三维细胞模型放射性药物体外筛选及生物效应评价方法与流程

[0001]
本发明属于放射性药物筛选与评价技术领域，具体涉及一种基于三维细胞模型的放射性药物体外筛选及生物效应评价方法。


背景技术：

[0002]
目前，在药物的研发过程中，普遍利用二维细胞模型在细胞层面对药物的临床前药效进行研究与评价，但二维细胞模型于体内实体瘤存在很大的差异，这是由于体外环境中的二维细胞模型都是经过了明显的表型改造，其培养环境也与真实的体内环境有着显著的差异，导致药物在二维细胞模型中所表现出的效应与病人体内的效应存在明显的差异。
[0003]
在放射性治疗药物的筛选及评价过程中，由于是利用二维细胞模型进行临床前体外药效研究，其局限性导致了实验结果与体内的真实情况有较大的差别。这也是放射性核素接触人体组织后在细胞层面的系统研究还不完善的原因之一。尤其是对于核素加载了药物前体后导致的靶向性及体内滞留时间的变化对生物体造成的细胞层面的影响缺乏系统的研究，这也导致临床上放射性药物剂量及用药方案只能通过实践尝试摸索，理论基础支撑不足，对于病人而言也存在很大风险。
[0004]
三维细胞模型中所提供的生长环境在细胞间交流和细胞外基质等方面更接近于体内组织，使细胞在迁移、分化、增殖、凋亡和基因表达等方面更接近于体内环境得到了提升。三维细胞模型中的细胞状态介于二维细胞模型和动物体内细胞之间，能够更好的模拟体内环境，弥补了体外细胞培养与体内研究的差异。尤其是在药物临床前研究中，三维细胞模型的一个重要用途就是用于建立体外疾病模型来评价细胞对药物的响应。研究表明利用三维细胞模型测试药物毒性所得的结果更接近于体内毒性测试的结果。
[0005]
目前关于三维细胞模型的研究还较少，如何将三维细胞模型应用于放射性治疗药物的研发过程中，以期能够从分子、细胞、亚组织等多尺度层面对辐射造成的生物效应进行科学评估，实现在体外对放射性治疗药物的高效筛选及药效的评价，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的就是为了解决现有技术存在的问题，而提供一种基于三维细胞模型的放射性药物体外筛选及生物效应评价方法。本发明建立了一种将能够良好模拟体内生物环境的三维细胞模型应用于放射性治疗药物的方法，运用该方法能够更好的从分子、细胞、亚组织等多尺度层面对辐射造成的生物效应进行科学评估，从而实现在体外对放射性治疗药物的高效筛选及药效的评价。
[0007]
本发明的目的是提供一种基于三维细胞模型的放射性药物体外筛选及生物效应评价方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]
(1)构建羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外三维细胞模型培养基质；
[0009]
(2)构建人骨肉瘤体外三维细胞模型；
[0010]
(3)将不同放射性活度的
177
lu-herceptin加入人骨肉瘤mg63 的三维细胞模型中，37℃条件下孵育4小时；取每孔的上清培养液，用4℃预冷的1m磷酸缓冲液浸泡细胞模型2分钟，并将浸泡液与上清液合并，采用gamma counter进行放射性计数；对模型中的细胞采用胰酶进行消化，使其与基质分离，收集细胞液，采用gamma counter 进行放射性计数。
[0011]
进一步的是，步骤(1)中所述体外三维细胞模型培养基质的构建方法为：将磷酸化的透明质酸溶解在磷酸缓冲液中形成4％(w/v) 的溶液，将纳米羟基磷灰石纳米颗粒分散在纯水中得到12％(w/v)的溶液，在注射器中等体积的混匀两种溶液，将混合物在1分钟内迅速注射入固定形状模具，放置10分钟后羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质，最终磷酸化透明质酸的浓度为2％(w/v)，羟基磷灰石浓度为6％(w/v)。
[0012]
上述百分比浓度，是指相应物质的质量体积比百分浓度，其含义是将磷酸化的透明质酸溶解在磷酸缓冲液中形成40mg/ml的溶液，将纳米羟基磷灰石纳米颗粒分散在纯水中得到120mg/ml的溶液，最终磷酸化透明质酸的浓度为20mg/ml，羟基磷灰石浓度为60mg/ml。
[0013]
进一步的是，所述磷酸缓冲液为20mm pbs。
[0014]
进一步的是，步骤(2)中所述人骨肉瘤体外三维细胞模型的构建方法为：人骨肉瘤mg63细胞消化、计数，用含有10％胎牛血清的dmem高糖培养基重悬细胞，以10
5
cells/孔的密度接种于铺有羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质的24孔板中，放置于 37℃，5％co
2
的培养箱中，连续培养10天，每隔2天换新鲜培养液。
[0015]
进一步的是，步骤(3)中所述不同放射性活度范围为3～0.0029 μci。
[0016]
进一步的是，步骤(3)中所述
177
lu-herceptin的标记比活度为2 mci/mg。
[0017]
进一步的是，步骤(3)中所述磷酸缓冲液的ph＝7.4。
[0018]
本发明的有益效果如下：
[0019]
本发明建立了一种将体外三维细胞模型应用于筛选和评估放射性治疗药物的方法，基于该类模型对放射性治疗药物所产生的辐射生物学效应进行研究，证明体外三维细胞模型可用于放射性药物的筛选和药效评价。本发明方法实现了更好的从分子、细胞、亚组织等多尺度层面对辐射造成的生物效应进行科学评估，从而实现了在体外对放射性治疗药物的高效筛选及药效的评价。
附图说明
[0020]
图1是羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质的流变力学分析图；
[0021]
图2是羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质的宏观形态图；
[0022]
图3是羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质的微观形貌 (sem)图；
[0023]
图4是mg63二维细胞模型及三维细胞模型对
177
lu-herceptin的摄取结果图；
[0024]
图5是
177
lu-herceptin对mg63二维细胞模型及三维细胞模型中细胞凋亡的影响结果图。
具体实施方式
[0025]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限
定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0026]
实施例1
[0027]
构建羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外三维细胞模型培养基质。
[0028]
实验材料：羟基磷灰石纳米颗粒(粒径为200nm左右)，磷酸化透明质酸高分子，磷酸缓冲液，5ml无菌注射器，自制直径1.5cm圆形模具。
[0029]
实验方法：将磷酸化的透明质酸溶解在磷酸缓冲液(20mm pbs) 中形成4％(w/v)的溶液，将纳米羟基磷灰石纳米颗粒分散在纯水中得到12％(w/v)的溶液，在注射器中等体积的混匀两种溶液，将混合物在1分钟内迅速注射入固定形状模具，放置10分钟后羟基磷灰石-磷酸化透明质酸体外细胞培养基质，最终磷酸化透明质酸的浓度为2％(w/v)，羟基磷灰石浓度为6％(w/v)。
[0030]
实施例2
[0031]
构建人骨肉瘤体外三维细胞模型：
[0032]
人骨肉瘤mg63细胞消化、计数，用含有10％胎牛血清的dmem 高糖培养基重悬细胞。以10
5
cells/孔的密度接种于铺有羟基磷灰石
-ꢀ
磷酸化透明质酸体外细胞培养基质的24孔板中，放置于37℃，5％co
2
的培养箱中，连续培养10天，每隔2天换新鲜培养液。
[0033]
实施例3
[0034]
构建人骨肉瘤体外二维细胞模型：
[0035]
人骨肉瘤mg63细胞消化、计数，用含有10％胎牛血清的dmem 高糖培养基重悬细胞。以10
5
cells/孔的密度接种于24孔板中，放置于37℃，5％co
2
的培养箱中培养至细胞形成致密单层，每隔2天换新鲜培养液。
[0036]
实施例4
[0037]
摄取及细胞凋亡实验：
[0038]
1.人骨肉瘤mg63三维细胞模型及二维细胞模型的构建方法同实施例2和实施例3中的实验方法
[0039]
2.细胞对放射性药物的摄取实验
[0040]
将不同放射性活度(3～0.0029μci)的
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lu-herceptin(标记比活度为2mci/mg)加入人骨肉瘤mg63的三维细胞模型及二维细胞模型中，37℃条件下孵育4小时。每孔的上清培养液，用4℃预冷的1m 磷酸缓冲液(ph＝7.4)浸泡细胞模型2分钟，并将浸泡液与上清液合并，采用gamma counter进行放射性计数。对模型中的细胞采用胰酶进行消化，使其与基质分离，收集细胞液，采用gamma counter进行放射性计数。对比不同细胞模型对放射性药物摄取的影响发现，在三维细胞模型中mg63细胞对放射性药物的摄取率明显要高于二维细胞。
[0041]
放射性药物摄取率％＝细胞的放射性计数/(细胞放射性计数+上清培养液放射性计数+浸泡液放射性计数)
×
100％
[0042]
3.放射性药物对细胞凋亡的影响
[0043]
将50μci的
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lu-herceptin(标记比活度为2mci/mg)加入人骨肉瘤mg63的三维细胞模型及二维细胞模型中(10
5
cells/孔)，37℃，5％ co
2
条件下孵育4天。弃掉上清培养液，1m磷酸缓冲液(ph＝7.4)浸泡细胞模型2分钟，对模型中的细胞采用胰酶进行消化，使其与
基质分离，收集细胞液。采用annexinv-pi标准流程对细胞进行染，用流式细胞仪测定细胞的凋亡情况。根据细胞凋亡结果可以发现，三维细胞模型中的mg63细胞对放射性核素引起的辐射损伤的耐受性要明显好于二维细胞模型。

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