一种禽畜粪便发酵菌剂的筛选方法与流程

[0001]
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种禽畜粪便发酵菌剂的筛选方法。


背景技术：

[0002]
我国是禽畜养殖大国，也是世界上禽畜粪便产出量最大的国家，且以猪粪、牛粪和鸡粪为主。随着人民生活水平的提高，人民对猪肉及其肉制品需求量不断提高，因此养殖规模也在不断扩大，同时导致猪粪的产量也随之增大。但是在目前规模化的养猪场大部分都没有配套相对应的粪污处理设施，再加上禽畜粪便处理不当会造成严重的环境污染问题。
[0003]
目前，使用的禽畜粪便处理方法有化学处理法、物理处理法与微生物发酵法等。化学处理法虽然对猪粪的除臭与分解效率高，但设备运行及维护成本高昂，养殖户难以承受；物理处理法则存在前期投入成本巨大、处理效率较低、易造成二次污染等缺点。
[0004]
而现阶段生物发酵法的发酵床菌剂主要采用以日本洛东为代表的进口菌剂产品，运行成本高，养殖户难以承担；而目前国内自主培育的菌剂商品化程度不高，且普遍表现出除臭不彻底、猪粪腐熟缓慢等缺点，从而导致发酵床的处理容量低、处理周期长、难以实现零污染排放。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决上述现有技术存在的问题，提供了一种猪粪发酵烟曲霉的筛选与应用，选取丽水市白云山落叶覆盖富含腐殖质的土壤表面区域，经菌种筛选和酶化测定，以烟曲霉菌菌株为原料制发酵菌剂，解决了本土菌剂产品所遇的上述问题。
[0006]
本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种禽畜粪便发酵菌剂的筛选方法，其主要包括菌种获得和菌种筛选，
[0007]
其菌种获得的步骤如下：
[0008]
步骤1、选取落叶覆盖富含腐殖质的土壤表面区域，拨开落叶表面，在其区域内挖深度25-35cm，长度55-65cm，宽度25-35cm的小坑，装入塑料盆，再将新鲜猪粪倾倒入塑料盆中，坑口用塑料薄膜密封，在塑料薄膜处撒上枯枝或落叶，富集6-8天，形成猪粪混合液；
[0009]
步骤2、步骤1后，称取8-12g猪粪混合液加入85-95ml无菌水，振荡25-35min，得到猪粪悬液；
[0010]
步骤3、步骤2后，对振荡均匀后的猪粪悬液进行不同梯度稀释，得到不同梯度稀释的猪粪溶液；
[0011]
步骤4、步骤3后，吸取各个稀释浓度的猪粪溶液200μl分别涂布在高氏一号固体培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和沙氏琼脂培养基上，置于25-30℃的恒温培养箱中培养60-72h，最后选择形态不同且长势优良的菌落进行分离纯化形成单菌落。
[0012]
其菌种筛选的步骤如下：
[0013]
步骤1、将菌种获得中的步骤4分离得到的单菌落接种到氨选择培养基琼脂平板或摇瓶内，利用氨气的菌株均会长菌或浑浊，与不长菌、空白组存在明显的差异，挑选出能够
利用氨水作为唯一氮源生长的菌株；
[0014]
步骤2、将步骤1中筛选出的菌株以10％的接种量接种后放置在20-30℃环境中，以150r/min摇床培养6-8天，培养完成后根据氨氮的降解率公式计算氨氮降解率；
[0015]
步骤3、将菌落获得中的步骤4分离得到的单菌落按5％的接种量接种于猪粪混合液中分离菌株，将得到的菌株放入摇床培养，摇床温度设置为25-35℃，转速110-130r/min，菌种对猪粪进行分解14-16天后根据气味恶臭程度评定等级；
[0016]
步骤4、筛选出步骤2和步骤3中效果均较好的相同菌株；
[0017]
步骤5、将步骤4中得到的相同菌株接种入装有400g新鲜猪粪的大烧杯中，再在猪粪表面放入一只装有20ml的吸收液，用于吸收释放nh
3
，用保鲜膜将杯口密封，置于50℃恒温培养箱中培养，释放量按照凯氏滴定法进行测定；
[0018]
步骤6、步骤5中恒温箱培养后，累积测定2-3周，比较出累积释放量最小的菌株，将这种菌株作为发酵菌剂的原料。
[0019]
为了进一步完善，所述菌种获得步骤3中的不同梯度稀释为10-2
、10-3
、10-4
、10-5
和10-6
中的任意一种或多种。
[0020]
进一步完善，所述菌种获得步骤4中的高氏一号固体培养基的主要成分是可溶性淀粉20g、nacl 0.5g、kno31g、k2hpo4
·
3h2o 0.5g、mgso4
·
7h2o 0.5g、feso4
·
7h2o 0.01g、琼脂20g、纯化水1l。
[0021]
进一步完善，所述菌种获得步骤4中的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的主要成分是葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物和动物组织的胃酶消化物等量混合10g、氯霉素0.1g、琼脂15g、纯化水1l。
[0022]
进一步完善，所述菌种获得步骤4中的沙氏琼脂培养基的主要成分是牛肉膏3g、蛋白胨10g、nacl5g、琼脂20g、纯化水1l。
[0023]
进一步完善，所述降解率公式为氨氮降解率(％)＝(初始氨氮浓度﹣残余氨氮浓度)
÷
初始氨氮浓度
×
100％。
[0024]
进一步完善，所述菌种筛选步骤3中的猪粪混合液的制作方法为取新鲜猪粪若干，调节水分为55-65％，混匀后进行过滤，选取若干锥形瓶，每个锥形瓶中装入150ml的猪粪溶液密封保存。
[0025]
进一步完善，所述气味恶臭程度评定等级为无臭味-ms0、勉强感到臭味-ms1、微弱的臭味-ms2、明显的臭味-ms3、很强的臭味-ms4、难以忍受的臭味-ms5中的任意一种。
[0026]
进一步完善，所述菌种筛选步骤5中的吸收液为质量浓度为2％的硼酸溶液。
[0027]
进一步完善，将菌种筛选步骤6中筛选出的菌株进行酶活测定，其步骤如下：
[0028]
(1)酶活测定中蛋白酶活力采用紫外分光光度法测定，分别配置酸性、中性和碱性缓冲液，测定酸性、中性和碱性蛋白酶的活力。
[0029]
(2)酶活测定中a-淀粉酶活力采用分光光度法测定，其酶活通过查阅工业酶制剂通用试验方法(qb/t1803-1993)中关于吸光度与测试a-淀粉酶酶活的对照表得到。
[0030]
(3)酶活测定中糖化酶活力采用硫代硫酸钠标准溶液滴定法测定。
[0031]
(4)酶活测定中脂肪酶活力采用酸碱滴定法进行测定。
[0032]
(5)酶活测定中纤维素酶活力按照dns法测定。
[0033]
(6)利用通用引物扩增出菌株16s rdna片段，测序后与ncbi数据库中已有序列进
行blast同源检索，从而在分子水平上对菌株进行种属鉴定。
[0034]
进一步完善，经分子鉴定结果显示，所述菌种筛选步骤6中的菌株为烟曲霉菌。
[0035]
本发明有益的效果是：本发明选取丽水市白云山森林公园落叶覆盖含有腐殖质的土壤表面区域，用这部分土壤进行微生物培养，经过不同菌种对氨氮降解率和除臭效果对比性试验，得到一种对两个试验结果均较好的菌落，经过提取培养分子水平的鉴定结果显示为烟曲霉菌，这种霉菌能用于发酵保留生物作用中具有的高效、清洁、安全、维护方便及运行成本低廉等优点的同时，也较目前国内自主培育的菌剂的商品化程度不高，且普遍表现出除臭不彻底、猪粪腐熟缓慢等缺点，有较好的表现，本发明培养了一种具有良好反应前景的本土菌剂产品。
附图说明
[0036]
图1富集筛选获得的13株菌株(细菌x)的氨氮降解率柱形图；
[0037]
图2为富集筛选获得的18株菌株(真菌z)的氨氮降解率柱形图；
[0038]
图3为富集筛选获得的18株菌株(放线菌f)的氨氮降解率柱形图；
[0039]
图4为通过氨氮降解率选取的7株菌株的氨气累积释放量柱形图；
[0040]
图5为z10菌株21天氨气累积释放量折线图；
[0041]
图6为z10菌株21天硫化氢累积释放量折线图；
[0042]
图7为种子发芽率和发芽指数柱形图；
[0043]
图8为种子发芽图；
[0044]
图9为z10菌株生化鉴定图；
[0045]
图10为富集区域示意图；
[0046]
图11为产品对比腐熟温度。
具体实施方式
[0047]
下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0048]
参照附图：
[0049]
现结合具体实施方式和实施例说明本发明，但发明不限于以下内容。
[0050]
实施例1
[0051]
菌株nh3降解分离
[0052]
(1)样品：丽水市白云山富集了7天的猪粪所分离出的菌株。
[0053]
(2)培养基成分：蔗糖50.0g、氨水10.0ml、磷酸二氢钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.1g、1％硫酸锌5.0ml、氯化钠2.0g、纯化水1l。
[0054]
(3)初步筛选：将分离出的单菌落接种到氨选择培养基琼脂平板或摇瓶内，利用氨气的菌种均会长菌或浑浊，与不长菌、空白组存在明显的差异，初步挑选出能够利用氨水作为唯一氮源生长的菌株。具体结果见表1。
[0055]
表1不同菌株对氨气的利用情况
[0056][0057]
注：采用以氨气为唯一氮源的培养基进行培养，从而初步筛选出能以氨气作为氮源的菌种，能利用氨气的菌种均会在初筛培养基种长菌或浑浊(生长情况用“+”表示)，与不长菌、空白组(生长情况用
“-”
表示)存在明显的差异。
[0058]
表1中可得能以氨气作为氮源的除臭菌株共43株，其中真菌18株，细菌13株，放线菌18株。其中真菌、细菌、放线菌这三种菌种的分离效率分别为27.2％、19.7％、27.2％。
[0059]
(4)菌株精确筛选
[0060]
筛选出的菌株以10％的接种量接种后放置在30℃下150r/min摇床培养7d，之后按下面的公式计算氨氮的降解率：氨氮降解率(％)＝(初始氨氮浓度﹣残余氨氮浓度)
÷
初始氨氮浓度
×
100％。具体结果见图1、图2、图3。
[0061]
利用氨选择培养基共筛选到菌株49株，其中细菌(x)13株、真菌(z)18株、放线菌(f)18株。49株菌对培养基中的氨氮表现出不同程度的降解能力，氨氮降解率33.8％-74.1％，如图1、图2、图3所示。其中x5、x12、z6、z13、z23、f6与f18共7株菌的氨氮降解率均超过了70％，分别为72.0％、74.1％、70.9％、72.4％、71.2％、70.7％和74.0％。由于氨选择培养基以氨水作为唯一氮源，因此上述7株菌理论上具有消化氨氮、减少猪粪发酵过程中nh3释放的功能。
[0062]
实施例2
[0063]
嗅辨法筛选
[0064]
(1)样品：丽水市白云山富集了7天的猪粪所分离出的菌株。
[0065]
(2)猪粪溶液：取新鲜猪粪若干，调节水分约60％，混匀后进行过滤，在每个锥形瓶中装入150ml的猪粪溶液并进行密封。
[0066]
(3)筛选：按5％的接种量接种分离菌株，自然发酵对照组不接种菌，放入摇床培养。把摇床温度设为30℃，转速120r/min。让菌种对猪粪进行分解，15d过后根据气体恶臭程度评定等级。具体结果见表2。
[0067]
表2嗅辨法筛选
[0068]
编号等级编号等级编号等级编号等级编号等级编号等级x12x122z23z131z243f83x24x132z33z143z253f92x32x144z42z153z264f103
x42x153z54z164z274f113x52x164z62z173f13f122x63x172z74z182f22f134x72x183z82z194f34f143x82x194z92z204f42f152x93x203z103z212f55f163x102x213z113z224f62f174x114z13z122z232f74f182
[0069]
注：臭味等级为0、1、2的菌株视为有效菌株。
[0070]
表2可知在66个菌中共可得出共有23株菌视为有效菌，占所有菌株的34.8％。
[0071]
根据实施例1和实施例2共筛选出菌株7株，分别是：x5、x12、z6、z13、z23、f6与f18。
[0072]
实施例3
[0073]
7株高效氨氮降解菌的评价
[0074]
(1)样品：通过菌株nh3降解分离筛选和嗅辨法筛选得到的7株菌株。
[0075]
(2)硼酸吸收液：称取10g硼酸溶于蒸馏水中，定容至500ml。
[0076]
(3)指示剂：0.10g甲基红及0.05g亚甲基蓝溶于150ml的95％乙醇溶液中。
[0077]
(4)滴定液：2.7ml98％浓硫酸用蒸馏水稀释至1升。
[0078]
(5)将7株菌分别接种至装有400g新鲜猪粪的大烧杯中，猪粪表面放入一只装有20ml浓度为2％的硼酸吸收液的小烧杯，用于吸收释放的nh3，用保鲜膜将杯口密封，置于50℃恒温培养箱培养。测定2周的氨气累积释放量。具体结果见表3和图4。
[0079]
表37株菌15d氨气累积释放量
[0080][0081]
表3的数据可以看出在15天的猪粪发酵堆肥过程中，z13菌株氨气释放量最低，与空白对照相比减少了54.6％。
[0082]
实施例4
[0083]
z13菌株除臭效果评价
[0084]
(1)样品：z13菌株
[0085]
(2)氨气测定试剂
[0086]
1)硼酸吸收液：称取10g硼酸溶于蒸馏水中，定容至500ml。
[0087]
2)指示剂：0.10g甲基红及0.05g亚甲基蓝溶于150ml的95％乙醇溶液中。
[0088]
3)滴定液：2.7ml98％浓硫酸用蒸馏水稀释至1升。
[0089]
(3)硫化氢测定试剂
[0090]
1)储备液：50ml浓硫酸(98％)加30ml蒸馏水，冷却，加6g对氨基二甲基苯胺盐酸盐
[0091]
2)fecl3溶液：100gfecl3溶于100ml蒸馏水，若有沉淀需过滤。
[0092]
3)使用液：2.5ml储备液加50％的硫酸稀释至100ml。
[0093]
4)混合显色剂：按1ml的使用液和1滴(0.04ml)fecl3溶液的比例相混溶。
[0094]
(4)评价方法：将筛选到的菌株接入装有400g新鲜猪粪的大烧杯中，猪粪表面放入一只装有20ml浓度为2％的硼酸吸收液的小烧杯，用于吸收释放的nh3，用保鲜膜将杯口密封，置于50℃恒温培养箱培养，nh3释放量按照凯氏滴定法进行测定，测定结果见表4和图5。h2s释放量的测定过程与nh3释放量测定大致相同，不同之处为小烧杯中加入20ml锌胺络盐溶液，用于吸收释放的h2s，h2s的释放量按照锌胺络盐吸收比色法测定，测定结果见表5和图6。对照组在猪粪中不接种任何菌，其nh3与h2s释放量的测定方法同上。
[0095]
表4z13氨气21天累积释放量(单位：mg/kg)
[0096]
组别3d6d9d12d15d18d21dz1317.2022.6031.9040.7049.6063.1080.71对照18.8042.3063.3079.2095.30112.30131.57
[0097]
表5z13硫化氢21天累积释放量(单位：mg/kg)
[0098]
组别3d6d9d12d15d18d21dz130.460.581.121.321.481.842.22对照2.213.123.333.463.794.074.45
[0099]
在为期21天的发酵过程中，每一个测定点上对照组所释放的nh3与h2s均高于z10组，对照组最终释放的nh3与h2s分别为131.57mg/kg与4.45mg/kg，而z13最终释放的nh3与h2s则为80.71mg/kg与2.22mg/kg，分别减少了38.66％与50.03％。
[0100]
实施例5
[0101]
种子萌发实验
[0102]
(1)样品：z13菌株
[0103]
(2)内容：称取10g接菌发酵后的猪粪加90ml蒸馏水混合搅拌，放于200r/min的摇床震荡30min，经纱布过滤后，以3000r/min的转速离心10min，量取15ml上清液倒入装有滤纸的培养皿中，均匀放入20粒花菜种子。不接菌的猪粪发酵组作为阴性对照，阳性对照则在滤纸上直接滴加15ml蒸馏水。三组样品置于室温暗光处培养2d后，测定种子发芽率和根长，并计算种子发芽指数gi，具体结果见表6和图7。
[0104]
(3)gi计算公式如下：gi(％)＝(处理平均发芽率
×
处理平均根长)/(对照平均发芽率
×
对照平均根长)
×
100％。
[0105]
表6种子发芽指数
[0106][0107][0108]
种子发芽率和发芽指数是目前评价猪粪腐熟程度及植物毒性的最可靠的指标。从表5可知，阴性对照组发芽率与发芽指数分别为13.33％与3.54％，说明在不接菌的发酵情
况下，21天的发酵周期远远达不到腐熟、无害化的要求，植物毒性较大，因而对种子发芽率有较大的抑制，同时表现为发芽的根长短；z13组发芽率与发芽指数则达到了83.33％与84.89％，由于发芽率超过50％可认为猪粪对种子基本无毒害，可见z13菌的接入对于促进猪粪腐熟及无害化起到了显著的作用。z13组较高的发芽指数则进一步证明猪粪中的有机质已转化为能为种子吸收利用的营养物质，从而有效促进了芽的生长。
[0109]
实施例6
[0110]
z13生化鉴定
[0111]
为了进一步揭示z13菌株降解猪粪的生化机理，分别测定了其蛋白酶、淀粉酶、糖化酶以及纤维素酶的活力，测定结果如表7和图9所示
[0112]
表7z13菌株生化鉴定
[0113][0114]
实施例7
[0115]
16s rdna分子鉴定
[0116]
通过blast搜索，将z13菌株与ncbi数据中收录的同源性较高的菌株进行同源性比对，同源菌株名称及genbank注册号见表8。
[0117]
表8同源菌株genbank注册号
[0118][0119][0120]
分子鉴定结果显示，z13菌株为烟曲霉菌(aspergillus fumigatus)。
[0121]
实施例8
[0122]
产品对比
[0123]
猪粪粪来自浙江省丽水市莲都区某家庭农场，使用前晾晒1d。某产品lb菌粉具有催化腐熟功能。现将猪粪进行堆肥，堆肥采用圆垛堆体，将其堆成圆垛状，每个堆体初始质量为500kg，共三堆：堆体1加入lb菌剂，堆体2中加入lb菌剂和烟曲霉菌剂，堆体3加lb菌剂，
菌剂接种量为堆体的15％，使其充分混匀。用数显温度计原位测量堆体不同位置的温度，堆肥期间每天10:00、14:00、18:00记录堆体温度，其平均值作为当天的堆体温度，同时记录环境温度(每3天一测)，结果见图11。取适量堆肥样品用蒸馏水浸提后振荡4h，取10.00ml上清液于培养皿中，放入滤纸，然后均匀放入30粒花菜种子于室温黑暗条件下培养48h，测量种子发芽指数gi，并用蒸馏水作对照，结果见表9。
[0124]
表9产品对比发芽指数
[0125]
组别种子发芽指数/％堆体173堆体279堆体384
[0126]
在堆肥过程中，微生物分解堆体中的有机物释放热量，堆体3在第9d达到72℃，并且在55℃以上维持了15d。一般认为当gi值达到80％～85％时表明堆体已经腐熟，堆肥结束后，堆体1种子发芽指数为73％，堆体二发芽指数为79％，堆体3发芽指数为84％，表明该堆肥产品已经完全腐熟。
[0127]
虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了图示和描述，但是，本专业普通技术人员应当了解，在权利要求书的范围内，可作形式和细节上的各种各样变化。

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