酵母定点双DSB同步诱导模型的构建方法与流程

酵母定点双dsb同步诱导模型的构建方法
技术领域
[0001]
本发明属于基因工程技术，尤其是一种酵母定点双dsb同步诱导模型的构建方法。


背景技术：

[0002]
dsb是一种非常严重的dna损伤，若不及时修复，则会导致基因突变、诱发癌症等。dsb主要通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)来进行修复，构建可化学或物理诱导的dsb是研究上述dna损伤途径必不可少的工具。传统的dna损伤模型多用电离辐射、化学诱变剂等来诱导，并不能很好地将损伤类型限制在单一dsb损伤，还常常伴随dna单链断裂(ssb)、碱基突变以及dna双链交联等。此外，自然条件下细胞内dsb的产生通常不止一个，研究多个dsb同步产生时的毒理作用，以及机体的修复过程，具有重要的生物医学基础理论意义和使用价值。
[0003]
如图1所示，电离辐射、化学诱变剂等外界因素诱导的dna损伤类型复杂，且位点随机，无法有效研究hr、nhej等特定修复dsb的分子信号通路。本文构建了一个能稳定诱导产生双dsb定点产生的模型，两个dsb的间隔距离可根据需要改变，因而不仅可以排除其他损伤类型的干扰，更重要的是可研究同步产生的“聚集型”dsb相对于单个dsb，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程。鉴于“聚集型”dna损伤是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。
[0004]
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种定点同步双dsb模型的构建方法。
[0006]
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]
一种酵母定点双dsb同步诱导模型的构建方法，步骤如下：
[0008]
⑴
设计上、下游引物，引物两端加上i-scei识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的i-scei基因的表达盒及kanmx筛选基因gal-i-scei-kanmx从质粒pgsku扩增下来；
[0009]
⑵
设计第二段引物进行第二次pcr扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；
[0010]
⑶
使用转化方法，将pcr扩增得到的gal-i-scei基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；
[0011]
⑷
含有gal或其他启动子所控制表达i-scei基因的酵母，激活启动子时，就能够表达i-scei内切酶，进而识别两端预先放置的i-scei识别位点并进行切割，从而产生双dsb。
[0012]
而且，所述步骤
⑴
中上游引物为seqno.1，下游引物为seqno.2；
[0013]
dna聚合酶反应体系：ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna聚合酶0.5μl，2.5mm的dntp1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl；
[0014]
dna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、
延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0015]
而且，所述步骤
⑵
中上游引物为seqno.3，下游引物为seqno.4；
[0016]
dna聚合酶反应体系：ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna聚合酶0.5μl，2.5mm的dntp1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl；
[0017]
dna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0018]
而且，所述步骤
⑶
中上游引物为seqno.5，下游引物为seqno.6。
[0019]
而且，所述步骤
⑴
中酿酒酵母诱导型启动子为半乳糖启动子gal、己糖转运载体或乙醇脱氢酶-。
[0020]
而且，所述步骤
⑴
中能够根据需要通过重叠延伸pcr引入一段无用序列，从而调节两个dsb的间隔距离。
[0021]
而且，所述步骤
⑴
中i-scei基因的表达盒包括半乳糖启动子、i-scei内切酶、kanmx/潮霉素/诺尔斯菌素筛选标记。
[0022]
本发明取得的优点和积极效果为：
[0023]
1、本发明建立了一种在酵母基因组的任何位点稳定诱导、同步产生两个dsb的方法，并可根据需要设置两个dsb的间隔距离。这一方法稍作延伸，即可在基因组的任何位置，同步产生多个dsb，是一个强大的dna修复应答研究模型。特别适用于研究同源重组修复(hr)和非同源末端连接修复(nhej)，以及不同修复途径间的协同及互补机制，可以用于人体或其他生物的细胞。
[0024]
2、多个dsb同步产生的“聚集型”dna损伤是癌症放疗及众多化疗药物的特征损伤类型，本发明所建立的双dsb定点诱导模型，与传统的电离辐射和化学诱变剂等诱导的随机dna损伤相比，只诱导单纯的dsb损伤，不仅可排除其他类型dna损伤的干扰，更重要的是可在基因组的任何位置诱导“聚集型”dsb的产生，从而可精准获取多个dsb同时产生时，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程，是研究抗癌药物毒理及精准医疗的强有利工具。
[0025]
3、本发明构建了一个能稳定诱导产生双dsb定点产生的模型，两个dsb的间隔距离可根据需要改变，因而不仅可以排除其他损伤类型的干扰，更重要的是可研究同步产生的“聚集型”dsb相对于单个dsb，对机体的特殊危害，以及细胞修复应答的协同过程。鉴于“聚集型”dna损伤是癌症放疗及众多化疗药物所产生的特征损伤类型，这一模型是研究细胞信号通路及药物毒理的强大工具。
附图说明
[0026]
图1为现有技术中产生dsb损伤的主要方法示意图；
[0027]
图2为本发明双dsb同步诱导模型的一种构建示意图；可通过调节间隔序列(基因之间没有遗传效应的dna片段)的长短来产生不同间隔长度的dsb；
[0028]
图3为本发明中验证双dsb定点损伤模型构建是否成功示意图；实验组1-5显示扩增出3620bp的条带，表明间隔序列为3620bp的双dsb损伤模型构建成功。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0030]
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
[0031]
一种酵母定点双dsb同步诱导模型的构建方法，步骤如下：
[0032]
⑴
设计上、下游引物，引物两端加上i-scei识别位点，用上、下游引物将酿酒酵母诱导型启动子控制的i-scei基因的表达盒及kanmx筛选基因gal-i-scei-kanmx从质粒pgsku扩增下来；
[0033]
⑵
设计第二段引物进行第二次pcr扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp；
[0034]
⑶
使用转化方法，将pcr扩增得到的gal-i-scei基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功；
[0035]
⑷
含有gal或其他启动子所控制表达scei基因的酵母，激活启动子时，就能够表达i-scei内切酶，进而识别两端预先放置的i-scei识别位点并进行切割，从而产生双dsb。可以如图2所示。
[0036]
较优地，所述步骤
⑴
中上游引物为seqno.1，下游引物为seqno.2；
[0037]
dna聚合酶反应体系：ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna聚合酶0.5μl，2.5mm的dntp1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl；
[0038]
dna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0039]
较优地，所述步骤
⑵
中上游引物为seqno.3，下游引物为seqno.4；
[0040]
dna聚合酶反应体系：ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna聚合酶0.5μl，2.5mm的dntp1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl；
[0041]
dna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0042]
较优地，所述步骤
⑶
中上游引物为seqno.5，下游引物为seqno.6。
[0043]
较优地，所述步骤
⑴
中酿酒酵母诱导型启动子为半乳糖启动子gal、己糖转运载体或乙醇脱氢酶-。
[0044]
较优地，所述步骤
⑴
中能够根据需要通过重叠延伸pcr引入一段无用序列，从而调节两个dsb的间隔距离。
[0045]
较优地，所述步骤
⑴
中i-scei基因的表达盒包括半乳糖启动子、i-scei内切酶、kanmx/潮霉素/诺尔斯菌素筛选标记。
[0046]
具体地：
[0047]
一种酵母中双dsb模型的构建方法，步骤如下：
[0048]
⑴
在质粒中构建由半乳糖启动子(gal)控制的i-scei基因的表达盒(gal-i-scei)及添加必要的抗性筛选基因(hyg，kanmx等)。i-scei是一类由内含子编码的归位内切酶，含235个氨基酸。此内切酶能特异性地识别含18个非对称核苷酸的dna序列(tagggataacagggtaat)，在含有此碱基序列的位点处将dna切割，形成dsb。类似的内切酶还有多种，可根据需要灵活选用。
[0049]
⑵
通过pcr扩增gal-i-scei基因序列，设计的pcr上、下游引物两端分别添加i-scei酶所识别的dna序列(tagggataacagggtaat)，以及基因组整合所需要的同源臂。根据需要调整两个i-scei酶识别序列的插入位置，以便产生不同距离间隔的双dsb。为有效的将gal-i-scei整合到目标生物基因组的特定位点处，同源臂的长度应大于80bp。
[0050]
⑶
使用化学转化法或其他转化方法，将pcr扩增得到的gal-i-scei基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功。
[0051]
⑷
含有gal或其他启动子所控制表达i-scei基因的酵母，激活启动子时，即可大量表达i-scei内切酶，进而识别两端预先放置的i-scei识别位点并进行切割，从而产生双dsb。
[0052]
更为具体地，相关制备及检测如下：
[0053]
一种酵母定点双dsb同步诱导模型的构建方法，具体步骤如下：
[0054]
⑴
设计上、下游引物f1、f2，引物两端加上i-scei识别位点，用f1、f2将半乳糖启动子(gal)控制的i-scei基因的表达盒及kanmx筛选基因(gal-i-scei-kanmx)从质粒pgsku扩增下来。该引物设计的两个dsb的间隔距离为3620，可根据实验需要通过重叠延伸pcr引入一段间隔序列(基因之间没有遗传效应的dna片段)，从而调节两个dsb的间隔距离。f1序列：tttcagaggtcgcctgacgctagggataacagggtaatatacgcaaaccgcctctccc，f2序列：tcccaatttttcagttgaaaatagggataacagggtaatgtcaccaaagaaccaagggg；
[0055]
pgsku是可公开获取的质粒，i-scei基因的表达盒是从pgsku质粒上直接扩增出来的目的片段。pgsku图谱连接：https://www.addgene.org/72243/。
[0056]
fastpfudna聚合酶反应体系：ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，fastpfudna聚合酶0.5μl，dntp(2.5mm)1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl。
[0057]
fastpfudna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0058]
⑵
设计第二段引物f2、r2进行第二次pcr扩增，使上、下游引物的同源臂为70-80bp。f2:atcaaattcgatgactggaaattttttgttaatttcagaggtcgcctgacgc；r2:atgaaaagccggttccggcgctctcacctttcctttttctcccaatttttcagttgaaa。该引物设计的插入位点为-号染色体91055-91143处，插入位点可根据不同的实验需求更改。
[0059]
fastpfudna聚合酶反应体系:ddh
2
o15.5μl，上游引物1μl,下游引物1μl，fastpfudna聚合酶0.5μl，dntp(2.5mm)1μl，10
×
pfubuffer5μl，dna模板1μl。
[0060]
fastpfudna聚合酶程序设定：预变性96℃2min设置1个循环，变性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min设置32个循环，后延伸72℃7min设置1个循环。
[0061]
⑶
使用化学转化法或其他转化方法，将pcr扩增得到的gal-i-scei基因序列整合到酿酒酵母基因组上，利用筛选标记基因获得成功整合的菌株，并设计验证引物验证是否构建成功。上游引物：caagtaattggttgtttggc；下游引物：tagccagtttgttgaaagcttggt。其中，对照组(w)：不能用验证引物扩增出条带；实验组(1-5)：能用引物扩增出3620bp的片段；结果如图3所示；
[0062]
⑷
含有gal或其他启动子所控制表达i-scei基因的酵母，激活启动子时，即可大量表达i-scei内切酶，进而识别两端预先放置的i-scei识别位点并进行切割，从而产生双
dsb。
[0063]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除