一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法与流程

[0001]
本发明涉及一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法，属于生物医用技术领域。


背景技术：

[0002]
冠状病毒严重威胁人类健康，因此对其的准确检测对研究其感染机理以及疫情的防控具有重要意义。目前，病毒的提取主要采取咽拭子手段，其捕获的病毒含量较低，导致病毒的检测手段主要依靠基于荧光标记探针对扩增的靶核酸进行检测，即通过逆转录酶将病毒的rna序列反转为dna序列并继续进行pcr扩增[1. 盛楠,马雪萍,逄淑云,宋沁馨,邹秉杰,周国华.新型冠状病毒sars-cov-2核酸检测技术平台的研究进展[j/ol].分析化学:1-12]。然而，单链rna结构的冠状病毒极易发生变异，使核酸编码氨基酸序列发生变化从而使病毒的抗原性发生变化，导致原有的疫苗失效，免疫失败。值得注意的是，在变异过程中病毒的尺寸变化可忽略不计，一般为60-140 nm[2. 陶青霄,石春薇.新型冠状病毒肺炎发病机制分析[j].华中科技大学学报(医学版),2020,49(02):156-160.]。利用此尺寸不变的特性，开发具有尺寸靶向的三维纳米“笼”结构则将是高效捕获病毒的有效途径。通过控制三维纳米“笼”结构的大小，即可实现纳米线结构对病毒的选择性通过。此外，捕获的病毒在体内与周围细胞隔离，无法感染细胞且更有利于聚集而实现高密度收集。因此，如何制备出与病毒尺寸相近且对生物体无毒无害的三维纳米结构对提高核酸检测灵敏度和准确率至关重要。


技术实现要素：

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发明目的：针对现有技术中存在的问题与不足，本发明根据病毒变异中“特征尺寸不变”的特征，开拓一种全新的“纳米尺寸靶向”新思路，提供一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法。
[0004]
技术方案：一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法，其特征在于，包括以下几个步骤：s1：将制得的硅纳米螺旋结构样品放入浓度为0.4%的氢氟酸溶液中，使氧化硅柱快速溶解，得到含有若干笼状螺旋状硅纳米线的混合液；s2：多次过滤、清洗将笼状螺旋状硅纳米线分散在无菌溶液中；s3：加入血管紧张素转化酶ii对笼状螺旋状硅纳米线进行功能化修饰；s4：再次清洗后，通过雾化吸入的方式，将含有笼状螺旋状硅纳米线的液体送至肺部，与冠状病毒结合实现俘获；s5：被笼状螺旋状硅纳米线捕获的病毒将以痰液的方式排出，形成高浓度的病毒溶液，实现高效提取。
[0005]
本发明进一步限定的技术方案为：所述s2步中的过滤方法采用离心分离或不同孔径过滤膜过滤。
[0006]
进一步的，所述s2步中的无菌溶液为超纯水、生理盐水、磷酸盐缓冲液及葡萄糖溶液中任意一种。
[0007]
进一步的，所述笼状的外形为圆柱体、圆锥体、三角锥、或者多面体形。
[0008]
进一步的，当所述螺旋状硅纳米线为圆锥体形笼状结构时，所述s1中硅纳米螺旋结构样品的制备包括以下几个步骤：第一步：将聚苯乙烯小球铺在硅片上，或者通过光刻技术在硅衬底的表面进行图案化处理以留出圆形光刻胶阵列，之后通过氧等离子体对聚苯乙烯小球或光刻胶进行缩刻，使聚苯乙烯小球或光刻胶尺寸缩小到50~100 nm之间；第二步：采用icp-bosch工艺，在硅表面刻出侧壁带有平行沟道的锥体状结构，然后对硅柱进行氧化处理；第三步：在衬底表面旋涂光刻胶，用氧等离子体处理去除顶端光刻胶，使硅柱顶端露出，通过热蒸发或电子束蒸发沉积金属诱导纳米颗粒；第四步：将样品洗净后转移到pecvd腔室中，覆盖一层非晶前驱体层，采用金属纳米颗粒诱导纳米线生长技术使纳米线沿着具有平行沟道的氧化硅柱生长形成螺旋结构。
[0009]
进一步的，当所述螺旋状硅纳米线的笼状结构为三角锥或者多面体时，所述s1中硅纳米螺旋结构样品的制备包括以下几个步骤：第一步，采用高精度光刻工艺，在硅片上直接获得50-100 nm内径的三角形或者多边形；第二步：采用icp-bosch工艺，在硅表面刻出侧壁带有平行沟道的三角锥或者多面体结构，然后对硅柱进行氧化处理；第三步：在衬底表面旋涂光刻胶，用氧等离子体处理去除顶端光刻胶，使硅柱顶端露出，通过热蒸发或电子束蒸发沉积金属诱导纳米颗粒；第四步：将样品洗净后转移到pecvd腔室中，覆盖一层非晶前驱体层，采用金属纳米颗粒诱导纳米线生长技术使纳米线沿着具有平行沟道的氧化硅柱生长形成螺旋结构。
[0010]
进一步的，所述螺旋状硅纳米线的内径尺寸为100~250 nm，层间距80~300 nm，层数为3~10层。
[0011]
进一步的，所述第一步中的光刻技术为紫外光刻技术、电子束光刻技术、激光刻蚀技术或聚焦离子束刻蚀。
[0012]
进一步的，所述氧化处理方法为湿法氧化或干法氧化。
[0013]
本发明方法的原理为：利用光刻技术和icp刻蚀工艺对衬底进行刻蚀得到高度方向上带交替凹槽的硅结构，充分氧化后得到氧化硅柱。在合适的沟道引导下，通过金属纳米颗粒诱导平面纳米线（ipsls）生长技术可以获得沿着氧化硅柱侧壁生长的纳米线螺旋结构，最后将样品放入浓度为0.4% 的氢氟酸溶液中，氧化硅会被快速溶解，得到含有无数笼状硅纳米线螺旋的氢氟酸混合液；采用多次过滤、清洗的方法将笼状硅纳米线螺旋分散在无菌溶液中；通过雾化吸入的方式，将含有笼状螺旋状硅纳米线的液体送至肺部，与冠状病毒结合实现俘获；被笼状螺旋状硅纳米线捕获的病毒将以痰液的方式排出，形成高浓度的病毒溶液，实现高效提取。
[0014]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：1）笼状纳米螺旋结构尺寸达到百纳米及以下级别，可通过雾化方式吸入且不会对组织
带来不利影响，且可以很好的与病毒尺寸相匹配，通过ace2的功能化修饰，可以高效俘获病毒。
[0015]
2）三维笼状纳米线螺旋结构所撑起的内径空间以及两端开孔，可以选择性地俘获特定尺寸的病毒，使直径更大的细胞和其它大分子无法从两端开口进入，而直径更小的分子结构可以通过螺旋开放侧壁的层间隔过滤出去，实现精准“尺寸靶向”俘获。
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3）笼状纳米线螺旋结构具有良好三维弹性形貌，可以在紧闭空间中适当形变，以适应复杂环境的限制。从结构尺度上看，三维纳米线螺旋能与冠状病毒表面所特有的“触角”在空间上发生牵连，从而增大俘获几率和稳定性。
[0017]
4)硅基材料具有良好的细胞相容性和生物体内可降解性。
[0018]
5)三维笼状纳米线螺旋结构的制备与平面微加工工艺兼容，可以实现批量化制备。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1和2中圆柱状螺旋结构进行病毒俘获及提取过程示意图。
[0020]
图2为本发明实施例3中圆锥状螺旋结构进行病毒俘获及提取示意图。
具体实施方式
[0021]
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明。
[0022]
实施例1本实施例结合附图1详细描述本发明的优选实施方案，具体的是提供一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法。具体包括硅纳米螺旋结构的制备步骤和病毒的俘获及提取步骤，其中，本实施例采用的硅纳米线的笼状螺旋结构为圆柱状，其制备包括以下几个步骤：第一步，在硅片上密排铺上单层的直径200 nm的聚苯乙烯小球，通过icp氧等离子体缩小球直径到100 nm以内；第二步，利用bosch刻蚀工艺对衬底进行循环刻蚀，得到具有平行沟道的硅柱结构；第三步，在1000℃，氮气氛围下湿法氧化1 h，之后干燥备用；第四步，通过金属纳米颗粒辅助ip-sls生长技术，使纳米线螺旋结构沿圆柱阱侧壁生长。其具体过程包括：在温度为200 ℃、压强为140 pa条件下，利用氢等离子体处理5 min，还原铟颗粒表面氧化层，形成催化金属液滴；之后100 ℃、20 pa条件下沉积非晶硅；在高真空（5
×
10
4 pa）、350℃下进行1-2 h退火；最后用氢等离子体刻蚀未被吸收的非晶硅。
[0023]
其次，病毒的俘获及提取包括以下几个步骤：s1：将制得的硅纳米螺旋结构样品放入浓度为0.4%的氢氟酸溶液中，使氧化硅柱快速溶解，得到含有大量硅纳米螺旋线2的混合液；s2：多次过滤、清洗将硅纳米线螺旋分散在超纯水中；s3：加入血管紧张素转化酶ii 3对纳米线进行功能化修饰；血管紧张素转化酶ii即ace2，与新冠病毒表面s-蛋白结合的受体；s4：再次清洗后，通过雾化吸入的方式，将含有螺旋纳米线的液体送至肺部，与冠状病毒1结合实现捕获；
s5：被螺旋纳米线捕获的病毒将以痰液的方式排出，形成高浓度的病毒溶液，实现高效提取。
[0024]
利用氧气刻蚀时纳米球直径变小的同时仍可保持球状的特点，可为不同直径的纳米柱刻蚀提供掩膜。通过有机物纳米球作为掩膜实现圆柱状纳米线螺旋线生长沟道的刻蚀，间距可控范围大。
[0025]
实施例2本实施例提供一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法。如图1所示，具体包括圆柱状硅纳米螺旋结构的制备步骤和病毒的俘获及提取步骤，其中硅纳米线螺旋结构的制备包括以下几个步骤：第一步，利用紫外光刻技术在硅衬底上形成圆形光刻胶阵列，2 μm，间距4 μm；通过icp氧等离子体对光刻胶进行缩胶处理，使光刻胶直径缩小到100 nm；第二步，利用bosch刻蚀工艺对衬底进行循环刻蚀，得到具有平行沟道的硅柱结构；第三步，在1000℃，氧气氛围下干法氧化8 h；第四步，通过金属纳米颗粒辅助ip-sls生长技术，使纳米线螺旋结构沿圆柱阱侧壁生长。其具体过程包括：在温度为200 ℃、压强为140 pa条件下，利用氢等离子体处理5 min，还原铟颗粒表面氧化层，形成催化金属液滴；之后100 ℃、20 pa条件下沉积非晶硅；在高真空（5
×
10
4 pa）、350℃下进行1-2 h退火；最后用氢等离子体刻蚀未被吸收的非晶硅。
[0026]
其次，病毒的俘获及提取包括以下几个步骤：s1：将样品放入浓度为0.4%的氢氟酸溶液中，使氧化硅柱快速溶解，得到含有大量硅纳米螺旋线的混合液；s2：用纳米级孔径过滤膜对混合液进行多次过滤后将硅纳米线螺旋分散在生理盐水中；s3：加入血管紧张素转化酶ii对纳米线进行功能化修饰；血管紧张素转化酶ii 即ace2，是与新冠病毒表面s-蛋白结合的受体；s4：再次清洗后，通过雾化吸入的方式，将含有螺旋纳米线的液体送至肺部，与冠状病毒结合实现捕获；s5：被螺旋纳米线捕获的病毒将以痰液的方式排出，形成高浓度的病毒溶液，实现高效提取。
[0027]
实施例3本实施例结合附图2详细描述本发明的优选实施方案，具体的是提供一种基于硅纳米螺旋结构的精准病毒俘获及提取方法。具体包括硅纳米螺旋结构的制备步骤和病毒的俘获及提取步骤，其中，本实施例采用的硅纳米线的笼状螺旋结构为圆锥状，其制备包括以下几个步骤：第一步，在硅片上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯光刻胶，通过电子书光刻技术，在硅片表面形成直径为100 nm的圆形光刻胶区域；第二步，利用bosch刻蚀工艺对硅衬底进行循环刻蚀，调节刻蚀参数，得到具有平行沟道的硅锥状结构；第三步，在1000℃，氮气氛围下湿法氧化1 h，之后干燥备用；第四步，通过金属纳米颗粒辅助ip-sls生长技术，使纳米线螺旋结构沿圆锥状阱侧壁
生长。其具体过程包括：在温度为200 ℃、压强为140 pa条件下，利用氢等离子体处理5 min，还原铟颗粒表面氧化层，形成催化金属液滴；之后100 ℃、20 pa条件下沉积非晶硅；在高真空（5
×
10
4 pa）、350℃下进行1-2 h退火；最后用氢等离子体刻蚀未被吸收的非晶硅。
[0028]
其次，病毒的俘获及提取包括以下几个步骤：s1：将制得的圆锥状硅纳米螺旋结构样品放入浓度为0.4%的氢氟酸溶液中，使氧化硅柱快速溶解，得到含有大量圆锥状硅纳米螺旋线2的混合液；s2：多次过滤、清洗将硅纳米线螺旋分散在超纯水中；s3：加入血管紧张素转化酶ii 3对纳米线进行功能化修饰；血管紧张素转化酶ii即ace2，与新冠病毒表面s-蛋白结合的受体；s4：再次清洗后，通过雾化吸入的方式，将含有圆锥状螺旋纳米线的液体送至肺部，与冠状病毒1结合实现捕获；s5：被螺旋纳米线捕获的病毒将以痰液的方式排出，形成高浓度的病毒溶液，实现高效提取。
[0029]
圆锥状纳米线螺旋线一端封闭，具有明显的结构优势，更有利于在病毒进入此结构之后将其困住，实现稳定的捕获。

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