玉米多肽粉以及超声辅助酶法提取玉米多肽的方法与流程

[0001]
本发明涉及玉米多肽提取工艺，具体涉及一种玉米多肽粉以及超声辅助酶法提取玉米多肽的方法。


背景技术：

[0002]
近年来，随着煤炭、石油能源危机和空气污染、全球变暖等环境问题日趋严重，燃料乙醇作为可再生的生物能源产量剧增。我国的生物燃料乙醇工艺主要以玉米为原料进行生产，经液化、同步糖化发酵、蒸馏出酒精，同时伴随着大量酒糟醪液的产生。酒糟醪液中含有大量的粗蛋白、丰富的氨基酸、微生物和多种微量元素，若处理不当将会造成巨大的资源浪费和严重的环境污染，若处理得当，不但能够解决环境污染问题，还会得到较高经济价值的副产品，提高玉米燃料乙醇的经济效益。
[0003]
玉米醇溶蛋白(zein)是玉米蛋白中的重要蛋白，占其蛋白总量的50-60％。醇溶蛋白是一种疏水性很强的蛋白，不溶于水，溶于60-95％的醇类水溶液中，还能溶于ph>11强碱溶液、高浓度尿素或阴离子活性剂(如十二烷基硫酸钠sds等)，这是由其具有特殊的氨基酸组成决定的，它含有大量的疏水性氨基酸和含硫氨基酸，如谷氨酸，亮氨酸，脯氨酸，丙胺酸，但是缺乏赖氨酸、天冬氨酸及色氨酸等酸性和碱性氨基酸，作为食物供给时不能保证氮平衡，但这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白成为功能活性肽的来源。
[0004]
采用蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行酶解后获得各种生理活性肽是提高玉米蛋白的综合利用率的一个重要研究手段。但是玉米醇溶蛋白与其他天然蛋白质一样，具有自己特有且复杂的内部结构，由于多肽主链上的羟基与亚氨基的氢键作用而形成α-螺旋体，多肽链间通过次级键相互组合形成复杂的四级结构，加之天然的玉米醇溶蛋白质分子可进一步聚合成聚合体，因此玉米醇溶蛋白分子结构复杂，高度紧密，对蛋白酶的“酶解进攻”具有很强的抵抗力。加之玉米醇溶蛋白难溶于水，悬浮在水溶液中与蛋白酶接触的机率小。因此传统蛋白酶酶解方法存在着产物得率低、酶解时间长，蛋白酶利用率低等问题。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是为了克服现有技术存在的传统蛋白酶方法存在着产物得率低、酶解时间长，蛋白酶利用率低等问题，提供一种超声辅助酶法提取玉米多肽的方法以及由该方法提取得到的玉米多肽粉，该方法采用超声法和糖酶辅助提取，促进醇溶蛋白的粉碎与液化，提高蛋白酶分子的活性，增加了醇溶蛋白与蛋白酶活性位点的接触几率，提高了蛋白酶利用率，显著提高了提取效率，缩短了提取时间。
[0006]
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种玉米多肽的提取方法，该方法包括以下步骤：
[0007]
步骤1：将玉米发酵醪与糖化酶接触，以对玉米发酵醪进行第一酶解，并将得到的第一酶解产物进行第一固液分离，得到固相酶解产物；
[0008]
步骤2：将得到的所述固相酶解产物与水混合后与蛋白酶接触，以对其进行第二酶
解，并将得到的第二酶解产物进行第二固液分离，得到富含多肽的水解液；
[0009]
步骤3：加热所述水解液灭酶，冷却后进行浓缩，干燥，得到玉米多肽粉；
[0010]
其中，所述第一酶解和/或所述第二酶解在超声的条件下进行。
[0011]
另一方面，本发明提供如上所述的方法制备的玉米多肽粉。
[0012]
本发明提供的超声辅助酶法提取玉米多肽的方法，具备以下优势：
[0013]
(1)本发明首先采用糖酶法处理玉米发酵醪，有效地去除了发酵醪中的蛋白类物质外层的包裹，得到了富含单糖的水解液，并进一步打开了玉米的结构，使固体中的蛋白更容易被接触，在第一步水解的基础上，蛋白酶更容易与之接触，进而提高酶解效率，得到了富含多肽的水解液，此过程条件温和，专一性高，易于控制。
[0014]
(2)本发明在酶解过程中采用超声辅助处理，不仅修饰了底物分子和酶分子的结构，而且增加了底物与酶活性位点的接触几率，促进了酶解反应的发生，有效地提高了酶的利用率，产物得率，显著缩短了酶解时间，具有很高的经济效益和社会效益。
[0015]
(3)本发明具有安全、环保、绿色等优点，提高了玉米发酵醪的附加值，得到的玉米多肽成品纯度高且能完全溶于水中，扩大了玉米醇溶蛋白的应用范围，具有广阔的应用前景。
[0016]
(4)本发明减少了资源浪费，提高了经济效益，真正实现玉米醇溶蛋白的价值，为将来工业化生产提供一定的理论指导，有着重要的意义。
附图说明
[0017]
图1为本发明一种具体的超声辅助酶法提取玉米多肽的工艺流程图。
具体实施方式
[0018]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0019]
第一方面，本发明提供一种玉米多肽的提取方法，该方法包括以下步骤：
[0020]
步骤1：将玉米发酵醪与糖化酶接触，以对玉米发酵醪进行第一酶解，并将得到的第一酶解产物进行第一固液分离，得到固相酶解产物；
[0021]
步骤2：将得到的所述固相酶解产物与水混合后与蛋白酶接触，以对其进行第二酶解，并将得到的第二酶解产物进行第二固液分离，得到富含多肽的水解液；
[0022]
步骤3：加热所述水解液灭酶，冷却后进行浓缩，干燥，得到玉米多肽粉；
[0023]
其中，所述第一酶解和/或所述第二酶解在超声的条件下进行。
[0024]
根据本发明，所述玉米发酵醪为以玉米为原料进行酒精生产过程中的副产物，具体的，玉米原料经液化、同步糖化，然后接入菌种进行酒精发酵，发酵结束后蒸馏出酒精，所剩余的残液即为所述玉米发酵醪，其含有大量的粗蛋白、丰富的氨基酸、微生物和多种微量元素。所述玉米发酵醪的来源不受特别的限制，可以商购获得，或者在具有玉米酒精生产能力的条件下，自行制备获得。
[0025]
根据本发明一种优选实施方式，所述玉米发酵醪含有3-4重量％的粗蛋白。
[0026]
根据本发明，只要在第一酶解和第二酶解的任意一酶解步骤中引入超声即可实现本发明的目的，但更为优选的，第一酶解和第二酶解均在超声的条件下进行。
[0027]
根据本发明，优选的，所述第一酶解在超声的条件下进行，所述超声的条件可以在较宽的范围内改变，但为了进一步提高本发明的效果，所述超声的功率为100-300w，例如，可以为100w、110w、120w、130w、140w、160w、180w、200w、220w、240w、260w、280w、300w，优选为110-140w。
[0028]
根据本发明，所述第一酶解的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，为了进一步提高本发明的效果，所述第一酶解的条件包括，ph值为4-5.5，例如，可以为4、4.3、4.5、4.8、5、5.3、5.5，优选为4.8-5；温度为40-60℃，例如，可以为40℃、45℃、47℃、51℃、53℃、55℃、60℃，优选为45-55℃，总时间为6-48小时，例如，可以为6小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、48小时，优选为20-30小时。
[0029]
根据本发明，所述第一酶解可以整个过程均在超声的条件下进行，也可以在某一个时间段在超声的条件下进行，例如，在初始阶段，在中间阶段，或者在结束阶段。根据本发明一种优选的实施方式，所述第一酶解的初始阶段在超声的条件下进行，超声时间优选在3h之内，例如，可以为0.1h、0.2h、0.4h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h，更优选为1.5-2.5h。
[0030]
根据本发明一种更为优选的实施方式，将玉米发酵醪与糖化酶的混合物料先进行超声酶解，然后再进行搅拌酶解，直至酶解结束。
[0031]
其中，所述搅拌的转速没有特别的限制，优选为200-300rpm。
[0032]
根据本发明，所述糖化酶的用量可以在较宽的范围内选择，为了进一步提高本发明的效果，优选的，相对于100重量份的以干重计的所述玉米发酵醪，糖化酶添加量为0.005-0.15重量份，例如，可以为0.005重量份、0.01重量份、0.02重量份、0.03重量份、0.04重量份、0.05重量份、0.06重量份、0.07重量份、0.08重量份、0.09重量份、0.1重量份、0.11重量份、0.12重量份、0.13重量份、0.14重量份、0.15重量份，优选为0.08-0.12重量份。
[0033]
根据本发明，为了进一步提高本发明的效果，步骤1中，所述第一酶解还在纤维素酶和半纤维素酶的存在下进行，相对于100重量份的以干重计的所述玉米发酵醪，纤维素酶添加量不高于0.6重量份，例如，可以为0.1重量份、0.2重量份、0.3重量份、0.4重量份、0.5重量份、0.6重量份，优选为0.4-0.6重量份，半纤维素添加量不高于0.3重量份，例如，可以为0.1重量份、0.2重量份、0.3重量份，优选为0.1-0.3重量份。
[0034]
本发明需要说明的是，如上所述的玉米发酵醪的干重是指在40-60℃条件下对玉米发酵醪进行干燥至恒重得到的干物质的重量。
[0035]
根据本发明，所述第一固液分离的方法可以为常规的各种将混合液中的固相和液相进行分离的方法，例如，可以为过滤、离心等。根据本发明一种优选的实施方式，所述第一固液分离为离心。其中，所述离心的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，所述离心条件为：转速为3000-10000rpm，例如，可以为3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm，优选为3000-8000rpm；时间为5-30min，例如，5min、10min、15min、20min、25min、30min，优选为15-25min。
[0036]
根据本发明，为了提高最终所得玉米多肽的纯度，优选的，固液分离后，还包括用水洗涤所得固体多次至表面无游离的残糖。其中，所述水可以为去离子、纯水等。
[0037]
根据本发明，步骤2中，水的用量不受特别的限制，但优选的，水的用量使得所述固相酶解产物与水混合后物料中干固含量为25-35重量％，优选为27-33重量％，例如，可以为27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％。其中，所述水可以为去离子、纯水等。此处所述的干固含量是指在室温条件下对所述固相酶解产物进行干燥至恒重得到的干物质的重量。
[0038]
根据本发明，所述蛋白酶可以为传统蛋白酶酶解方法中使用的蛋白酶，例如，可以包括但不限于碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的至少一种；优选为风味蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶中的至少一种。
[0039]
根据本发明，所述蛋白酶的用量可以不受特别的限制，优选的，相对于100重量份的以干重计的所述固相酶解产物，所述蛋白酶的用量不高于20重量份，例如，0.5重量份、1重量份、5重量份、7重量份、9重量份、11重量份、13重量份、15重量份、17重量份、20重量份。
[0040]
根据本发明，优选的，所述第二酶解在超声的条件下进行，所述超声的条件可以在较宽的范围内改变，但为了进一步提高本发明的效果，所述超声的功率为100-300w，例如，可以为100w、110w、120w、130w、140w、160w、180w、200w、220w、240w、260w、280w、300w，优选为110-140w。
[0041]
根据本发明，所述第二酶解的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，温度为40-60℃，例如，可以为40℃、45℃、47℃、51℃、53℃、55℃，60℃，优选为45-55℃，总时间为2-48小时，例如，可以为2小时、6小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、48小时，优选为10-15小时。
[0042]
根据本发明，第二酶解过程中ph值的控制可以根据所加入的蛋白酶的种类进行具体的选择，优选控制在所加入的蛋白酶的最优ph值范围内。
[0043]
根据本发明，所述第二酶解可以整个过程均在超声的条件下进行，也可以在某一个时间段在超声的条件下进行，例如，在初始阶段，在中间阶段，或者在结束阶段。根据本发明一种优选的实施方式，所述第二酶解的初始阶段在超声的条件下进行，超声时间优选在3h之内，例如，可以为0.1h、0.2h、0.4h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h，更优选为0.3-0.8h。
[0044]
根据本发明一种更为优选的实施方式，所述第二酶解的方法包括，将所述固相酶解产物、水与蛋白酶的混合物料先进行超声酶解，然后再进行搅拌酶解。
[0045]
其中，所述搅拌的转速没有特别的限制，优选为200-300rpm。
[0046]
根据本发明，所述第二固液分离的方法可以为常规的各种将混合液中的固相和液相进行分离的方法，例如，可以为过滤、离心等。根据本发明一种优选的实施方式，所述第二固液分离为离心。其中，所述离心的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，所述离心条件为：转速为3000-10000rpm，例如，可以为3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm，优选为3000-8000rpm；时间为5-30min，例如，5min、10min、15min、20min、25min、30min，优选为15-25min。
[0047]
根据本发明，步骤3中，所述灭酶的温度不受特别的限制，只要能够将加入的酶能够有效灭活即可，例如，可以在90-110℃下加热5-15min以对体系中的酶进行灭活。
[0048]
根据本发明，步骤3中，所述浓缩的方法也可以为本领域常规的方法，例如，加热浓缩，减压浓缩等。
[0049]
根据本发明，步骤3中，所述干燥的方法可以为本领域常规的方法，例如，可以为冷冻干燥、喷雾干燥或真空加热干燥。
[0050]
根据本发明一种优选的实施方式，如图1所示，所述玉米多肽的提取方法包括：
[0051]
(1)调节玉米发酵醪的ph至4.8-5，加入淀粉糖化酶、纤维素酶和半纤维素酶，其中糖化酶添加量为固体干重的0.08-0.12％，纤维素酶添加量为固体干重的0.4-0.6％，半纤维素酶添加量为固体干重的0.1-0.3％，先在110-140w下超声1.5-2.5h后在200-300rpm条件下酶解20-25h，酶水解全过程保持温度为45-55℃。
[0052]
(2)酶水解后，固液分离，用纯水洗涤固体多次至表面无游离的残糖。
[0053]
(3)将上述固体与纯水混合至干物浓度为27-33重量％，调节ph，加入碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的添加量为固体干重的5-15％，先在110-140w下超声0.3-0.8h后在200-300rpm条件下酶解10-15h，酶水解全过程保持温度为45-55℃。
[0054]
(4)酶水解后，固液分离，迅速将水解液加热至90-110℃，持续5-15min，灭酶，冷却后进行减压浓缩，冷冻干燥，得到玉米多肽粉末。
[0055]
第二方面，本发明提供了如上所述的方法制备的玉米多肽粉。
[0056]
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
[0057]
玉米发酵醪原液来自玉米发酵生产线，含有3.5重量％的粗蛋白。
[0058]
葡萄糖、木糖、乙醇浓度采用高效液相色谱法进行检测。
[0059]
粗蛋白、多肽含量采用凯氏定氮法(gb/t5009.5-2010)检测，并计算而得。
[0060]
多肽提取率＝提取后的多肽质量(g)/发酵醪中总蛋白含量(g)。
[0061]
碱性蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号9014-01-1。
[0062]
实施例1
[0063]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0064]
(1)调节100g玉米发酵醪的ph至4.8-5，加入淀粉糖化酶、纤维素酶和半纤维素酶，其中糖化酶添加量为固体干重的0.1％，纤维素酶添加量为固体干重的0.6％，半纤维素酶添加量为固体干重的0.1％，先在120w下超声2h后在250rpm条件下酶解22h，酶水解全过程保持温度为50℃。
[0065]
(2)酶水解后，固液分离，用纯水洗涤固体多次至表面无游离的残糖，将洗涤水与步骤(1)与固液分离所得液相合并，测定液相中葡萄糖的量，结果如表1所示。
[0066]
(3)将上述固体与纯水混合至干物浓度为30重量％，调节ph，加入碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的添加量为固体干重的5％，先在120w下超声0.5h后在250rpm条件下酶解12h，酶水解全过程保持温度为50℃。
[0067]
(4)酶水解后，固液分离，迅速将水解液加热至100℃，持续10min，灭酶，冷却后进行减压浓缩，冷冻干燥，得到玉米多肽粉末，其质量和提取率如表所示。
[0068]
实施例2
[0069]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0070]
(1)调节100g玉米发酵醪的ph至4.8-5，加入淀粉糖化酶、纤维素酶和半纤维素酶，其中糖化酶添加量为固体干重的0.08％，纤维素酶添加量为固体干重的0.4％，半纤维素酶添加量为固体干重的0.3％，先在110w下超声1.5h后在200rpm条件下酶解25h，酶水解全过程保持温度为55℃。
[0071]
(2)酶水解后，固液分离，用纯水洗涤固体多次至表面无游离的残糖，将洗涤水与步骤(1)与固液分离所得液相合并，测定液相中葡萄糖的量，结果如表1所示。
[0072]
(3)将上述固体与纯水混合至干物浓度为27重量％，调节ph，加入碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的添加量为固体干重的10％，先在110w下超声0.3h后在200rpm条件下酶解15h，酶水解全过程保持温度为45℃。
[0073]
(4)酶水解后，固液分离，迅速将水解液加热至110℃，持续5min，灭酶，冷却后进行减压浓缩，冷冻干燥，得到玉米多肽粉末，其质量和提取率如表所示。
[0074]
实施例3
[0075]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0076]
(1)调节100g玉米发酵醪的ph至4.8-5，加入淀粉糖化酶、纤维素酶和半纤维素酶，其中糖化酶添加量为固体干重的0.12％，纤维素酶添加量为固体干重的0.5％，半纤维素酶添加量为固体干重的0.2％，先在130w下超声2.5h后在300rpm条件下酶解20h，酶水解全过程保持温度为45℃。
[0077]
(2)酶水解后，固液分离，用纯水洗涤固体多次至表面无游离的残糖，将洗涤水与步骤(1)与固液分离所得液相合并，测定液相中葡萄糖的量，结果如表1所示。
[0078]
(3)将上述固体与纯水混合至干物浓度为33重量％，调节ph，加入碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的添加量为固体干重的15％，先在130w下超声0.8h后在300rpm条件下酶解10h，酶水解全过程保持温度为55℃。
[0079]
(4)酶水解后，固液分离，迅速将水解液加热至90℃，持续5min，灭酶，冷却后进行减压浓缩，冷冻干燥，得到玉米多肽粉末，其质量和提取率如表所示。
[0080]
实施例4
[0081]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0082]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(1)酶解不在超声下进行。
[0083]
实施例5
[0084]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0085]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(3)酶解不在超声下进行。
[0086]
实施例6
[0087]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0088]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(1)和步骤(3)中，均先在搅拌下酶解，然后再在超声下酶解。
[0089]
实施例7
[0090]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0091]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(1)酶解过程中不添加纤维素酶和半纤维素酶，相应提高淀粉糖化酶的量。
[0092]
实施例8
[0093]
本实施例用于说明本发明提供的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0094]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(3)中，将碱性
蛋白酶替换为等量的酸性蛋白酶。
[0095]
对比例1
[0096]
本对比例用于说明参比的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0097]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，步骤(1)和步骤(3)中的酶解均不在超声的条件下进行。
[0098]
对比例2
[0099]
本对比例用于说明参比的从玉米发酵醪中提取玉米多肽的方法
[0100]
按照实施例1的方法从玉米发酵醪中提取玉米蛋白，不同的是，将步骤(1)省去。
[0101]
表1
[0102][0103][0104]
通过表1的结果可以看出，本发明采用超声法和糖酶辅助提取，显著提高了提取效率，缩短了提取时间，同时还能够获得葡萄糖含量较高的糖液。
[0105]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

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