一种抗白细胞介素17A的单克隆抗体、其编码基因及应用的制作方法

一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体、其编码基因及应用
技术领域
[0001]
本发明属于医学领域，具体地，涉及一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体、其编码基因及应用。


背景技术：

[0002]
白细胞介素17(interleukin 17，il-17)是已发现的30余种白细胞介素之一，迄今为止，il-17家族已发现il-17a(il-17)、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e(il-25)、il-17f六个成员。这些il-17细胞因子可以结合到相应受体上介导不同的炎症反应。
[0003]
il-17a单链由23个氨基酸组成的信号肽(aa)及132个氨基酸链区域构成，成熟的il-17a一般以同源二聚体形式分泌与存在，有时也与il-17f连接形成异源二聚体il-17af。
[0004]
il-17a主要由一类激活的称之为辅助性t细胞17(th17)的cd
4+
t细胞产生并通过结合il-17ra和il-17rc的复合物而发挥作用。il-17a也可以由其它免疫细胞如γδt细胞、淋巴组织诱导样细胞(lymphoid tissue inducer cells)、ilcs(innate lymphoid cells)和自然杀伤t细胞合成分泌，另外一些非免疫细胞，比如肠道潘氏细胞和肠上皮细胞也可以在应激情况下产生il-17a。由于th17细胞在体内的分布最广，而且在炎症反应中有广泛作用，通常认为th17细胞是il-17a的主要来源。
[0005]
il-17的分泌失调引起诸多炎症疾病。如il-17a作用于巨噬细胞、dc细胞，诱发il-1、il-6、tnf、crp的高表达，导致炎症反应，参与银肩病和移植排斥的病理过程；il-17a作用于成纤维细胞，诱发il-6、趋化因子、生长因子、mmp的高表达，导致基质破坏，参与多发性硬化症、克罗恩病的病理过程；il-17a作用于内皮细胞，诱发il-6、mmp、凝血因子的高表达，导致血管活化，参与血栓和动脉粥样硬化的病理过程；il-17a作用于成骨细胞和软骨细胞，诱导rankl、mmp、破骨细胞生成、导致骨侵蚀、软骨损伤，参与风湿性关节炎、牙周病的病理过程。
[0006]
靶向il-17a的抗体通过抑制il-17a-il-17ra/c信号通路，能有效地缓解自身免疫性疾病的症状。il-17a相关抗体药物已经被批准上市，分别是诺华公司开发的secukinumab以及eli lilly开发ixekizumab，获批的适应症包括中度至重度斑块型银屑病和强直性脊柱炎。开发结构不同、疗效更优、适应症更广等不同特性的抗il-17抗体，治疗银屑病、类风湿性关节、多发性硬化症等自身免疫相关病症以及il-17相关的其它疾病具有迫切的需求和重要的意义。


技术实现要素：

[0007]
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种全人源抗il-17a单克隆抗体、其编码基因、制备方法及其应用。
[0008]
抗体包含四条肽链的免疫球蛋白分子，两条重(h)链(全长时约50-70kda)和两条轻(l)链(全长时约25kda)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区组成。每一条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区组成。vh和vl区可被进一步细分为具
有高可变性的互补决定区(cdr)和其间隔以更保守的称为框架区(fr)的区域。每一个vh或vl区由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的互补决定区(cdr1、cdr2、cdr3)决定，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。
[0009]
本发明一方面提供一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体vh链，其可变区序列包括选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第1-127位；seq id no:12中第1-124位；seq id no:14中第1-122位。
[0010]
在本发明的一些实施方案中，所述
[0011]
本发明第二方面提供一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体vl链，其可变区序列包括选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第143-250位；seq id no:12中第140-245位；seq id no:14中第138-243位。
[0012]
本发明第三方面提供一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体，其vh链可变区序列包括选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第1-127位；seq id no:12中第1-124位；seq id no:14中第1-122位。
[0013]
本发明第四方面提供一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体，其vl链可变区序列包括选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第143-250位；seq id no:12中第140-245位；seq id no:14中第138-243位。
[0014]
本发明第五方面提供一种抗白细胞介素17a的单克隆抗体，其包括选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第1-127位；seq id no:12中第1-124位；seq id no:14中第1-122位，和选自以下组的氨基酸序列：seq id no:10中第143-250位；seq id no:12中第140-245位；seq id no:14中第138-243位。
[0015]
在本发明中，所述的单克隆抗体的fc区为人igg的恒定区。
[0016]
本发明第六方面提供一种编码抗白细胞介素17a的单克隆抗体vh链的基因，其包括选自组的核苷酸序列：seq id no:9中第1-381位；seq id no:11中第1-372位；seq id no:13中第1-366位。
[0017]
本发明第七方面提供一种编码抗白细胞介素17a的单克隆抗体vl链的基因，其包括选自组的核苷酸序列：seq id no:9中第427-750位；seq id no:11中第418-735位；seq id no:13中第412-729位。
[0018]
本发明第八方面提供一种编码抗白细胞介素17a的单克隆抗体的基因，编码vh链的序列包括选自组的核苷酸序列：seq id no:9中第1-381位；seq id no:11中第1-372位；seq id no:13中第1-366位；编码vl链的序列包括选自组的核苷酸序列：seq id no:9中第427-750位；seq id no:11中第418-735位；seq id no:13中第412-729位。
[0019]
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的dna分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
[0020]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将
其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0021]
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。
[0022]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0023]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：ch0-s、ch0-kl、hek-293细胞。
[0024]
本发明中所述的用重组dna转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
[0025]
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析等技术及这些方法的结合。
[0026]
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))来测定。
[0027]
本发明第九方面提供本发明第一方面所述的单克隆抗体vh链或本发明第二方面所述的单克隆抗体vl链或本发明第三到五任一方面所述的单克隆抗体在制备用于治疗il-17a相关的疾病的药物中的应用。
[0028]
本发明第十方面提供一种治疗il-17a相关的疾病的药物组合物，其包括本发明第一方面所述的单克隆抗体vh链或本发明第二方面所述的单克隆抗体vl链或本发明第三到五任一方面所述的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。
[0029]
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或局部给药。
[0030]
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0031]
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途
径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0032]
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括其他治疗剂。
[0033]
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因治疗剂可以是其他抗人白介素17a抗体
[0034]
在本发明中，所述所述il-17a相关的疾病包括炎症疾病、自身免疫疾病等，包括但不限于银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症，炎性肠病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎等)、骨关节炎、类风湿性关节炎、风湿性关节炎或骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)以及哮喘(包括变应性哮喘)。
[0035]
本发明的有益效果
[0036]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0037]
本发明的il-17a单克隆抗体能够高特异性地结合il-17a抗原，具有很高的亲和力及很低的免疫原性，具有良好的抑制il-17a诱导的各种细胞系分泌的炎性细胞因子如il-6等的效果，可应用治疗免疫介导的各种自身免疫性和炎性疾病，诸如银屑病、类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(sle)、狼疮性肾炎、感染性肉芽肿、囊性纤维化或癌症。
[0038]
本发明基于噬菌体抗体库技术克隆和表达抗il-17a抗体，经过筛选获得的抗体是全人源的，大大降低或者基本消除抗体的免疫原性。直接从人外周血淋巴细胞中扩增抗体基因的方法，是解决杂交瘤技术等一直无法解决的人源性抗体来源问题的根本途径，比之从杂交瘤等获取抗体基因，本发明的全人源和嵌合抗体制备程序先进简便、价格低廉。
附图说明
[0039]
图1示出了抗il-17a抗体3a9对咪喹莫特诱导的小鼠银肩病的治疗效果。
具体实施方式
[0040]
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0041]
实施例
[0042]
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
[0043]
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
[0044]
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
[0045]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0046]
实施例1人源性单链抗体(scfv)基因库的构建
[0047]
(1)cdna的制备收集1000人的外周血各5ml，混合，用淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)分离单核细胞。用invitrogen公司的试剂盒，从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总mrna。用gibco公司的mrna纯化试剂盒纯化，以上述获得的mrna为模板，反转录出cdna第一链。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
[0048]
(2)pcr扩增
[0049]
根据多种人抗体基因家族序列中v区fr1和fr4较保守的区段序列，设计并合成以下人抗体vh基因(hvh)、vl基因(hvl)、5端(r)、3端(f)引物。其中为了进一步加强引物对人抗体v区基因扩增的通用性，在各引物序列中引入了多处简并位点(多义位点)。根据所用载体pcantab5e(一种噬粒，pharmacia公司产品)加入了适当的限制酶切位点序列。
[0050]
引物序列如下：
[0051]
hvh-r(含sfii位点)：
[0052]
5'-ctgcggcccagccggccatggcccaggtgcagytrndgsagtcdgs-3'(seqid no:1)
[0053]
hvh-f：
[0054]
5'-tgaggagacggtgaccrkkgtbcc-3'(seq id no:2)
[0055]
hvl-r：
[0056]
5'-gamatyswgmtsacbcagtctcc-3'(seq id no:3)
[0057]
hvl-f(含not i位点)：
[0058]
5'-ctatggccgcacgtttgatytccasyykkgtccc-3'(seqid no:4)
[0059]
其中，引物序列中的多义位点代号，系根据国际生物化学学会(iub)命名委员会(nc)公布的标准方案所编。引物均委托上海生工公司进行合成。
[0060]
pcr反应：以步骤(1)获得的转录cdna产物为模板，分别以vh引物对或vl引物对进行pcr扩增。在100μl总反应体积中加入4u taq酶(购自华美公司)，条件为：95℃60s，53℃70s，72℃80s，共32个循环，末次72℃延伸10min。
[0061]
(3)pcr产物的回收及纯化
[0062]
按照上述条件进行pcr后，将产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳进行鉴定，发现有分子量分别在310bp左右和300bp左右的两条条带，用promega公司的胶回收试剂盒回收片段，操作按照厂家的说明书进行。
[0063]
(4)人源性单链抗体(scfv)基因的构建
[0064]
以(gly4ser)3为接头序列ggggsggggsggggs(seq id no:5)分别连接vh和vl构成重链-接头序列-轻链结构的scfv基因。接头引物根据接头序列模板及人抗体v区基因序列3端、5端部分序列设计并合成：
[0065]
接头模板dna序列：
[0066]
5'-ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg-3'(seqid no:6)
[0067]
用于scfv接头反向vh序列：
[0068]
5'-gva cmm ygg tca ccg tct cct cag gtggag gc gtt cag g-3'(seqid no:7)
[0069]
用于scfv接头反向vl序列：
[0070]
5'-gga gac tgv gts akc wsr atk tcc gat ccg cca ccg cca gag-3'(seq idno:8)
[0071]
其中，引物序列中多义位点代号执行iub所属nc公布的国际标准，均委托上海生工公司进行合成。
[0072]
以上述接头模板和引物进行pcr扩增及回收、纯化(pcr条件及回收、纯化方法均同上)。分离获得长度约为100bp的接头序列。
[0073]
scfv片段克隆进入噬菌粒载体按照上述条件进行pcr后，获得两端带有sfii和noti酶切位点的scfv片段，进行离心柱(spun-column)层析纯化，去除不必要的接头引物和dntp。将纯化完毕的scfv片段用sfii和noti(均购自promega公司)进行双酶切，产生可与载体pcantab5e(pharmacia公司)相连接的粘性末端。再一次进行离心柱层析纯化，去除可能影响其与载体连接的小的sfii或noti片段。
[0074]
噬菌粒载体pcantab5e(pharmacia公司)本身包含有sfii和noti酶切粘性末端，可与上述scfv片段相连接。采用常规的dna连接酶，将scfv片段克隆进入噬菌粒载体上相应的位点。在pcantab5e载体上其相邻位置是g3p基因，将来可表达scfv-g3p融合基因。
[0075]
实施例2
[0076]
淘选抗体库对于实施例1得到的噬菌体展示文库中的抗体，通过淘选技术选择亲和力高的抗体。
[0077]
用humanzyme购买的天然人il-17a蛋白作为抗原包被酶联板，bsa封闭，温育2h，洗板后加50μl噬菌体抗体库(约1012cfu)温育2h，tbst(tris50mmol/l，nacl 150mmol/l，tween-20 0.5％，bsa 1％，ph7.5)液洗1次(第2轮洗5次，第3轮后洗10次，每次5min)，以50μl洗脱液回收噬菌体，中和缓冲液调节ph至中性，感染ecoli tgl，进行下一轮筛选。共进行3轮筛选，移走没有抗原结合能力的噬菌粒。
[0078]
进行夹心elisa实验，测定抗体的抗原结合活性。加入50μl 200ng/ml的天然人il-17a抗原包被酶联板，bsa封闭，37℃温育1h，加入用pbst(kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po41.8mol/l，nacl 137mmol/l，tween-20 0.5％，ph7.4)对倍稀释的噬菌体抗体，37℃孵育2h。洗板，加入hrp标记的羊抗m13单抗(购自pharmacia公司)，37℃1h。用1％tween-20的pbs洗板，加底物液显色，在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据计算阳性率接近20％，确定其中亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。
[0079]
将上述挑选出2个亲和力最强的克隆感染e.coli hb2151细胞(pharmacia公司)，平板培养，从转化板上挑取单个菌落，用2
×
ytag(含100mg/l氨苄青霉素和2％葡萄糖的2
×
yt培养液)于30培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒dna，pcr扩增出scfv基因片段，并克隆入puc19载体，进行序列测定，包括预期的vh，vl基因和接头序列。vh基因序列处于接头的上游，vl基因序列处于接头的下游。结果如下:
[0080]
克隆1-k4e9：
[0081]
gaggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcgactactggatgcactgggtgaggcaggcccccggcaagggcctggagtgggtgagcagcatcaaccaggacggcagcgagaaggactacgtgggcagggtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgagggtggaggacaccgccgtgtactactgcgtgagggactactacgacatcctgaccgactactacatccactactggtacttcgacctgtggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggagatcgtgctgacccagagccccggcaccctgagcctgagccccggcgagagggccaccctgagctgcagggccagccagagcgtgagcagcagcta
cctggcctggtaccagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacggcgccagcagcagggccaccggcatccccgacaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcaggctggagcccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtacggcagcagcccctgcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaag(seq id no:9)
[0082]
其中，重链可变区为seq id no:9中第1-381位，轻链可变区为427-750位。
[0083]
从上述dna序列中推导出的氨基酸序列为：
[0084]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdywmhwvrqapgkglewvssinqdgsekdyvgrvkgrftisrdnsknslylqmnslrvedtavyycvrdyydiltdyyihywyfdlwgqgtlvtvssggggsggggsggggseivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspctfgqgtrleik(seqid no:10)
[0085]
其中，重链可变区的氨基酸序列为seq id no:10第1-127位，轻链可变区为143-250位，下划线部分为接头序列。
[0086]
克隆2-c9h3：
[0087]
caggtgcagctggtggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcgacggctggatgcactgggtgaggcaggcccccggcaagggcctggagtgggtgagcagcatcaaccaggacggcagcgagaagtactacaaccagagggtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaacagcctgagggtggaggacaccgccgtgtactactgcgtgagggactactacgactacttcaccgactaccactactggtacttcgacctgtggggccagggcaccctggtgaccgtgagcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcctgctgacccagagccccgccatcctgagcgtgagccccggcgagagggccaccctgagctgcagggccagccagagcgtgagcagcagctacctggcctggtaccagcagaagcccctgagccccaggctgctgatctacggcgccagcagcagggccaccggcatccccgacaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcaagctggagtggtacgaggccgtgtactactgccagtacggcaacagcagcccctgcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaag(seq id no:11)
[0088]
其中，重链可变区为seq id no:11中第1-372位，轻链可变区为第418-735位。
[0089]
从上述dna序列中推导出的氨基酸序列为：
[0090]
qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsdgwmhwvrqapgkglewvssinqdgsekyynqrvkgrftisrdnsknslylqmnslrvedtavyycvrdyydyftdyhywyfdlwgqgtlvtvsggggsggggsggggsdilltqspailsvspgeratlscrasqsvsssylawyqqkplsprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisklewyeavyycqygnsspctfgqgtrleik(seq id no:12)
[0091]
其中，重链可变区对应的氨基酸序列为seq id no:12第1-124位，轻链可变区为140-245位，下划线部分为接头序列。
[0092]
克隆3-p4n3：
[0093]
gaggtgcagctggtgcagagcggcgccggcctggtgcagcccggcggcagcctgaggctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagcgactactggatgcactgggtgaggcaggcccccggcaagggcctggagtgggtgagcagcatcaacatgtacgacggcagcaccacctactacgcccagagggtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacagcctgtacatgctgagcaacagcgaggtggaggacaccgccgtgtactactgcgtggtgagggactactacgactacttcaccgactactacatccacttcgacctgtggggccagggcaccctggtgagcggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacatcctgctgacccagagccccgccatcctgagcgtgagccccggcgagagggccaccctgagctgcagggccagccagagcgtgagcagcagctacctggcctggtacca
gcagaagcccctgagccccaggctgctgatctacggcgccagcagcagggccaccggcatccccgacaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcaagctggagtggtacgaggccgtgtactactgccagtacggcaacagcagcccctgcaccttcggccagggcaccaggctggagatcaag(seq id no:13)
[0094]
其中，重链可变区为seq id no:13中第1-366位，轻链可变区为第412-729位。
[0095]
从上述dna序列中推导出的氨基酸序列为：
[0096]
evqlvqsgaglvqpggslrlscaasgftfsdywmhwvrqapgkglewvssinmydgsttyyaqrvkgrftisrdnsknslymlsnsevedtavyycvvrdyydyftdyyihfdlwgqgtlvsggggsggggsggggsdilltqspailsvspgeratlscrasqsvsssylawyqqkplsprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisklewyeavyycqygnsspctfgqgtrleik(seq id no:14)
[0097]
其中，重链可变区对应的氨基酸序列为seq id no:14第1-122位，轻链可变区为138-243位，下划线部分为接头序列。
[0098]
将上述亲和力较强的含scfv基因的重组噬菌粒菌种接种于5ml lb培养基，过夜培养。加至50ml sbag(含100mg/l氨苄青霉素和2％葡萄糖的sb培养液)中，30℃振荡培养1h，5000rpm离心15min，弃上清。将沉淀重悬于50ml sbai(含100mg/l氨苄青霉素和1mmol/l iptg的sb培养液)中，37℃诱导3h，离心同上。取沉淀悬于5ml新配制的溶菌酶(1g/l)，20％(w/v)蔗糖，30mmol/ltris-cl(ph8.0)及1mmol/l edta(ph8.0)溶液中，冰浴10min，4℃以12000rpm离心5min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，存贮于-20℃。临用前以0.01mol/l pbs溶解至500μl。
[0099]
上述获得的单链抗体按照常规方法进行wersten印迹试验测试。
[0100]
实施例3
[0101]
重新克隆到含有人源恒区的表达载体pcep101，转化cho细胞分别设计和合成重链和轻链的引物，在重链引物前端加上kpni/hindiii酶切位点；在轻链引物前端加上xhoi/bamhi酶切位点。
[0102]
各引物设计如下：
[0103]
克隆1-k4e9：
[0104]
引物k4e9-hf：
[0105]
5'-cagggtaccgaggtgcagctggtggagagcg-3'(seq id no:15)
[0106]
引物k4e9-hr：
[0107]
5'-cagaagcttgctgctcacggtcaccagggtg-3'(seq id no:16)
[0108]
引物k4e9-lf：
[0109]
5'-cagctcgaggagatcgtgctgacccagagc-3'(seqid no:17)
[0110]
引物k4e9-lr：
[0111]
5'-cagggatcc cttgatctccagcctggtg-3'(seq id no:18)
[0112]
克隆2-c9h3：
[0113]
引物c9h3-hf：
[0114]
5'-cagggtacc caggtgcagctggtggagagc-3'(seqid no:19)
[0115]
引物c9h3-hr：
[0116]
5'-cagaagctt gctcacggtcaccagggtgcc-3'(seq id no:20)
[0117]
引物c9h3-lf：
[0118]
5'-cagctcgaggacatcctgctgacccagagcc-3'(seq id no:21)
[0119]
引物c9h3-lr：
[0120]
5'-cagggatcccttgatctccagcctggtgccc-3'(seq id no:22)
[0121]
克隆3-p4n3：
[0122]
引物p4n3-hf：
[0123]
5'-cagggtacc gaggtgcagctggtgcagag-3'(seqid no:23)
[0124]
引物p4n3-hr：
[0125]
5'-cagaagctt gctcaccagggtgccctggc-3'(seq id no:24)
[0126]
引物p4n3-lf：
[0127]
5'-cagctcgaggacatcctgctgacccagagc-3'(seq id no:25)
[0128]
引物p4n3-lr：
[0129]
5'-cagggatcc tgatctccagcctggtgccctg-3'(seq id no:26)
[0130]
分别用上述合成的引物，以实施例2获得的scfv片段为模板，按常规方法进行pcr，获得带有相应酶切位点的重链可变区片段和轻链可变区片段。
[0131]
将上述重链可变区(seq id no:9中第1-381位(对应的氨基酸序列为seq idno:10第1-127位)，或seq id no:11中第1-372位(对应的氨基酸序列为seq idno:12第1-124位)，或seq id no:13中第1-366位(对应的氨基酸序列为seq idno:14第1-122位))插入到表达载体pcep101的kpni/hindiii位点中，再用hind iii和bsi wi将上述抗体轻链可变区(seqid no:9中第427-750位(对应的氨基酸序列为seqid no:10第143-250位)，或seq id no:11中第418-735位(对应的氨基酸序列为seq id no:12第140-245位)，或seq id no:13中第412-729位(对应的氨基酸序列为seq id no:14第138-243位))插入到插入有重链可变区编码序列的pcep4的xhoi/bamhi位点中，构建成人源il-17a抗体的表达载体。表达载体pcep101骨架质粒pcep4购自invitrogen公司。
[0132]
上述构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌top10菌株，然后接种于100毫升lb培养基中进行扩增，用qiagen公司的超纯质粒dna纯化试剂盒(ultrapure plasmid dna purification kit)抽提纯化质粒dna。将上述纯化的质粒dna采用invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染cho细胞，操作参照厂家的说明书进行。
[0133]
转化的cho细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
[0134]
挑出的单克隆细胞系在rpmi 1641培养基上进行培养，对上清进行western印迹实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出8个表达较强的克隆作为候选细胞株。
[0135]
实施例4
[0136]
筛选cho细胞中的表达强度高的克隆将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10ml的方形细胞瓶中，采用elisa法测量抗体的表达量：羊抗人igg(fc)包被于elisa板，4℃过夜，经2％bsa于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人igg1)，37℃孵育2小时，加入hrp-羊抗人igg(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入tmb于37℃作用10分钟，最后用h
2
so
4
终止反应，测a450值。测得上述8个候选克隆的表达量如下：表1抗体基因在cho细胞中表达强度(mg/l)
[0137]
从表1可以看出，编号为8e3、3a9和7d6的细胞株具有很高的表达水平(140-290mg/
l)，其3a9的表达量达到了236.1mg/l。挑选表达量高的克隆进行大规模细胞培养并纯化，制备抗il-17a单克隆抗体。
[0138]
表1.在cho细胞中的表达强度(mg/l)
[0139][0140][0141]
实施例5
[0142]
抗人il-17a单克隆抗体3a9与il-17a的亲和力通过biacore3000检测，将不同浓度的il-17a通过氨基偶联包被在biacore 3000的芯片上后，检测抗体的亲和力，阳性抗体secukinumab和作为对照。实验结果见表2，结果表明本发明的3a9单克隆抗体与il-17a的亲和力高于阳性抗体secukinumab。
[0143]
表2.biacore3000检测
[0144]
ka((1/ms)
[0145]
抗体ka(1/ms)kd(1/s)kd(pm)3a91.66
×
10
6
1.58
×
10-5
35secukinumab2.71
×
10
5
4.03
×
10-5
89
[0146]
实施例6
[0147]
在生长状态良好的hela细胞中加入15ng/ml il-17a及不同浓度的单克隆抗体，每组设立四个复孔，37℃，5％co2中孵育培养24小时后收集细胞培养上清，用elisa试剂盒检测各组细胞分泌il-6的含量，测定单克隆抗体对il-17a诱导的hela细胞il-6分泌的抑制。3a9其对il-17a的功能抑制ic50值为84.2ng/ml，而参照抗体secukinumab的ic50值为133.7ng/ml。因此，3a9单克隆抗体对il-17a的抑制功能强于secukinumab。
[0148]
实施例7
[0149]
采用竞争性基于细胞的流式细胞测定(facs)，检测度单克隆抗体阻断il-17a与细胞上il-17ra的结合作用。3a9和参照抗体secukinumab均能显著地抑制il-17a与细胞上的il-17ra特异性结合，其ic 50分别为467.6ng/ml和580.8ng/ml，因此，相比参照抗体secukinumab，3a9阻断il-17a与细胞上il-17ra的结合作用更显著。
[0150]
实施例8
[0151]
il-17a可以刺激多种上皮细胞和其它细胞分泌细胞因子cxcl1表达与释放，可通过elisa定量检测细胞上清中cxcl1表达量变化，判断人源化抗体对il-17a在细胞中介导的生物活性的影响。使用标准技术在组织培养物处理的烧瓶中的培养/测定培养基中维持ht-29细胞(人结肠直肠腺癌上皮细胞，atcc)。ht-29在组织培养瓶中生长直至它们在测定当天达到50-80％汇合。在测定当天，用pbs冲洗细胞并用胰蛋白酶+edta从培养瓶中脱离细胞，并制成细胞悬液。取3a9或参照抗体secukinumab稀释液(起始浓度为40μg/ml，3倍浓度梯度稀释)与人il-17a(1μg/ml)混合，铺入96孔板中，孵育1h。向每孔中加入100μl(2
×
10
4
个)ht-29细胞悬液，37℃，7％co 2培养48h。500xg，5min离心，将培养上清转入新的96孔板中，
利用elisa试剂盒检测cxcl1的表达。3a9和参照抗体secukinumab均能显著地抑制上皮细胞释放cxcl，其ic50分别为663.1ng/ml和782.4ng/ml，因此，相比参照抗体secukinumab，3a9对il-17a刺激上皮细胞释放cxcl1具有更强得拮抗作用。
[0152]
实施例9
[0153]
在小鼠耳背皮肤涂抹咪喹莫特可诱导银屑病样病理学特征，即角质形成细胞过度增生、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管增生等，构建银屑病小鼠模型。以临床评分、耳部肿胀度等为指标判断药物对银屑病小鼠的治疗作用。
[0154]
取20g左右c57bl/6雌性小鼠32只，背部脱毛，三天后致敏。致敏前两天随机分成4组(每组8只)：i组为溶剂对照组，给予pbs；ii组为同型对照组，给予阴性对照样品的人iggl(pbs稀释)100mg/kg；iii组为3a9抗体给药组，给予3a9抗体100mg/kg；iv组为阳性对照组，给予地塞米松(pbs稀释)lmg/kg。上述各组于分组当天及造模第2天(day 2)各腹腔注射药物1次。致敏当天(day 1)，各组小鼠于右耳及背部皮肤上涂抹约62.5mg咪喹莫特乳膏(5％)，连续5天。
[0155]
自致敏当天起每天用螺旋测微仪测量小鼠右耳厚度，以day 0右耳厚度为对照计算小鼠耳肿胀厚度数值。同时给小鼠每天称重，观察皮肤鳞肩、硬结、红斑情况，进行评分，采用4级评分法：0分，不发病；1分，轻微；2分，中度；3分，严重；4分，非常严重。结果如图1所示。结果表明，与地塞米松相比，本发明人源化抗il-17a抗体3a9对咪喹莫特诱导的小鼠银肩病模型有显著的改善效果。
[0156]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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