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2021-02-02 13:02:00|
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起点商标网 专利名称：从发酵液中分离广谱抗生素阿弗米丁的方法
技术领域：
本发明是涉及一种具有十六元大环内酯类化合物的分离方法，具体地说是一种从阿弗米丁生产菌发酵液中分离广谱抗生素阿弗米丁(Avermectins)的分离方法。
目前已发现9，000多种抗生素，但是可应用抗寄生虫的抗生素却为数不多，寻找能抗寄生虫的抗生素及其生产的简便方法是人们长期探索的课题。
伯格(B.W.Berg)及米勒(T.W.Miller)曾报导从阿弗米丁(Avermectins)生产菌发酵液中采用Sephadex LM-20填料，分离得到十六元大环内酯类抗生素-八个结构相似的四组阿弗米丁化合物-A1a/A1b，A2a/A2b，B1a/B1b，B2a/B2b。结构式如下图所示
R1R2X-YAvermectin A1a Me BusCH=CHAvermectin A1b Me PriCH=CHAvermectin A2a Me BusCH2-CH(OH)Avermectin A2b Me PriCH2-CH(OH)Avermectin B1a H BusCH=CHAvermectin B1b H PriCH=CHAvermectin B2a H BusCH2-CH(OH)Avermectin B2b H PriCH2-CH(OH)
其中主要成份阿弗米丁A1a、A2a、B1a和B2a的总含量＞80%。而阿弗米丁B1在农业上抗线虫和节肢动物最有效，而阿弗米丁B1a的双氢还原物(Ivermectin)，它的药效与阿弗米丁B1相同，且活性更高，毒性相对低，安全，多用于动物和人体。已报导的从发酵液中分离到阿弗米丁B1的方法均需经多次柱层析，因此方法较麻烦(US4160084(1979)]。
本发明的目的在于寻找抗寄生虫抗生素阿弗米丁B1的经济、简易、方便的分离方法。
本发明的目的还以阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物为原料，通过柱层析分离四对阿弗米丁A1、A2、B1和B2异构体的简便、经济的方法。
本发明目的还包括柱层析分离B1(B1a+B1b)，再通过重结晶而得到＞99%纯度的阿弗米丁B1a的方法。
本发明方法包括将阿弗米丁生产菌的发酵液的粗提物，通过一根含有填充料的层析柱，用溶剂淋洗，一次柱层析可收集阿弗米丁A1、A2、B1和B2的产物，B1再经极性溶剂重结晶得到纯度＞99%的B1a，其溶点160-162℃，
＝+56.81，(C＝1.35，CHCl3)。
在本发明中所采用的层析柱填充料可以是中性氧化铝、硅酸镁、氧化镁或硅胶，所述的硅胶可以是硅胶G、硅胶F、硅胶H或硅胶GF等。阿弗米丁生产菌的发酵液和粗提物与填充料的重量比是1∶1-20。
本发明中淋洗溶剂可以是极性溶剂或非极性溶剂。所述的极性溶剂可以是醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇等，如乙醚、四氢呋喃、异丙醚等，卤代烷，如二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等，酮类，如丙酮、丁酮等，酯类，如乙酸乙酯、乙酸丁酯等，取代芳香烃，如甲苯、二甲苯、乙苯等，以及乙腈、二甲基甲酰胺等。所述的非极性溶剂可以是苯、四氯化碳、脂肪烃，如己烷、戊烷、辛烷、石油醚或煤油等。
本发明中可以采用一种溶剂或一种以上的极性或非极性溶剂进行淋洗。所用的溶剂可以是极性与非极性溶剂的，其体积比为0-50∶1-100。
本发明中所用淋洗的溶剂量，可以是原料与溶剂的比例为1∶30-300，推荐比例1∶30-200，采用更多的溶剂也是能达到本发明的目的，但是不太经济。
采用本发明的方法，获得的阿弗米丁B1，可以用醇，如甲醇、乙醇等重结晶，获得纯度＞99%的阿弗米丁B1a，所用重结晶溶剂量是直至阿弗米丁B1溶解为止，然后自然结晶析出。
采用本发明的方法可以分离得到阿弗米丁的四组异构体，每组纯度均可≥90%，产率75-90%。阿弗米丁B1经重结晶可得到＞99%纯度的阿弗米丁B1a，重结晶产率≥80%。采用本发明的方法可以将阿弗米丁B1的双氢还原物分离，得到纯度≥90%的产物。
采用本发明的方法所用的填充料，溶剂均可回收及反复使用，是一种经济、简易、产品纯度高的生产方法，生产成本低，适用于工业化生产。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不限制本发明内容。
实施例1用1公斤硅胶H装柱，将150克阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物，含(2.2%的阿弗米丁)，溶于100毫升乙酸乙酯中进样。
用石油醚与乙酸乙酯的2∶1体积比的混合溶剂淋洗，然后分别收集每瓶为500毫升的淋洗液，第3-6瓶为阿弗米丁A1，第8-12瓶为阿弗米丁A2，第16-18瓶为阿弗米丁B1，第21-28瓶为阿弗米丁B2。分别减压浓缩，即可得纯的阿弗米丁A1 225毫克，A2 2.0克，B1 750毫克，B2 375毫克。
所获产物均经氧化硅板层析，对照分析和经核磁共振谱的结果如下阿弗米丁A1板层析Rf0.701H NMR(200兆周，CDCl3)5.75-5.73(4H，m，9，10，11，22-H)，5.60(1H，m，23-H)，5.35-5.50(3H，m，19，3，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.80(2H，m，8a-H)，4.70(1H，m，1′-H)，3.52(3H，s，5-OCH3).
阿弗米丁A2板层析Rf0.571H NMR(200兆周，CDCl3)5.80(1H，s，9-H)，5.74(1H，m，10-H)，5.73(1H，m，11-H)，5.39(1H，m，19-H)，5.38(2H，m，3-H，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.78(1H，m，1′-H)，4.68(2H，m，8a-H)，4.05(1H，m，5-H)，3.98(1H，m，13-H)，3.78(1H，m，23-H)，3.50(1H，s，23-OH)，3.44(3H，s，5-OCH3).
阿弗米丁B1板层析Rf0.431H NMR(600兆周，CDCl3)5.86(1H，d，J＝10Hz，9-H)，5.42(1H，s，3-H)，5.39(1H，d，1″-H，J＝3.3Hz)，5.40(1H，dd，J1＝J2＝8.1Hz，19-H)，4.988(1H，dd，J1＝1.5Hz，J2＝8.6Hz.15-H)，4.68(2H，dd，J1＝2.2，J2＝14Hz，8a-H)，4.7722(1H，d，J＝3.5Hz，1′-H)，3.93(1H，s，13-H)，3.97(1H，d，J＝6.2Hz，6-H)，5.55(1H，dd，J1＝J2＝10Hz;23-H)，5.76(1H，dd，J＝10Hz;22-H).
阿弗米丁B2板层析Rf0.341H NMR(200兆周，CDCl3)5.83(1H，m，9-H)，5.75(1H，m，10-H)，5.72(1H，m，11-H)，5.43(1H，m，19-H)，5.42(1H，m，3-H)，5.41(1H，m，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.76(1H，m，1′-H)，4.68(2H，m，8a-H)，4.30(1H，m，5-H)，3.97(1H，s，13-H)，3.79(1H，m，23-H)，3.48(1H，s，23-OH).
实施例2用2公斤中性氧化铝装柱，将200克阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物(含阿弗米丁2.0%)，溶于200毫升二氯甲烷中进样，用正己烷∶二氯甲烷∶丙酮＝10∶3∶1的混合溶剂进行展开，收集淋洗液，每500毫升为一瓶，第1-5瓶为阿弗米丁A1，第6-8瓶为阿弗米丁A2，第10-14瓶为B1，第16-21瓶为B2，浓缩后分别获阿弗米丁A1 200毫克，A2 2.0克，B1 800毫克和B2 50毫克。
实施例3用15公斤硅胺G装柱，加入1公斤阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物(含阿弗米丁2.0%)，用苯∶丙酮＝5∶1的混合溶剂展开，分别收集每500毫升为一瓶，第6-18瓶为阿弗米丁A1，第29-36瓶为阿弗米丁A2，第39-55瓶为阿弗米丁为B1，第58-65瓶为阿弗米丁B2。经浓缩，分别获得阿弗米丁A1 2.6克，A2 6.8克，B1 6克和B2 0.6克。
实施例4将上述实施例中所收集的阿弗米丁B1 1.0克，边搅拌边加入甲醇直至阿弗米丁B1溶解，随后静置自然结晶得B1a 0.69克，纯度＞99%。产物分析结果如下柱层析(Rf)0.43UVλmax236nmm.p.160-162℃旋光度
＝+56.81(C＝1.35，CHCl3)MS872核磁共振分析结果列于下表，其中1H NMR(600兆，CDCl3)，13C NMR(600兆，CDCl3)。
权利要求
1.一种以阿弗米丁(Avermectins)生产菌发酵液粗提物为原料，经柱层析、溶剂淋洗分离制备阿弗米丁异构体的方法，其特征是该方法的步骤如下(1)原料经一次柱层析，柱层析填充料可以是中性氧化铝、硅酸镁、氧化镁或硅胶，原料与填充料的重量比可以是1∶1-20，再用一种或一种以上的混合溶剂淋洗，溶剂可以是极性溶剂和非极性溶剂的，体积比为0-50∶1-100，原料与溶剂的比例是1∶30-300，推荐比例是1∶30-200，收集淋洗液，浓缩后分别获得阿弗米丁A1、A2、B1及B2。(2)将阿弗米丁B1用醇溶解，然后自然结晶，获阿弗米丁B1a，所述的醇可以是甲醇、乙醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的填充料硅胶可以是硅胶G，硅胶F，硅胶H或硅胶GF。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的极性溶剂可以是醇，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇，醚类，如乙醚、四氢呋喃、异丙醚，卤代烷，如二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷，酮类，如丙酮、丁酮等，酯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯，取代芳香烃，如甲苯、二甲苯、乙苯以及乙腈、二甲基甲酰胺。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的非极性溶剂可以是苯、四氯化碳、脂肪烃，如己烷、戊烷、辛烷、石油醚、煤油等。
全文摘要
本发明方法是一种从阿弗米丁(Avermectins)生产菌发醇液中采用一次柱层析，用溶剂淋洗、来分离广谱抗生素阿弗米丁A1、A2、B1和B2的方法，产物纯度可大于90％，产率75-90％。从B1再经重结晶可获B1a，纯度大于99％，产率≥80％。本发明方法不仅产品纯度高，而溶剂可回收利用。所以，经济、简易，生产成本低，是一种适用于工业化生产的方法。
文档编号C07D493/14GK1069979SQ9110748
公开日1993年3月17日 申请日期1991年8月28日 优先权日1991年8月28日
发明者沈征武, 吴莲芬, 周凤仪 申请人:中国科学院上海有机化学研究所
技术领域：
本发明是涉及一种具有十六元大环内酯类化合物的分离方法，具体地说是一种从阿弗米丁生产菌发酵液中分离广谱抗生素阿弗米丁(Avermectins)的分离方法。
目前已发现9，000多种抗生素，但是可应用抗寄生虫的抗生素却为数不多，寻找能抗寄生虫的抗生素及其生产的简便方法是人们长期探索的课题。
伯格(B.W.Berg)及米勒(T.W.Miller)曾报导从阿弗米丁(Avermectins)生产菌发酵液中采用Sephadex LM-20填料，分离得到十六元大环内酯类抗生素-八个结构相似的四组阿弗米丁化合物-A1a/A1b，A2a/A2b，B1a/B1b，B2a/B2b。结构式如下图所示
R1R2X-YAvermectin A1a Me BusCH=CHAvermectin A1b Me PriCH=CHAvermectin A2a Me BusCH2-CH(OH)Avermectin A2b Me PriCH2-CH(OH)Avermectin B1a H BusCH=CHAvermectin B1b H PriCH=CHAvermectin B2a H BusCH2-CH(OH)Avermectin B2b H PriCH2-CH(OH)
其中主要成份阿弗米丁A1a、A2a、B1a和B2a的总含量＞80%。而阿弗米丁B1在农业上抗线虫和节肢动物最有效，而阿弗米丁B1a的双氢还原物(Ivermectin)，它的药效与阿弗米丁B1相同，且活性更高，毒性相对低，安全，多用于动物和人体。已报导的从发酵液中分离到阿弗米丁B1的方法均需经多次柱层析，因此方法较麻烦(US4160084(1979)]。
本发明的目的在于寻找抗寄生虫抗生素阿弗米丁B1的经济、简易、方便的分离方法。
本发明的目的还以阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物为原料，通过柱层析分离四对阿弗米丁A1、A2、B1和B2异构体的简便、经济的方法。
本发明目的还包括柱层析分离B1(B1a+B1b)，再通过重结晶而得到＞99%纯度的阿弗米丁B1a的方法。
本发明方法包括将阿弗米丁生产菌的发酵液的粗提物，通过一根含有填充料的层析柱，用溶剂淋洗，一次柱层析可收集阿弗米丁A1、A2、B1和B2的产物，B1再经极性溶剂重结晶得到纯度＞99%的B1a，其溶点160-162℃，
＝+56.81，(C＝1.35，CHCl3)。
在本发明中所采用的层析柱填充料可以是中性氧化铝、硅酸镁、氧化镁或硅胶，所述的硅胶可以是硅胶G、硅胶F、硅胶H或硅胶GF等。阿弗米丁生产菌的发酵液和粗提物与填充料的重量比是1∶1-20。
本发明中淋洗溶剂可以是极性溶剂或非极性溶剂。所述的极性溶剂可以是醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇等，如乙醚、四氢呋喃、异丙醚等，卤代烷，如二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等，酮类，如丙酮、丁酮等，酯类，如乙酸乙酯、乙酸丁酯等，取代芳香烃，如甲苯、二甲苯、乙苯等，以及乙腈、二甲基甲酰胺等。所述的非极性溶剂可以是苯、四氯化碳、脂肪烃，如己烷、戊烷、辛烷、石油醚或煤油等。
本发明中可以采用一种溶剂或一种以上的极性或非极性溶剂进行淋洗。所用的溶剂可以是极性与非极性溶剂的，其体积比为0-50∶1-100。
本发明中所用淋洗的溶剂量，可以是原料与溶剂的比例为1∶30-300，推荐比例1∶30-200，采用更多的溶剂也是能达到本发明的目的，但是不太经济。
采用本发明的方法，获得的阿弗米丁B1，可以用醇，如甲醇、乙醇等重结晶，获得纯度＞99%的阿弗米丁B1a，所用重结晶溶剂量是直至阿弗米丁B1溶解为止，然后自然结晶析出。
采用本发明的方法可以分离得到阿弗米丁的四组异构体，每组纯度均可≥90%，产率75-90%。阿弗米丁B1经重结晶可得到＞99%纯度的阿弗米丁B1a，重结晶产率≥80%。采用本发明的方法可以将阿弗米丁B1的双氢还原物分离，得到纯度≥90%的产物。
采用本发明的方法所用的填充料，溶剂均可回收及反复使用，是一种经济、简易、产品纯度高的生产方法，生产成本低，适用于工业化生产。
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不限制本发明内容。
实施例1用1公斤硅胶H装柱，将150克阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物，含(2.2%的阿弗米丁)，溶于100毫升乙酸乙酯中进样。
用石油醚与乙酸乙酯的2∶1体积比的混合溶剂淋洗，然后分别收集每瓶为500毫升的淋洗液，第3-6瓶为阿弗米丁A1，第8-12瓶为阿弗米丁A2，第16-18瓶为阿弗米丁B1，第21-28瓶为阿弗米丁B2。分别减压浓缩，即可得纯的阿弗米丁A1 225毫克，A2 2.0克，B1 750毫克，B2 375毫克。
所获产物均经氧化硅板层析，对照分析和经核磁共振谱的结果如下阿弗米丁A1板层析Rf0.701H NMR(200兆周，CDCl3)5.75-5.73(4H，m，9，10，11，22-H)，5.60(1H，m，23-H)，5.35-5.50(3H，m，19，3，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.80(2H，m，8a-H)，4.70(1H，m，1′-H)，3.52(3H，s，5-OCH3).
阿弗米丁A2板层析Rf0.571H NMR(200兆周，CDCl3)5.80(1H，s，9-H)，5.74(1H，m，10-H)，5.73(1H，m，11-H)，5.39(1H，m，19-H)，5.38(2H，m，3-H，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.78(1H，m，1′-H)，4.68(2H，m，8a-H)，4.05(1H，m，5-H)，3.98(1H，m，13-H)，3.78(1H，m，23-H)，3.50(1H，s，23-OH)，3.44(3H，s，5-OCH3).
阿弗米丁B1板层析Rf0.431H NMR(600兆周，CDCl3)5.86(1H，d，J＝10Hz，9-H)，5.42(1H，s，3-H)，5.39(1H，d，1″-H，J＝3.3Hz)，5.40(1H，dd，J1＝J2＝8.1Hz，19-H)，4.988(1H，dd，J1＝1.5Hz，J2＝8.6Hz.15-H)，4.68(2H，dd，J1＝2.2，J2＝14Hz，8a-H)，4.7722(1H，d，J＝3.5Hz，1′-H)，3.93(1H，s，13-H)，3.97(1H，d，J＝6.2Hz，6-H)，5.55(1H，dd，J1＝J2＝10Hz;23-H)，5.76(1H，dd，J＝10Hz;22-H).
阿弗米丁B2板层析Rf0.341H NMR(200兆周，CDCl3)5.83(1H，m，9-H)，5.75(1H，m，10-H)，5.72(1H，m，11-H)，5.43(1H，m，19-H)，5.42(1H，m，3-H)，5.41(1H，m，1″-H)，5.00(1H，m，15-H)，4.76(1H，m，1′-H)，4.68(2H，m，8a-H)，4.30(1H，m，5-H)，3.97(1H，s，13-H)，3.79(1H，m，23-H)，3.48(1H，s，23-OH).
实施例2用2公斤中性氧化铝装柱，将200克阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物(含阿弗米丁2.0%)，溶于200毫升二氯甲烷中进样，用正己烷∶二氯甲烷∶丙酮＝10∶3∶1的混合溶剂进行展开，收集淋洗液，每500毫升为一瓶，第1-5瓶为阿弗米丁A1，第6-8瓶为阿弗米丁A2，第10-14瓶为B1，第16-21瓶为B2，浓缩后分别获阿弗米丁A1 200毫克，A2 2.0克，B1 800毫克和B2 50毫克。
实施例3用15公斤硅胺G装柱，加入1公斤阿弗米丁生产菌发酵液的粗提物(含阿弗米丁2.0%)，用苯∶丙酮＝5∶1的混合溶剂展开，分别收集每500毫升为一瓶，第6-18瓶为阿弗米丁A1，第29-36瓶为阿弗米丁A2，第39-55瓶为阿弗米丁为B1，第58-65瓶为阿弗米丁B2。经浓缩，分别获得阿弗米丁A1 2.6克，A2 6.8克，B1 6克和B2 0.6克。
实施例4将上述实施例中所收集的阿弗米丁B1 1.0克，边搅拌边加入甲醇直至阿弗米丁B1溶解，随后静置自然结晶得B1a 0.69克，纯度＞99%。产物分析结果如下柱层析(Rf)0.43UVλmax236nmm.p.160-162℃旋光度
＝+56.81(C＝1.35，CHCl3)MS872核磁共振分析结果列于下表，其中1H NMR(600兆，CDCl3)，13C NMR(600兆，CDCl3)。
权利要求
1.一种以阿弗米丁(Avermectins)生产菌发酵液粗提物为原料，经柱层析、溶剂淋洗分离制备阿弗米丁异构体的方法，其特征是该方法的步骤如下(1)原料经一次柱层析，柱层析填充料可以是中性氧化铝、硅酸镁、氧化镁或硅胶，原料与填充料的重量比可以是1∶1-20，再用一种或一种以上的混合溶剂淋洗，溶剂可以是极性溶剂和非极性溶剂的，体积比为0-50∶1-100，原料与溶剂的比例是1∶30-300，推荐比例是1∶30-200，收集淋洗液，浓缩后分别获得阿弗米丁A1、A2、B1及B2。(2)将阿弗米丁B1用醇溶解，然后自然结晶，获阿弗米丁B1a，所述的醇可以是甲醇、乙醇。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的填充料硅胶可以是硅胶G，硅胶F，硅胶H或硅胶GF。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的极性溶剂可以是醇，如甲醇、乙醇、异丙醇、丙醇，醚类，如乙醚、四氢呋喃、异丙醚，卤代烷，如二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷，酮类，如丙酮、丁酮等，酯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯，取代芳香烃，如甲苯、二甲苯、乙苯以及乙腈、二甲基甲酰胺。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的非极性溶剂可以是苯、四氯化碳、脂肪烃，如己烷、戊烷、辛烷、石油醚、煤油等。
全文摘要
本发明方法是一种从阿弗米丁(Avermectins)生产菌发醇液中采用一次柱层析，用溶剂淋洗、来分离广谱抗生素阿弗米丁A1、A2、B1和B2的方法，产物纯度可大于90％，产率75-90％。从B1再经重结晶可获B1a，纯度大于99％，产率≥80％。本发明方法不仅产品纯度高，而溶剂可回收利用。所以，经济、简易，生产成本低，是一种适用于工业化生产的方法。
文档编号C07D493/14GK1069979SQ9110748
公开日1993年3月17日 申请日期1991年8月28日 优先权日1991年8月28日
发明者沈征武, 吴莲芬, 周凤仪 申请人:中国科学院上海有机化学研究所
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