一种肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法及其应用与流程

2021-02-02 12:02:30|

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[0001]
本发明属于核酸与病毒核衣壳蛋白互作技术领域，具体涉及一种肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法及其应用。

背景技术：

[0002]
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]
病毒装配机制的研究对病毒性疾病的防治具有重要意义，研究者利用包装序列可与包装酶或衣壳结构蛋白发生特异识别的特性，在核酸与病毒核衣壳蛋白的相互作用及装配机制方面进行了较深入的研究，如通过马铃薯x病毒rna 5
’
端区域ac富集区和茎环结构与衣壳蛋白相互作用，揭示了该区域rna二级结构元素在病毒颗粒组装和衣壳蛋白亚单位的特异性识别过程中起到决定性作用。在真核生物中通过筛选得到高亲和力rna分子，分析了其与转录因子的相互作用，发现了相关抑制因子并阐释了其抑制作用。在探究不同病毒核衣壳蛋白和核酸识别机制的基础上，各国学者致力于重组衣壳蛋白体外自组装病毒样颗粒(vlps)的研究，通过特异包装外源目的基因，为基因疫苗和新型药物的研制提供理想载体。目前，此类研究主要见诸人类和高等动物，如登革热病毒(dengue-2virus，丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)和猴病毒(mason-pfizer monkey virus)、鹦鹉啄羽病病毒(bfdv)等体外组装病毒取得较大进展，部分实验结果试图通过动物测试进入临床应用。无脊椎动物的相关研究尚处于起步阶段。
[0004]
已报道的20余种对虾病毒中细小病毒有肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic parvovirus,hpv)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)两种，分别隶属于细小病毒亚科(parvovirinae)，细小病毒属(parvovirus)和浓核症病毒亚科(densovirinae,dnvs)，短浓核病毒属(brevidensovirus)。均是由单一核衣壳蛋白包装单链核酸基因组为结构的细小病毒。根据细小病毒科中许多病毒衣壳蛋白可以重组装配形成病毒样颗粒以及单链核酸具有功能性天然构象的特性，被研究者们用作疾病治疗的良好工具。目前已开展了hpv全基因组的克隆及分析，并完成了hpv中国分离株的全基因组序列测定，确定由6084个核苷酸组成，包含3个开放阅读框，分析发现衣壳蛋白核酸序列末端存在“gaa”的正向重复序列，该序列与通常细小病毒基因组dna两末端非编码区存在的较长反向重复序列(itrs)的相关性，它在基因组复制和核衣壳形成过程中的重要作用等问题值得深入研究。已发现重组表达的ihhnv衣壳蛋白具有自组装病毒样颗粒(vlps)的能力，vlps保持了细胞取向性和病毒受体定向结合性，不能自行复制、不具有感染性，可在病毒样颗粒装配时，作为载体有效包装抗干扰rna进行病毒防治。

技术实现要素：

[0005]
为了克服上述技术问题，本发明提供一种肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选
方法及其应用。本发明通过指数富集的配基系统进化技术(selex)成功筛选到与hpv核衣壳蛋白亲和的核酸片段。该技术方法为蛋白与核酸免疫检测奠定了基础，为hpv分子流行病学和致病机理等方面的研究提供了科学依据，因此具有良好的实际应用之价值。
[0006]
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007]
本发明的第一个方面，提供一种肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法，所述方法包括：
[0008]
构建对虾肝胰腺细小病毒(hpv)全基因随机ssdna库，重组表达hpv核衣壳蛋白，基于指数富集的配基系统进化(selex)技术筛选hpv包装识别分子。
[0009]
本发明的第二个方面，提供一种hpv的包装识别分子，所述包装识别分子为上述肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法获得的核酸片段，所述核酸片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。其具有与hpv核衣壳蛋白高亲和性，从而可作为hpv的包装识别分子。
[0010]
本发明的第三个方面，提供上述肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法和/或hpv包装识别分子在如下任意一种或多种中的应用：
[0011]
1)核酸与衣壳蛋白识别机制研究；
[0012]
2)病毒间识别机制研究；
[0013]
3)蛋白与核酸免疫检测；
[0014]
4)病毒抑制剂或灭活剂制备。
[0015]
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
[0016]
上述技术方案通过对hpv核酸与核衣壳蛋白亲和筛选进行研究，最终成功筛选出与hpv核衣壳蛋白具有高亲和性的dna片段，即hpv的包装识别序列，从而有助于阐明病毒核衣壳蛋白与核酸选择性识别包装机制，为蛋白与核酸免疫检测奠定了基础，为hpv分子流行病学和致病机理等方面的研究提供了科学依据，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
[0017]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0018]
图1为本发明实施例中纯化的cp自组装成病毒样颗粒的电镜图，标尺：50nm。
[0019]
图2为本发明实施例中selex第一轮筛选结果图。
[0020]
图3为本发明实施例中selex第二轮筛选结果图。
[0021]
图4为本发明实施例中selex第三轮筛选结果图。
[0022]
图5为本发明实施例中selex第四轮筛选结果图。
[0023]
图6为本发明实施例中selex第五轮筛选结果图。
[0024]
图7为本发明实施例中selex第六轮筛选结果图。
[0025]
图8为本发明实施例中selex第七轮筛选结果图。
[0026]
图9为本发明实施例中selex第八轮筛选结果图。
[0027]
图10为本发明实施例中selex第九轮筛选结果图。
[0028]
图11为本发明实施例中selex第十轮筛选结果图。
[0029]
图12为本发明实施例中selex第十一轮筛选结果图。
[0030]
图13为本发明实施例中selex第十二轮筛选结果图。
[0031]
图14为本发明实施例中selex第十三轮筛选结果图。
[0032]
图15为本发明实施例中selex第十四轮筛选结果图。
[0033]
图16为本发明实施例中筛选的各轮产物与核衣壳的亲和力图。1-14为筛选的14轮产物，15为连接转化后得到的258bp序列。
具体实施方式
[0034]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0035]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0036]
本发明的一个具体实施方式中，提供一种肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法，所述方法包括：
[0037]
构建对虾肝胰腺细小病毒(hpv)全基因随机ssdna库，重组表达hpv核衣壳蛋白，基于指数富集的配基系统进化(selex)技术筛选hpv包装识别分子。
[0038]
本发明的又一具体实施方式中，所述构建对虾肝胰腺细小病毒(hpv)全基因随机ssdna库具体方法包括：pcr扩增获得hpv全长dna，基于超声技术随机打断dna。
[0039]
本发明的又一具体实施方式中，使用la taq酶pcr得到hpv全长dna；经超声随机打断，100-300bp的dna片段回收、平端化、连接、nick修复、pcr，得到连接有共扩引物的hpv随机dsdna。
[0040]
如前所述，hpv全基因序列是已知的(ncbi登录号ay008257.2)。
[0041]
所述重组表达hpv核衣壳蛋白具体方法包括：
[0042]
将hpv核衣壳蛋白基因(cp)插入质粒中构建重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌中进行重组表达，分离、纯化、复性获得hpv核衣壳蛋白。
[0043]
其中，所述质粒可以为pet28a或pet30a，优选为pet28a。
[0044]
本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达hpv核衣壳蛋白还包括验证获得的蛋白是否具有自组装成病毒样颗粒(vlps)能力。
[0045]
所述基于指数富集的配基系统进化(selex)技术筛选hpv包装识别分子的具体方法包括：进行多次多轮筛选，筛选获得与hpv核衣壳蛋白高亲和力核酸包装识别分子。
[0046]
本发明的又一具体实施方式中，所述与hpv核衣壳蛋白高亲和力核酸包装识别分子其核苷酸序列如seq id no.1所示。筛选到的片段经克隆、测序、比对，258bp单一片段位于hpv(ncbi登录号ay008257.2)全基因组4025-4279，为第三个开放阅读框转录并翻译核衣壳蛋白的编码序列。
[0047]
本发明的又一具体实施方式中，提供一种hpv的包装识别分子，所述包装识别分子为上述肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法获得的核酸片段，所述核酸片段的核苷
酸序列如seq id no.1所示。其具有与hpv核衣壳蛋白高亲和性，从而可作为hpv的包装识别分子。
[0048]
本发明的又一具体实施方式中，提供上述肝胰腺细小病毒与核衣壳蛋白亲和筛选方法和/或hpv包装识别分子在如下任意一种或多种中的应用：
[0049]
1)核酸与衣壳蛋白识别机制研究；
[0050]
2)病毒间识别机制研究；
[0051]
3)蛋白与核酸免疫检测；
[0052]
4)病毒抑制剂或灭活剂制备。
[0053]
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。
[0054]
实施例
[0055]
病毒装配机制的研究对病毒性疾病的防治具有重要意义。目前，对虾细小病毒核酸与衣壳蛋白相互作用及装配机制尚不清楚，揭示单链核酸与衣壳蛋白识别机制为深入探讨和研究利用病毒样颗粒作为基质有效包装抗干扰rna进行病毒防治奠定基础。近年来，我们已开展了hpv中国株全基因序列测定与分析并尝试进行hpv重组衣壳蛋白的表达。在前期工作基础上构建了对虾肝胰腺细小病毒(hpv)全基因随机ssdna库，使用亲和层析纯化并复性重组表达了hpv核衣壳蛋白。进行了hpv自主装病毒样颗粒效果初探，在此基础上，使用指数富集的配基系统进化技术(selex)，筛选与hpv核衣壳蛋白高亲和力核酸包装识别分子。完成了两次共十八轮筛选，得到258bp单一片段，比对结果显示筛选到的该基因片段位于hpv(ncbi登录号ay008257.2)全基因组4025-4279，为第三个开放阅读框转录并翻译核衣壳蛋白的编码序列。将筛选得到的258bp片段以40bp/段分成12段后检测亲和力，将筛选的1-14轮产物进行亲和力检测发现亲和力逐渐上升，并在第七轮接近饱和。该研究结果为蛋白与核酸免疫检测奠定了基础，为hpv分子流行病学和致病机理等方面的研究提供依据。
[0056]
1.hpv核衣壳蛋白的原核表达纯化和自组装
[0057]
构建了pet28a-cp重组质粒在bl21中重组表达，分离得到粗蛋白，利用ge akta explorer 100对目的蛋白进行纯化、复性。sds-page显示，在100kda位置出现一条表达目的蛋白条带。
[0058]
为了确定纯化的蛋白是否具有自组装成病毒样颗粒(vlps)的能力，纯化可溶性的重组衣壳蛋白，置于电镜下放大120，000倍后发现少量自组装成直径约20nm的均一的vlps，呈圆形，且轮廓清晰(图1)，大小形态均与野生病毒相似。
[0059]
2.hpv基因组随机dna库构建
[0060]
使用la taq酶pcr得到hpv全长dna，经超声随机打断，100-300bp片段回收、平端化、连接、nick修复、pcr，得到连接有共扩引物的hpv随机dsdna。其中，共扩引物其引物序列为：ad-fr，5
’-
tctgtcatcgctgcttcgta-3
’
(seq id no.2)。
[0061]
3.指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选
[0062]
完成了两次筛选工作，第一次进行了四轮筛选，即出现300bp和500bp处单一大小的核酸片段；回收片段超声随机打断后进行了第二次共十四轮的筛选，得到258bp单一片段，blast比对结果显示筛选到的该基因片段位于hpv(ncbi登录号ay008257.2)全基因组4025-4279，为第三个开放阅读框转录并翻译核衣壳蛋白的编码序列。
[0063]
第一次筛选：纯化的hpv衣壳蛋白经固定，位点封闭，dsdna变性处理，反筛，孵育结合，清洗，洗脱，抽提纯核酸，pcr扩增，电泳观察等步骤后进入下一轮筛选。将筛选获得的hpv核酸进行超声随机打断。双链随机dna平端化、连接共扩引物，由于adaptor dna平末端5
’-
oh不能被t4 dna聚合酶连接。使用ex taq酶进行修复，并以此作为筛选的开始，进行第二次的筛选工作。
[0064]
第二次筛选：同第一轮筛选过程，共进行了14轮筛选，最终条带全部集中在近300bp处(图2-15)。其中，m：dl500 marker；每图中a为a组上一轮筛选的两个平行；每图c为c组上一轮轮筛选的两个平行；每图5c为5c组上一轮筛选的两个平行；n：空白对照；a、c和5c均为hpv随机库随机三份样品。
[0065]
筛选到的片段经克隆、测序、比对，258bp单一片段位于hpv(ncbi登录号ay008257.2)全基因组4025-4279，为第三个开放阅读框转录并翻译核衣壳蛋白的编码序列，如下所示：
[0066]
cgctaaaactgtacttaatatctccactgttactgccttcattcattcccgtcagtcttcgtacaaatggagtgtctgctgatgctgaccatgttaacttgtcatgtattagcttacactcggcctctactttgtaaaccctctgaggtacatacacttcgtctccaatgtgtttgagatcgataggttgattgcggtggcgctggaatgcatcgttggtgttttcaccataccctgctgtctcacctccattgccac(seq id no.1)
[0067]
4.hpv核衣壳蛋白与筛选得到的核酸片段亲和力的检测
[0068]
为获得与hpv核衣壳蛋白亲和力最高的片段，将筛选得到的258bp片段以40bp/段分成12段后检测亲和力同时将筛选的1-14轮产物进行亲和力检测发现亲和力逐渐上升，并在第七轮接近饱和(图16)。该结果为蛋白与核酸免疫检测奠定了基础。
[0069]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

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