一种能够提升微量核酸扩增效率的方法与流程

[0001]
本发明涉及核算扩增方法，特别涉及一种能够提升微量核酸扩增效率的方法。


背景技术：

[0002]
微量核酸的扩增对于生命科学、法医鉴定等领域具有重要意义。来自样本的微量核酸分子数量水平往往很低，不能直接进行相关检测或有效参与生物反应，所以先需要进行扩增才能进入下游实验。然而，因为一些样本(例如痕量dna、单细胞基因组)的量很低，即使是核酸扩增反应，也难以在短时间内将其大量扩增。这些条件下的扩增反应往往需要进行长时间的等待，才能得到具有较高扩增倍数的样本。这大大阻碍了临床、法医等领域快速检测的发展。
[0003]
核酸扩增反应的扩增速度并不是恒定的，在其他物质过量的前提下，其速度主要取决于其中的核酸浓度。扩增反应起始状态下核酸的浓度很低，但其他用于扩增的组分(如无机盐、水、单链引物、寡核苷酸、荧光染料、dna聚合酶等)的量很高，处于过量状态。过量的组分虽然在反应进入快速阶段时利于反应的正向进行，但在起始阶段，这些组分占用了反应体系的大部分体积，导致微量核酸的浓度被进一步稀释，不利于反应的开始，导致了扩增初期的低效。此外，在核酸扩增反应中，作为产物核酸在后续扩增中往往也是模板。在这一前提下，在核酸被扩增到较高浓度以后，反而会限制反应正向进行，使本处于较高效率的扩增反应变得低效。


技术实现要素：

[0004]
发明目的：本发明目的是提供一种能够提升微量核酸扩增效率的方法。
[0005]
技术方案：本发明提供一种能够提升微量核酸扩增效率的方法，扩增开始前配置扩增溶液体系时，一次性将全部微量核酸物质投入反应体系，而只投入一部分用于扩增的其他物质，在扩增反应开始后追加投入剩余的用于扩增的其他物质，追加投入后继续核酸扩增。
[0006]
进一步地，追加投入至少一次或利用流体连续注入，每次追加投入的体积相同或不同。
[0007]
进一步地，所述用于扩增的其他物质包括无机盐、水、单链引物、寡核苷酸、荧光染料、dna聚合酶、不直接参与反应的有机分子。
[0008]
进一步地，在追加投入其余用于扩增的其他物质前，丢弃当前反应体系体积占比小于99.9999999％的部分，再进行追加投入操作。
[0009]
进一步地，开始追加投入其余用于扩增的其他物质时，反应体系中核酸浓度已经扩增至起始浓度的1.001-1000倍。
[0010]
进一步地，每次追加投入其余用于扩增的其他物质后，反应体系中核酸浓度下降至追加投入过程前的0.001-0.999倍。
[0011]
进一步地，每次追加投入的一部分除核酸外的其他物质体积和该次扩增所有除核
酸外反应物质的总体积的比例为10-9-1。进一步地，反应开始时的包含反应溶液的水相部分体积为10fl-100μl，反应在结束时体系体积增加至反应开始时的1.1-10
9
倍。
[0012]
进一步地，所述反应体系是仅由反应溶液构成的单相体系或是由反应溶液和不相溶的其他液体或固体构成的两相体系。
[0013]
进一步地，所述微量核酸在扩增开始前的质量在10-7-10
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pg范围内。
[0014]
进一步地，所述扩增包括mda(多重链置换扩增)、pcr(聚合酶链式反应)、rca(滚环扩增)、dop-pcr(简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应)、malbac(多次退火环状循环扩增)、lamp(环介导等温扩增)。
[0015]
上述技术方案中：
[0016]
本发明方法通过改变除微量核酸以外其他反应组分的添加时机，提高核酸扩增放应的效率，缩短反应所用时间。这种方法的特征在于，在配置所述扩增溶液体系时，一次性将全部微量核酸物质投入反应体系，而只投入一部分用于扩增的其他物质，在扩增反应开始进行后追加投入用于扩增的其他物质，追加投入过程后体系中的核酸浓度下降，并进行核酸扩增。
[0017]
在应用这种方法时，因为反应起始时投入了全部待扩增的核酸，但并不会将所有其他反应物质投入，所以起始状态下的核酸浓度被提高，其他物质的过量程度较低。这样，决定扩增反应速度的核酸浓度较高，反应得以较快进入快速阶段。此后加入的其他反应物质又对已经变得过高不利于扩增的核酸浓度起到了稀释作用，延缓反应速度下降过程的发生。在扩增反应开始进行后追加投入的用于扩增的其他物质包含无机盐、水、单链引物、寡核苷酸、荧光染料、dna聚合酶、不直接参与反应的有机分子中的一种或多种。这是因为在反应初期降低任何一种除核酸外的反应物的体积都有利于提高核酸浓度，虽然理论上最有效的方案是将所有除了核酸模板以外的反应物质体积都减少，但实际情况中需要进行微调，以确保反应组分的减少并不会从生物大分子的机理角度降低反应的扩增效率。追加投入其余用于扩增的其他物质前，可以丢弃现有反应体系体积占比的0.001-0.999的部分，然后进行追加投入操作。这样可以达到节省试剂的目的。如果现有核酸已经广泛地接受了扩增，适当的丢弃操作只会减少核酸分子的拷贝数量，不会丢失特有的片段。
[0018]
即使提高了其起始核酸浓度，反应仍可能需要一定时间才能进入高效期。此时扩增体系中的核酸浓度已经出现了变化，投入用于扩增的其他反应物时，体系中核酸浓度应已经扩增至起始浓度的1.001-1000倍。而在追加投入其余用于扩增的其他物质后，体系中核酸浓度下降至追加投入过程前的0.99-0.001倍，以体现稀释作用。为了准确定量上述核酸浓度的变化，在反应过程中可以通过测量荧光染料发射光强度、紫外吸收光谱测量体系中的核酸浓度。
[0019]
这种分次加样的方法可以兼容多种反应体系配置和加样体积、次数设置。反应开始时的包含反应溶液的水相部分体积为1fl-100μl，优选1pl-1μl，反应在结束时体系体积增加至反应开始时的1.1-10
11
倍。反应体系既可以是仅由反应溶液构成的单相体系，也可以是由反应溶液和不相溶的其他液体或固体构成的两相体系。追加投入过程至少进行1次，其完成方式既可以分别进行1-1000次，也可以利用流体连续注入。即，小体积的水相扩增体系可以分散在不相溶的连续相中，并在扩增过程中利用微流控芯片、毛细管、微针等手段完成追加投入的体系加样；也可以在较大体积的连续水相中进行扩增反应，并用移液枪、毛细
管、注射器等手段完成追加投入的体系加样。根据加样方式的不同，其完成次数可以自由调节，稀释倍数波动范围也较大。在一些手段中，可以在反应过程中连续不断地注入新的不含核酸的反应组分，这时应将加样次数算作1次。
[0020]
根据起始反应体积、样品来源的不同，微量核酸物质在扩增开始前的质量在10-7-10
5
pg范围内。扩增方法可以选择mda(多重链置换扩增)、pcr(聚合酶链式反应)、rca(滚环扩增)、dop-pcr(简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应)malbac(多次退火环状循环扩增)、lamp(环介导等温扩增)。因为不涉及反应组分的变更，本扩增方法可以结合不同扩增方法和试剂搭配使用，通用性强。
[0021]
有益效果：本发明的扩增方法，相对于未使用本方法的普通扩增，扩增所需总时间缩短1/3以上。同时，扩大的反应体系允许扩增反应进一步正向进行，达到更大的扩增倍数，提高了扩增的效率。适用于多种不同体积、核酸起始量的不同扩增方法，并可以依据使用情况灵活调整各阶段的体积。
附图说明
[0022]
图1为实施例1中扩增体系体积的变化情况；
[0023]
图2为实施例1中扩增体系中核酸浓度的变化情况；
[0024]
图3为实施例2中微液滴反应腔的图片，水相反应溶液分散在连续的hfe-7500油相中。
具体实施方式
[0025]
实施例1：
[0026]
原理验证实验：配置两个初始核酸浓度相差10
4
倍，分别为2ng/μl(组1)和0.2pg/μl(组2)的体系进行mda反应，具体配方见下表。
[0027][0028]
将组1和组2溶液置于30摄氏度环境中开始mda扩增反应。在mda的扩增过程中，分多次将组1的体系稀释共10
4
倍，这样它的初始浓度可以等效为0.2pg/μl，与组2相同。稀释溶液为和mda反应体系中各组分浓度相同的但不含模板的溶液(配方见上表)，稀释次数设置为7次。每次稀释时，取出2.2μl的反应液(其余丢弃)和6μl用于稀释组1的溶液混合，即一次稀释～3.727倍。7次稀释操作后，稀释倍数将达到～9994倍，近似达到稀释10000倍的要
求。组1的稀释过程见图1中黑色线；组2未进行稀释，见图1中灰色线。因为每次稀释都会丢弃一些模板，故在反应结束时，组1结果对应的起始核酸量和组2是相近的。
[0029]
evagreen荧光会在扩增过程中随着dna浓度的上升而增长，在mda过程中使用荧光定量pcr仪对其进行测定，以表征dna浓度的变化。mda的荧光定量图如图2所示，高核酸起始浓度(组1，图2中黑色曲线)在反应开始后不久即出现了明显的“抬头”，大大缩减了反应初期的低效率时间(对比图2中灰色曲线，即组2)。
[0030]
在浓度开始出现明显的大幅上升(反应开始后126分钟)后，开始逐级稀释步骤，每次的稀释操作依次在图中用箭头表示。每次稀释彼此间隔16分钟。图2中灰色曲线是作为对照的0.2pg/μl起始量mda反应，该反应全程未进行稀释操作，但在其他样品被取出进行稀释时，这个样品也被一同取出，使组间的反应条件尽可能保持一致。每两次稀释之间反应体系的荧光都处于高速增长的时期，这体现了稀释的效果：使本来存在减速可能的扩增反应更长久地保持高速扩增，达到加速mda的目的。
[0031]
本次实验中，逐级稀释法快速mda仅用了～280分钟就将核酸扩增至接近饱和的状态，而在配制时即进行了稀释的低起始浓度mda反应则需要～1100分钟才能达到近似的效果。
[0032]
实施例2：
[0033]
使用dna分子长度为15kbp的核酸溶液，配置初始核酸浓度为1.7pg/μl的mda体系，并准备后续投入的不含核酸的体系，具体配方见下表。
[0034][0035]
随后将实验组溶液(2μl)利用微流控共聚焦方式加入20μlhfe-7500油相中，形成平均体积为1pl(直径为12.4μm)的液滴(见图3)。然后将液体置于30摄氏度环境下进行mda反应。由于泊松分布，可计算得出所有液滴中有10％含有核酸模板，而有90％不含有核酸，不能开始扩增，即，有效初始mda体系体积为0.2μl。
[0036]
在反应进行1小时后，利用交流电场对所有液滴进行破乳操作。此时不含模板的液滴中的溶液对已扩增的含有模板的溶液起到了稀释作用，稀释比为10倍。同时液滴体系转变为油水分层体系，水相连成一体。再进行30分钟mda后，向水相中加入8μl追加投入溶液，水相体积由2μl变为10μl，体系中的dna被稀释5倍。再进行20分钟mda后，向水相中加入30μl追加投入溶液，水相体积由10μl变为40μl，体系中的dna被稀释4倍。40分钟后结束扩增并收集水相产物。
[0037]
本例中起始状态下包含模板的mda体积为0.2μl，剩余的用于扩增的其他物质经过3次追加，在结束时包含dna的mda溶液体积为40μl，达到了200倍稀释比例。
[0038]
实施例3：
[0039]
按照以下配方配制pcr反应体系。
[0040][0041]
pcr反应的温度循环设置如下表：
[0042][0043]
按照该配方，在反应开始时的除核酸以外的其他反应物质仅加入总量的1/20，核酸的起始浓度提高了5倍。依照定量pcr的反应原理，起始核酸浓度较高的pcr反应进入显著扩增阶段的时间(即“抬头时间”)会出现线性缩短，预期能够缩短5个循环。在该反应进行10个温度循环后再加入剩余的所有“追加投入溶液”，并继续进行10个温度循环的扩增，然后结束扩增反应。
[0044]
较为浓缩的初期核酸模板减少了pcr中效率不显著的基线时间的长度，在反应进入较快速的显著扩增时期后，核酸浓度呈明显的指数增加，此时追加投入反应体系，促进反应正向进行。反应结束后，相比一次性投入所有反应组分的传统pcr体系，这种提高效率的pcr反应节省了初期效率较低的5个温度循环时间，增加了反应的效率。
[0045]
实施例4：
[0046]
配置10μl标准的mda核酸扩增体系，并在其中加入100pg的起始核酸模板(即初始浓度达到10pg/μl)。将上述扩增体系利用微流控芯片生成大量体积为10fl的微液滴(即直径约为2.7μm)。随后，利用毛细管在显微镜下挑选出1个单独的液滴并注入洁净的hfe-7500油相体系中，并在其上加注矿物油，以防止水相挥发。此时，这一体系中仅包含10fl的水相体积和10-7
pg的核酸模板，保证了起始阶段只有非常少量的随机核酸片段，较低的数量方便后续对扩增结果进行测序分析，检测扩增过程中出现的碱基配对错误。将温度调节至30摄氏度开始扩增。
[0047]
在扩增进行30分钟后，使用移液枪向矿物油和hfe-7500界面中间(即液滴所在层)加入10μl不包含核酸的mda反应溶液，即将体积扩大了10
9
倍，再进行60分钟扩增后结束反应。随后进行标准的文库构建和测序过程。

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