗体检测cao的积累量，从而确定各株系中bc-flag的蛋白量。选取目标蛋白的量不同的代表株系，采用快速育种方法繁代，快速获得稳定纯合的转基因株系。
[0027]
(4)bc-flag过量表达株系在弱光条件下的叶绿素含量的检测。采集bc-flag转基因成功的株系中发育完全的叶片并称重，在液氮温度下，利用提前存储在零下20摄氏度下的100％的丙酮，通过研磨法提取叶绿素。利用紫外可见分光光度计法检测叶绿素a和叶绿素b的含量。根据叶绿素a和叶绿素b的量计算叶绿素a/b比例。

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