一种匹可硫酸钠半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用与流程

2021-02-02 13:02:48|

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[0001]
本发明涉及食品和/或保健品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种匹可硫酸钠半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

[0002]
匹可硫酸钠(sodium picosulfate)是一种刺激性泻药，通过刺激肠道蠕动、分泌，并可抑制肠腔内水分吸收，达到治疗便秘的作用。由于其具有显著的润肠通便功效，有些不法商家为了达到减肥、健美等效果，在酵素食品或声称具有减肥功能的保健食品中添加匹可硫酸钠，然而，长期食用过量的匹可硫酸钠可能会引起肠道系统紊乱或胃黏膜急性损伤。
[0003]
目前，应用于食品中匹可硫酸钠的最常规的检测方法主要是高效液相色谱
-ꢀ
串联质谱(hplc-ms/ms)法。公开号为cn110501438a的中国专利《一种减肥茶中匹可硫酸钠的检测方法》公开了一种运用三重四级杆串联质谱法检测减肥茶中匹可硫酸钠的方法。然而，这种方法虽然可以对样品中匹可硫酸钠进行精确定量，而且结果稳定，但存在前处理相对复杂、检测周期长、设备昂贵、对操作人员有一定专业要求等不足，难以实现现场快速检测的目的。因此，急需开发出一种快速、简单的减肥保健食品中匹可硫酸钠的快速检测方法。
[0004]
相比于现有基于色谱的方法，基于抗原-抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的匹可硫酸钠半抗原、制备出灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中还未见有关于匹可硫酸钠半抗原、人工抗原、抗体的相关报道。

技术实现要素：

[0005]
本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供两种匹可硫酸钠半抗原。
[0006]
本发明的第二个目的在于提供两种匹可硫酸钠人工抗原。
[0007]
本发明的第三个目的在于提供一种匹可硫酸钠抗体。
[0008]
本发明的第四个目的在于提供一种用于免疫检测匹克硫酸钠的人工抗原组。
[0009]
本发明的第五个目的在于提供一种匹可硫酸钠免疫检测试剂盒。
[0010]
一种匹可硫酸钠半抗原，其特征在于，所述匹可硫酸钠半抗原的结构式如式 (i)或式(iii)所示：
[0011][0012]
所述式(i)的匹可硫酸钠半抗原采用系统命名法命名为4-((4-(羧基甲氧基) 苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠；
[0013]
所述式(iii)的匹可硫酸钠半抗原采用系统命名法命名为4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠。
[0014]
作为一种优选地可实施方式，所述4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸钠(pc1)的制备方法为：以无水二氯甲烷作为溶剂，将2
-ꢀ
(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与三乙胺混合，加入氯磺酸，在室温搅拌下反应，分离纯化得4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基) (吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸。再将4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸溶解于甲醇，再加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用浓度为1mol/l的盐酸调节ph为6～7，即得 4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠(pc1)。
[0015]
更优选地，所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与三乙胺的摩尔比为1:2～5。
[0016]
最优选地，所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与三乙胺的摩尔比为1:4。
[0017]
更优选地，所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯、三乙胺与氯磺酸的摩尔比为1～1.5:2～5:1～2。
[0018]
最优选地，所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯、三乙胺与氯磺酸的摩尔比为1:4:1.5。
[0019]
更优选地，所述4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基) 苯基硫酸与甲醇的摩尔比为1～2:1～3。
[0020]
最优选地，所述4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基) 苯基硫酸与甲醇的摩尔比为1:1。
[0021]
所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯的结构式为
[0022]
所述4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸的结构式
为
[0023]
作为一种优选地可实施方式，所述4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基) (吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠(pc3)的制备方法为以二氯甲烷作为溶剂，将 6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯与三乙胺混合，加入氯磺酸在室温搅拌下反应3～5h，分离纯化得到6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基)甲基)苯氧基)己酸乙酯。将6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基) 甲基)苯氧基)己酸乙酯溶解于甲醇，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得。
[0024]
更优选地，所述6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯与三乙胺的摩尔比为1:2～5。
[0025]
最优选地，所述6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯与三乙胺的摩尔比为1:4。
[0026]
更优选地，所述6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯、三乙胺与氯磺酸的摩尔比为1～1.5:2～5:1～2。
[0027]
最优选地，所述6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯、三乙胺与氯磺酸的摩尔比为1:4:1.5。
[0028]
更优选地，所述4-(((4-((6-乙氧基-6-氧己基)氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸与甲醇的摩尔比为1～2:1～3。
[0029]
最优选地，所述4-(((4-((6-乙氧基-6-氧己基)氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸与甲醇的摩尔比为1:1。
[0030]
所述6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯的结构式为
[0031]
所述6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基)甲基)苯氧基)己酸乙酯的结构式为
[0032]
一种匹可硫酸钠半抗原，其特征在于，所述匹可硫酸钠半抗原的结构式如式 (ii)或式(iv)所示：
[0033][0034]
所述式(ii)匹可硫酸钠半抗原采用系统命名法命名为2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
[0035]
所述式(iv)匹可硫酸钠半抗原采用系统命名法命名为2-(4-((4-(苄氧基) 苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
[0036]
作为一种优选地可实施方式，所述2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基) 苯氧基)乙酸(pc2)的制备方法为：将2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯，溶解于甲醇，再按体积比为1:1，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
[0037]
优选地，2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与甲醇的摩尔比为1～2:1～3。
[0038]
优选地，2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与氢氧化钠的摩尔比为1～1.5:1～2。
[0039]
作为一种优选地可实施方式，所述2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯氧基)乙酸(pc4)的制备方法为：将4-((4-(苄氧基)苯基) (吡啶-2-基)甲基)苯酚充分溶解于dmf，加入碳酸铯和溴乙酸乙酯，50～60℃ 下反应3～5h，反应结束后先除去溶剂dmf，用水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去乙酸乙酯得中间产物2-(4-((4-(苄氧基) 苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯。将2-(4-((4-(苄氧基)苯基) (吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯溶解于甲醇，2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/l 的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph 为6～7，即得。
[0040]
更优选地，所述4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯酚、碳酸铯和溴乙酸乙酯的摩尔比为1～2:1～1.5:1～2。
[0041]
最优选地，所述4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯酚、碳酸铯和溴乙酸乙酯的摩尔比为1:1.2:1。
[0042]
更优选地，所述2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基) 乙酸乙酯与氢氧化钠的摩尔比为1～2:1～2。
[0043]
本发明还提供了一种匹可硫酸钠人工抗原pc1-载体蛋白或pc3-载体蛋白，是在匹可硫酸钠半抗原pc1或pc3偶联载体蛋白得到；
[0044]
其结构式如式(v)或式(vi)所示：
[0045][0046]
作为一种优选地可实施方式，所述匹可硫酸钠人工抗原pc1-载体蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
[0047]
(1)将pc1与nhs、edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌 2～4h，得到pc1活化液；
[0048]
(2)将载体蛋白加入到pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；
[0049]
(3)将pc1活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白溶液中，4℃反应12 h；
[0050]
(4)用pbs缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即匹可硫酸钠免疫原pc1-载体蛋白，分装于离心管中，于-20℃保存备用。
[0051]
优选地，步骤(1)中所述pc1、nhs与edc的质量比为1:1.1～2:1～2.1。
[0052]
更优选地，步骤(1)中所述pc1、nhs与edc的质量比为1:1.4:1.6。
[0053]
优选地，步骤(2)中所述载体蛋白与pbs缓冲液的质量体积比为10mg:1ml。
[0054]
优选地，步骤(1)中所述pc1与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为1～ 2:1～4。
[0055]
更优选地，步骤(1)中所述pc1与步骤(2)中所述载体蛋白的质量比为 1:3。
[0056]
作为一种优选地可实施方式，所述匹可硫酸钠人工抗原pc3-载体蛋白的制备方法与pc1-载体蛋白的制备方法相同，即：将pc1替换为pc3用于pc3-载体蛋白的制备。
[0057]
本发明还提供了一种匹可硫酸钠人工抗原pc2-载体蛋白或pc4-载体蛋白，是在匹可硫酸钠半抗原pc2或pc4偶联载体蛋白得到；
[0058]
其结构式如式(vii)或式(viii)所示：
[0059][0060]
作为一种优选地可实施方式，所述匹可硫酸钠人工抗原pc2-载体蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：
[0061]
(1)将pc2与nhs、edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌 2～4h，得到pc1活化液；
[0062]
(2)将载体蛋白加入到pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；
[0063]
(3)将pc2活化液缓慢逐滴加入步骤(2)的载体蛋白溶液中，4℃反应 12h；
[0064]
(4)用pbs缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到
载体蛋白；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的匹可硫酸钠抗体。
[0082]
进一优选地，所述匹可硫酸钠抗体为利用免疫原pc1-lf制备的匹可硫酸钠多克隆抗体。
[0083]
进一优选地，所述包被原为pc2-ova。
[0084]
优选地，所述匹可硫酸钠免疫检测试剂盒为胶体金快速检测试剂盒，所述胶体金快速检测试剂盒含有：
[0085]
底板和依次排列在底板上的样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫内吸附有胶体金标记的上述匹可硫酸钠抗体，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用人工抗原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述人工抗原为所述人工抗原为上述包被原pc2-载体蛋白。
[0086]
进一优选地，匹可硫酸钠抗体为利用免疫原pc1-lf制备的匹可硫酸钠多克隆抗体。
[0087]
进一优选地，所述包被原为pc2-ova。
[0088]
本发明还提供了所述匹可硫酸钠免疫检测试剂盒在食品和/或保健品中匹可硫酸钠的免疫快速检测中的应用。
[0089]
优选地，提供了所述匹可硫酸钠免疫检测试剂盒中的所述酶联免疫试剂盒和 /或所述胶体金快速检测卡在食品和/或保健品中匹可硫酸钠的免疫快速检测中的应用。
[0090]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0091]
本发明制备得到了匹可硫酸钠半抗原pc1、pc2、pc3、pc4，应用半抗原 pc1、pc2、pc3、pc4偶联载体蛋白得到人工抗原，其中，半抗原pc1或pc3 偶联载体蛋白得到免疫原；pc2或pc4偶联载体蛋白得到包被原，以及应用免疫原制备匹可硫酸钠抗体，该抗体对匹可硫酸钠具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为5ng/ml，最低检测限为0.10ng/ml，对结构类似物的交叉反应率均低于10％，说明该匹可硫酸钠抗体对匹可硫酸钠具有极高的特异性，可有效的排除其类似物的干扰，为建立匹可硫酸钠的酶联免疫检测方法提供了核心试剂。
[0092]
另外，本发明利用匹可硫酸钠抗体开发了匹可硫酸钠免疫检测试剂盒在食品和/或含保健品中匹可硫酸钠的免疫快速检测中的应用。本发明开发的酶联免疫试剂盒和胶体金快速检测试剂盒能够特异性识别匹可硫酸钠，对匹可硫酸钠的检测灵敏度高。
附图说明
[0093]
图1为匹可硫酸钠免疫原pc1-lf的合成路线。
[0094]
图2为lf、pc1与pc1-lf的紫外光谱图。
[0095]
图3为lf、pc3与pc3-lf紫外光谱图。
[0096]
图4为匹可硫酸钠包被原pc2-ova的合成路线。
[0097]
图5为ova、pc2与pc2-ova的紫外光谱图。
[0098]
图6为ova、pc4与pc4-ova的紫外光谱图
[0099]
图7为匹可硫酸钠抗体对匹可硫酸钠的标准抑制曲线。
[0100]
图8为匹可硫酸钠胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图，其中1：pvc底板； 2：样品垫；3：结合垫；4：nc膜；5：检测线(t点)；6：质控线(c点)； 7：吸水垫。
[0101]
图9为匹可硫酸钠胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
[0102]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0103]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0104]
实施例1匹可硫酸钠半抗原的合成与鉴定
[0105]
利用匹可硫酸钠结构的特征，在试验数据的基础上，设计了2种人工半抗原。
[0106]
1、半抗原4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠 (pc1)的合成与鉴定
[0107][0108]
具体合成步骤包括：
[0109]
取2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯(1mol)，三乙胺(4mol)，以无水二氯甲烷作为溶剂，与氯磺酸(1.5mol)在室温搅拌下反应3～5h，分离纯化得4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸。将4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2-基) 甲基)苯基硫酸溶解于甲醇，4-((4-(2-乙氧基-2-氧乙氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得。
[0110]
4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠核磁结果： 1
h nmr(600mhz,methanol-d
4
)δ4.07(q,j＝7.1hz,1h),9.74～-1.67(m,9h), 3.24(q,j＝7.3hz,11h),1.37～1.28(m,18h).
[0111]
4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠质谱结果： ms：c
20
h
17
no
7
s：415.07，esi-[m-h]-:：414.0。
[0112]
2、半抗原2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸(pc2) 的合成与鉴定
[0113]
[0114]
具体合成步骤包括：
[0115]
将2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯，溶解于甲醇，2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液5～10ml在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯氧基)乙酸。
[0116]
2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸核磁结果：
1
h nmr (600mhz,acetone-d
6
)δ8.53(ddd,j＝4.8,1.9,0.9hz,3h),7.70(ddt,j＝9.5,7.7, 1.7hz,3h),7.24～7.19(m,4h),7.19～7.13(m,7h),7.09～7.03(m,6h),6.90～6.85 (m,6h),6.80～6.75(m,6h),5.56(t,j＝2.6hz,3h),4.69(s,6h),4.20(q,j＝7.1hz, 6h),3.64～3.56(m,1h),1.98(dd,j＝3.6,0.8hz,1h),1.45～1.39(m,1h),1.39～1.29 (m,9h),1.25(td,j＝7.1,0.7hz,11h),1.18～1.11(m,2h),0.93～0.87(m,4h)。
[0117]
2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸质谱结果：
[0118]
ms：c20h17no4：337.15，esi-[m-h]-：336.4。
[0119]
3、半抗原4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠的合成与鉴定
[0120][0121]
具体合成步骤包括：
[0122]
取6-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)己酸乙酯(1mol)，三乙胺(4mol)，以无水二氯甲烷作为溶剂，与氯磺酸(1.5mol)在室温搅拌下反应3～5h，分离纯化得6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基)甲基)苯氧基)己酸乙酯。将6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基)甲基)苯氧基)己酸乙酯溶解于甲醇，6-(4-(吡啶-2-基(4-(磺氧基)苯基)甲基)苯氧基)己酸乙酯与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应 3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得。
[0123]
4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠核磁结果：1h nmr(600mhz,acetone-d6)δ4.06(q,j＝7.1hz,2h),3.32(s,1h), 2.86(s,73h),2.20～2.13(m,1h),2.10(s,9h),2.06～2.02(m,11h),1.97(s,3h),1.88 (s,1h),1.70(s,1h),1.60(s,1h),1.60～1.57(m,2h),1.39(s,4h),1.30(d,j＝4.0hz, 23h),1.21(t,j＝7.1hz,6h),0.98(dd,j＝12.6,7.1hz,4h),0.92～0.83(m,18h), 0.14(s,13h)。
[0124]
4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠质谱结果：ms:c
24
h
25
no
7
s：471.13，esi-[m-h]-:469.9。
[0125]
4、半抗原2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸的合成与鉴
定
[0126][0127][0128]
具体合成步骤包括：
[0129]
将4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯酚充分溶解于dmf，加入碳酸铯(1.2mol)和溴乙酸乙酯(1.3mol)，50～60℃下反应3～5h，反应结束后先除去溶剂dmf，用水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去乙酸乙酯得中间产物2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯。将2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基) 甲基)苯氧基)乙酸乙酯溶解于甲醇，2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯氧基)乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:1，加入1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后用1mol/l盐酸调节ph为6～7，即得2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸。
[0130]
2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸核磁结果： 1h nmr(600mhz,methanol-d4)δ8.56(s,1h),8.46(ddd,j＝5.0,1.9,0.9hz,3h), 7.77(td,j＝7.7,1.9hz,4h),7.46～7.41(m,5h),7.37(dd,j＝8.4,6.8hz,6h), 7.34～7.26(m,6h),7.16(dt,j＝8.0,1.1hz,4h),7.05～7.00(m,9h),6.98～6.92(m, 6h),6.92～6.86(m,6h),6.70(d,j＝8.6hz,2h),5.59(s,3h),5.50(s,1h),5.23(s, 1h),5.08(s,5h),4.37(s,5h),3.89(d,j＝9.0hz,2h),3.66～3.59(m,2h),3.37(s, 2h),2.91(d,j＝7.5hz,1h),2.80(s,1h),2.38(s,1h),2.21(t,j＝7.7hz,2h), 2.19～2.14(m,2h),2.04(s,1h),1.91(s,3h),1.61(s,1h),1.38～1.29(m,8h), 1.24～1.12(m,4h),1.10(s,1h),0.92(t,j＝6.8hz,2h).
[0131]
2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸质谱结果： ms：c
27
h
23
no
4
：425.16，esi-[m-h]-：424.6。
[0132]
实施例2匹可硫酸钠人工抗原的合成和鉴定
[0133]
1、匹可硫酸钠人工抗原的合成
[0134]
匹可硫酸钠人工抗原的合成方法，包括以下步骤：
[0135]
将实施例1中pc1、pc2、pc3、pc4作为半抗原，通过活泼酯法分别偶联乳铁蛋白(lf)和鸡卵清白蛋白(ova)，分别称取1mol上述匹可硫酸钠半抗原，1.4mol nhs和1.6mol edc溶解于50～200μl dmf中，室温下避光搅拌2～4h，得到匹可硫酸钠半抗原活化液；将10mg lf或ova加入到1ml的 pbs缓冲液(0.01mol/l，ph＝7.4)中；将匹可硫酸钠半抗原活化液缓慢逐滴加入lf溶液中，4℃反应12h；用pbs缓冲液透析3天，每天3次，透析结束后即得匹可硫酸钠人工抗原，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
[0136]
其中，pbs缓冲液的配方：na
2
hpo
4
·
12h
2
o 2.90g，nacl 8.50g，kcl 0.20g， kh
2
po
4 0.20g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0137]
其中，最佳组合的两种匹可硫酸钠人工抗原为人工抗原4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸钠-lf(pc1-lf)(合成路线见图1) 和2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸-ova(pc2-ova) (合成路线见图4)(详见实例4)。
[0138]
2、匹可硫酸钠人工抗原的鉴定
[0139]
取上述合成的pc1-lf，进行紫外扫描，结果如图2所示。
[0140]
具体地，lf、pc1、pc1-lf分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现匹可硫酸钠免疫原pc1-lf的吸收曲线与载体蛋白lf明显不同，pc1在240nm和300nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在240nm和300nm处，pc1-lf的吸收峰明显比lf高，且对比pc1 的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与pc1的复合物，偶联成功。
[0141]
取上述合成的pc3-lf，进行紫外扫描，结果如图3所示。
[0142]
具体地，lf、pc3、pc3-lf分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现匹可硫酸钠免疫原pc3-lf的吸收曲线与载体蛋白lf明显不同，pc3在240nm和260nm处各有一个特征峰，而偶联反应后，在240nm和260nm处，pc3-lf的吸收峰明显比lf高，且对比pc3 的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与pc3的复合物，偶联成功。
[0143]
取上述合成的pc2-ova，进行紫外扫描，结果如图5所示。
[0144]
具体地，ova、pc2、pc2-ova分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现匹可硫酸钠包被原pc2-ova 的吸收曲线与载体蛋白ova明显不同，pc2在350nm处有一个特征峰，载体蛋白ova仅在280nm处有特征峰，而偶联反应后，pc2-ova在350nm处有一明显吸收峰，且对比pc2的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与pc2的复合物，偶联成功。
[0145]
取上述合成的pc4-ova，进行紫外扫描，结果如图6所示。
[0146]
具体地，ova、pc4、pc4-ova分别进行紫外(200～350nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现匹可硫酸钠包被原pc4-ova 的吸收曲线与载体蛋白ova明显不同，pc4在210nm处有一个特征峰，载体蛋白ova在240nm和280nm处有特征峰，而偶联反应后，pc4-ova在220nm、 240nm和260nm处均有明显吸收峰，且对比pc4的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与pc4的复合物，偶联成功。
[0147]
实施例3匹可硫酸钠抗体的制备
[0148]
将制备好的免疫原pc1-lf与免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫新西兰大白兔。所述新西兰大白兔体重为2.5～3kg，采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争elisa测定血清效价。当
效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～ 5000rpm离心10min，取上清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
[0149]
实施例4匹可硫酸钠免疫原和包被原组合优化
[0150]
分别将匹可硫酸钠人工抗原：4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基) 甲基)苯基硫酸钠-lf(pc1-lf)，2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基) 苯氧基)乙酸-lf(pc2-lf)，4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯基硫酸盐-lf(pc3-lf)，2-(4-((4-(苄氧基)苯基)(吡啶-2
-ꢀ
基)甲基)苯氧基)乙酸-lf(pc4-lf)进行免疫新西兰大白兔，制得的抗体进行所有结构的包被原筛选，经elisa检测效价和抑制率如表1所示。
[0151]
具体操作步骤如下：
[0152]
(1)将匹可硫酸钠抗体用pbst稀释为1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、 1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，同时设置空白对照孔(用pbst代替)；
[0153]
(2)将匹可硫酸钠人工抗原4-((4-(羧基甲氧基)苯基)(吡啶-2-基) 甲基)苯基硫酸钠-ova(pc1-ova)，2-(4-((4-羟苯基)(吡啶-2-基)甲基) 苯氧基)乙酸-ova(pc2-ova)，4-((4-((5-羧基戊基)氧基)苯基)(吡啶-2-基)甲基)苯基硫酸盐-ova(pc3-ova)，2-(4-((4-(苄氧基)苯基) (吡啶-2-基)甲基)苯氧基)乙酸-ova(pc4-ova)分别用包被液(0.05m碳酸盐缓冲溶液，ph 9.6)稀释至125ng/ml的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用pbst(0.01m pbs，0.06％ tween-20(v/v))洗涤2次；
[0154]
(3)每孔加入120μl封闭液(1％的鱼胶蛋白)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
[0155]
(4)用pbst将1mg/ml匹可硫酸钠稀释1000倍，为1μg/ml；
[0156]
(5)每行加50μl匹可硫酸钠稀释液(三组平行)，再加50μl pbst稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次；
[0157]
(6)加入羊抗兔二抗igg-hrp(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5 次，拍板；
[0158]
(7)加入显色液，在37℃下温浴显色10min；
[0159]
(8)加入50μl 10％h
2
so
4
终止反应，并在450nm处读取od值；
[0160]
实验结果：免疫新西兰大白兔所获得的抗血清的效价抑制率检测结果如表1 所示，不同的匹可硫酸钠人工抗原作为免疫原免疫的兔子产生的抗血清均有一定效价，同时，所得抗血清对目标分析物匹可硫酸钠均有不同程度的抑制效果。其中，编号1的免疫原和包被原结构组合所示的抗血清效价1:32000和抑制率75.0％为最佳组合，在该组合下，匹可硫酸钠抗体不仅能特异性识别目标分析物匹可硫酸钠，而且抗体灵敏度较好。抗血清效价和抑制率均高于编号2、3、4的免疫原和包被原结构组合，虽然编号5和6的免疫原和包被原结构组合所示的抑制率与编号1的免疫原和包被原结构组合所示的抑制率相近，但是这两个组合的抗血清效价远低于编号1组合的抗血清效价，故编号1的免疫原和包被原结构组合为最佳组合。
[0161]
抑制率＝(效价的od值-抑制的od值)/抑制的od值*100％；
[0162]
表1匹可硫酸钠6组免疫原和包被原组合的效价和抑制率数据
[0163]
编号免疫原包被原效价抑制率
1pc1-lfpc2-ova1:3200075％2pc2-lfpc1-ova1:200036.5％3pc1-lfpc4-ova1:800050.5％4pc3-lfpc1-ova1:1600044.5％5pc1-lfpc4-ova1:100070％6pc3-lfpc4-ova1:100060％
[0164]
实施例5匹可硫酸钠抗体的灵敏度及特异性测定
[0165]
1、匹可硫酸钠抗体灵敏度测定
[0166]
匹可硫酸钠抗体灵敏度的测定，通过建立匹可硫酸钠抗体(elisa)标准曲线并求出半数抑制量浓度为ic
50
来表示。
[0167]
标准曲线建立具体步骤包括：
[0168]
(1)将实施例3制备的匹可硫酸钠抗体用pbst稀释为1:8000，同时设置空白对照孔(用pbst代替)；
[0169]
(2)将匹可硫酸钠人工抗原pc2-ova用包被液稀释至250ng/ml的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃恒温水浴箱温育12h，弃去包被液，用pbst(0.01m pbs，0.06％tween-20(v/v))洗涤2次，拍干；
[0170]
(3)每孔加入120μl封闭液(1％的鱼胶蛋白溶液)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
[0171]
(4)用pbst将匹可硫酸钠稀释至100000.00，10000.00，1000.00，100.00， 10.00，0.10，0.01，0ng/ml；
[0172]
(5)每行加50μl匹可硫酸钠稀释液，浓度分别为100000.00，10000.00， 1000.00，100.00，10.00，0.10，0.01ng/ml(三组平行)，浓度为0ng/ml的孔加入50μl/孔pbst稀释液，再加入步骤(1)所述匹可硫酸钠抗体稀释液，每孔加50μl。在37℃下温育40min后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs， 0.06％tween-20(v/v))洗涤5次，拍干；
[0173]
(6)加入羊抗兔二抗igg-hrp(5000倍稀释)，在37℃下温育30min后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs，0.06％tween-20(v/v))洗涤5次，拍干；
[0174]
(7)每孔加100μl显色液，在37℃下温育显色10min；
[0175]
(8)每孔加入50μl终止液(10％h
2
so
4
)终止反应，并用酶标仪在450nm 处读取od值；
[0176]
其中pbst的配方为：na
2
hpo
4
·
12h
2
o 14.50g，nacl 42.50g，kcl 1.00g， kh
2
po
4 1.00g，tween-20 3.0ml，加蒸馏水定容至5000ml。
[0177]
1％的鱼胶蛋白溶液配制：如将0.01g鱼胶蛋白粉溶解于1ml pbst中，具体的按实际用量计算。
[0178]
以od值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(a-d)/[1+(x/c)b]+d，其中，a和d分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(od)，c为中点浓度，当标准品浓度等于c时的od 值为(a+d)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为ic
50
，b表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以ic
10
为检测限，以ic
20
～ic
80
为检测范围。
[0179]
以匹可硫酸钠为标准品建立elisa的标准曲线，最低检测限为0.10ng/ml，半抑制浓度为5ng/ml。结合图7可知，以匹可硫酸钠为标准品建立的标准曲线具备典型的s型曲
线，检测灵敏度好。
[0180]
2、匹可硫酸钠抗体特异性测定
[0181]
通过匹可硫酸钠与其类似物进行交叉反应实验来确定匹可硫酸钠抗体的特异性，用交叉反应率(cr)表示抗体的特异性，交叉反应越小，特异性越好。
[0182]
将匹可硫酸钠及其类似物作为竞争抗原，分别做系列稀释，采用间接竞争 elisa方法测定，步骤参考灵敏度验证的实验方法，得到各类似物的ic
50
值。用以下公式计算匹可硫酸钠和各类似物的交叉反应率(cr)：
[0183][0184]
匹可硫酸钠与其类似物交叉反应实验结果如表1所示，结果发现：匹可硫酸钠抗体对匹可硫酸钠的交叉反应率为100％，ic
50
值为5ng/ml，而对其类似物无反应或其交叉反应率均小于10％；说明匹可硫酸钠抗体对匹可硫酸钠具有极高的特异性，可有效的排除其类似物的干扰，可专门用于匹可硫酸钠的检测。
[0185]
以上结果说明：本发明制备得到的匹可硫酸钠抗体对匹可硫酸钠具有很强的检测特异性。
[0186]
表2匹可硫酸钠与其类似物交叉反应实验结果
[0187]
[0188][0189]
注：nr表示无反应。
[0190]
实施例6匹可硫酸钠酶联免疫试剂盒开发
[0191]
1、酶结合物
[0192]
用辣根过氧化物酶标记实施例3制备的匹可硫酸钠抗体。
[0193]
2、酶标板的制备
[0194]
用包被缓冲液将pc2-ova稀释成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入120μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
[0195]
3、检测匹可硫酸钠的酶联免疫试剂盒的组建
[0196]
组建检测匹可硫酸钠的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
[0197]
(1)包被原pc2-ova处理过的酶标板；
[0198]
(2)匹可硫酸钠标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/l，0.1μg/l，1μg/l，10 μg/l，100μg/l，1000μg/l。
[0199]
(3)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的匹可硫酸钠抗体。
[0200]
(4)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0201]
(5)终止液为10％硫酸；
[0202]
(6)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01
‰
～0.03
‰
叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；
[0203]
4、实际样品检测
[0204]
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按 1:11体积比进行稀释(即1份酶结合物浓缩液加入11份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μl/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应35min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液300μl/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。加入底物液a液50μl/孔，再加入底物液b液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔od值。
[0205]
5、检测结果分析
[0206]
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔) 除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光
度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以匹可硫酸钠标准品浓度(μg/l)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中匹可硫酸钠的实际浓度。
[0207]
由图7可知，匹可硫酸钠抗体的半抑制浓度(ic
50
)为5ng/ml，最低检测限为0.10ng/ml；说明本发明制备得到的匹可硫酸钠抗体能够满足检测要求，且对匹可硫酸钠具有高灵敏度的识别能力，对匹可硫酸钠的检测灵敏度高。
[0208]
6、添加回收实验
[0209]
选酵素食品(包括果冻、糖果、蜜饯和饮料)为加标样本，分别以3种浓度 2、10和20μg/kg加标，设置未加标样品且经验证不含匹可硫酸钠。参照《食品中匹可硫酸钠的测定-bjs 201911》中试样提取方法分别对样品进行前处理。
[0210]
按以下回收率公式计算：回收率＝(加标样品匹可硫酸钠检出浓度-未加标样品匹可硫酸钠检出浓度)/加标浓度
×
100％。
[0211]
表3样本添加回收试验结果
[0212][0213][0214]
实施例7匹可硫酸钠胶体金快速检测方法
[0215]
1、金标抗体和金标结合物垫的制备
[0216]
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回
流条件下，把100ml 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1ml 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。
[0217]
胶体金在与实施例3制备的抗体标记前以0.2mol的k
2
co
3
溶液调到ph为 8.2左右，采用经典nacl滴定法确定30μg抗体标记1ml胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％bsa(使最终bsa浓度为 1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。加入胶体金溶液同体积的5％bsa溶液重悬，4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5 胶体金溶液体积的tb溶液(含3％bsa、3％蔗糖、0.01mol/l硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，4℃保存。用xyz-3000三维喷膜仪把4％的bsa溶液以8μl/cm 的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以6μl/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
[0218]
2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜
[0219]
用xyz-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/ml的包被抗原以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用xyz-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/l 的羊抗兔igg以1.2μl/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔 8mm。
[0220]
3、快速试纸条的组装
[0221]
如图8所示，把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条。
[0222]
4、检测样品液的制备
[0223]
1)固体样品
[0224]
称取1g(精确到0.001g)试样于50ml离心管中，加入10ml水，80℃水浴 10min，8000r/min离心5min，收集提取液，加入20ml水洗涤残渣，涡旋30s， 8000r/min离心5min，合并两次提取液，若提取液浑浊，可取适量8000r/min离心5min，取上清液待测。
[0225]
2)液体样品
[0226]
称取1g(精确到0.001g)试样于50ml离心管中，准确加入5ml水，80℃ 水浴10min，放冷后8000r/min离心5min，取上清液待测。
[0227]
5、快速检测试纸条检测及判断
[0228]
快速检测试纸条的结果判定如图9所示。具体的检测与判断方法如下：当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形对照线6(羊抗兔igg)结合，使隐形对照线6显红色。隐形对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效。
[0229]
6、检出限的测定
[0230]
匹可硫酸钠胶体金免疫层析试纸条对不同样品的检出限如表4所示。往空白固
体、液体样品中添加一系列浓度的标准药物，经样品前处理，用上述胶体金试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。
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表4匹可硫酸钠胶体金免疫层析试纸条对不同样品的检出限
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名称固体样品检出限(μg/g)液体样品检出限(μg/g)匹可硫酸钠0.050.2

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