一种靶向抗凋亡蛋白BFL-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂的制作方法

一种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂
技术领域
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本发明属于生物工程领域，涉及一种多肽，具体来说是一种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂。


背景技术：

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中国是世界上的癌症大国，2017年中国恶性癌症新发病例数为380万例，癌症死亡人数为26万人。国家统计局的数据显示，恶性肿瘤已成为中国人口的主要死因之一。目前，淋巴瘤是全球增长最迅速的恶性肿瘤之一，其每年发病率平均增加4％。近年来，我国恶性淋巴瘤发病率上升加快，已跻身我国十大恶性肿瘤的榜单。恶性淋巴瘤的耐药性与复发性给社会和家庭带来了巨大的经济和心理负担,也为肿瘤的治愈带来了巨大的挑战。细胞凋亡又叫程序性细胞死亡，是一个极其重要的生物学过程，在细胞命运和细胞稳态中起着至关重要的作用。很多肿瘤的治疗，比如化疗、放疗甚至是生物治疗的根本就是诱导细胞凋亡从而达到治疗肿瘤的目的。研究表明，抗凋亡蛋白bfl-1是淋巴癌、白血病以及恶性黑色素瘤等癌基因的驱动子，与这些癌症的耐药性密切相关，比如bfl-1高表达的淋巴癌细胞对bcl2和bcl-xl的抑制剂产生耐药性，而在黑色素瘤中，bfl-1的高表达导致肿瘤细胞的耐药和转移。因此开发靶向bfl-1的选择性抑制剂为解决恶性淋巴癌等肿瘤的耐药性带来了新的希望。bfl-1蛋白属于bcl-2家族的一员，由于bcl2家族的高同源性，目前开发的bcl2抑制剂为广谱抑制剂，对bfl-1缺乏选择性。bfl-1与配体蛋白bh3结构域相互结合的部位有半胱氨酸，而其他同源蛋白如bcl2或者bcl-xl等蛋白不具有该结构，为设计选择性bfl-1共价抑制剂提供了结构基础。
[0003]
长期以来人们关注的治疗性药物主要集中在两类：小分子药物(small molecules)、蛋白类药物(biologics)。小分子药物靶向的化学空间具有一定的局限性，蛋白类药物存在稳定性差以及无法穿透细胞膜，这两类治疗性药物由于其自身生物物理性质的局限性，并不能有效覆盖这所有已确证的重要分子靶点。多肽类药物则是另一类引起人们广泛关注和兴趣的靶向分子。与生物大分子类似，多肽类分子对于靶点也有较高的结合力与选择性，相对于小分子类药物具有更小的脱靶效应。而多肽在体内的代谢产物为氨基酸，最大限度地降低了毒性。传统的多肽类药物由于氨基酸残基数目有限，无法有效形成复杂二级结构，在生理溶液中有很高自由度并呈无规则线性状态，不仅降低了其特异性同时容易被蛋白酶所降解。并且多肽类药物的细胞膜穿透能力不是很好。通过化学手段修饰多肽将其稳定成为有二级结构的构象，不仅能够增加其对蛋白酶的稳定性，还能增强多肽的细胞膜穿透能力，并且还能够通过降低多肽与靶点结合时的熵变从而提高多肽与靶点的结合能力。通过各种化学修饰手段，将参与多种蛋白-蛋白相互作用的二级结构单元提取出来进行修饰，不仅通过稳定他们的二级构象来模拟原始蛋白质的相互作用，更重要的是通过修饰可以使得这些蛋白质二级结构单元具备穿透细胞膜的能力，进而靶向细胞内蛋白-蛋白相互作用。
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与其他bcl2家族的抗凋亡蛋白类似，bfl-1具有保守的疏水性“凹槽”口袋与促凋
亡蛋白bh3结构域结合，该结构基础为开发靶向bcl2抗凋亡蛋白提供了依据。bh3结构域为一段疏水性的α螺旋多肽，早期开发的多肽抑制剂主要是模拟促凋亡蛋白的bh3结构设计的，比如早期美国哈佛大学walensky教授基于凋亡蛋白bim和bid的bh3螺旋多肽设计的全碳氢侧链稳定多肽抑制剂saha的“sahb”，能有效激活白血病细胞内的凋亡通路，抑制体内外白血病细胞的增殖。结构生物学研究发现，当bfl1与促凋亡蛋白noxa结合时，noxa的第25位半胱氨酸c25与bfl-1第55位半胱氨酸空间距离大约为有利于形成二硫键。由于其他抗凋亡蛋白在bh3结合的位置没有半胱氨酸，bfl-1的c55位氨基酸为靶向设计bfl1的选择性共价抑制剂提供了思路。
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2016年，美国哈佛大学的walensky教授和澳大利亚昆士兰大学的fairlie教授先后报道了靶向bfl-1的选择性共价抑制剂，该多肽抑制剂由全碳氢侧链的方法进行稳定提高多肽的稳定性和穿膜能力，同时该多肽的c25引入丙烯酰胺基团，当多肽抑制剂与bfl-1相互作用时，多肽侧链上的丙烯酰胺基团在空间靠近时与bfl-1的半胱氨酸进行共价反应，形成蛋白-多肽共价偶联体，显著提高了多肽抑制剂对bfl-1的选择性抑制效果。基于锍盐稳定的多肽配体可高效选择性的对蛋白半胱氨酸共价修饰，多肽上的甲硫氨酸和半胱氨酸与双卤代试剂发生双烷基化反应构建了侧链带单个锍盐的稳定多肽方法学，该方法简单高效，能提高多肽的血清稳定性、细胞穿膜能力以及对靶点的亲和力。


技术实现要素：

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针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂，所述的这种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂要解决现有技术中的药物用于治疗黑色素瘤或者胰腺癌的效果不佳的技术问题。
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本发明提供了一种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂，其结构式如下所示，
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进一步的，其氨基酸序列是：ac-cyclic(miaqc)lr(aib)igd(aib)fnayyarr(seq id no.1所示)。
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本发明还提供了上述的稳定多肽类蛋白共价抑制剂在制备用于靶向抗凋亡蛋白bfl-1的药物中的用途。
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本发明还提供了上述的稳定多肽类蛋白共价抑制剂在制备用于治疗bfl-1高表达黑色素瘤或者胰腺癌的药物中的用途。
[0012]
本发明采用了多肽上甲硫氨酸-半胱氨酸与双烷基化试剂反应形成单个锍盐的方法来稳定靶向bfl-1的锍盐环肽。采用之前文献报道的基于鋶盐稳定的多肽配体对蛋白半
胱氨酸进行选择性共价修饰方法，当该环肽配体与靶点蛋白bfl-1相互识别时，环肽上的锍盐与蛋白bfl-1半胱氨酸在空间靠近下发生亲核反应实现对蛋白的共价修饰。通过sds-page分析和质谱分析证明该多肽通过与靶蛋白相互识别后与靶蛋白bfl-1的c55发生共价反应。通过免疫印迹和免疫共沉淀分析证明该多肽可以与细胞内高表达bfl-1蛋白发生共价反应。细胞增殖实验和凋亡实验也证明该多肽通过凋亡途径杀死高表达bfl-1的肿瘤细胞如黑色素瘤细胞a375和胰腺癌细胞miapaca-2。
[0013]
本发明通过荧光偏振检测、免疫印迹分析、流式细胞分析、细胞存活等实验，证实该多肽可以很好的结合bfl-1蛋白，并通过多肽上的锍盐与蛋白bfl-1上的半胱氨酸发生共价反应，阻断抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的结合，促凋亡蛋白的释放促进肿瘤细胞的凋亡。
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本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的多肽上甲硫氨酸与半胱氨酸与双烷基化试剂反应形成锍盐环肽，既能稳定多肽，又能与靶蛋白相互作用位点上的半胱氨酸发生共价修饰，具有对bfl-1高表达黑色素瘤细胞系a375和胰腺癌细胞系miapaca-2的抑制作用。本发明的多肽分子通过锍盐与bfl-1共价反应，阻断抗凋亡蛋白bfl-1与促凋亡蛋白的结合。本发明有益于解决高表达bfl-1肿瘤细胞耐药的问题，同时拓宽稳定多肽的应用范围。
附图说明
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图1为锍盐共价抑制剂多肽分子合成方式图。
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图2为多肽与bfl-1蛋白共价结合图谱。
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图3为多肽与bfl-1蛋白共价结合一级质谱图。
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图4为多肽与bfl-1蛋白共价结合二级质谱图。
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图5为流式细胞分析多肽穿膜能力。
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图6为人黑色素瘤细胞系a375中
fam
b4-mc与bfl-1的共定位图。
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图7为人黑色素瘤细胞系a375中
fam
b4-mc与线粒体的共定位图。
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图8为多肽在细胞体内与bfl-1共价反应。
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图9为不同多肽对人黑色素瘤细胞a375增殖抑制能力。
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图10为不同浓度多肽b4-mc对人黑色素瘤细胞a375凋亡水平的影响。
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图11是抗肿瘤共价多肽抑制剂通过与bfl-1共价反应促进细胞凋亡示意图。
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图12是本发明的一种靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂的结构式。
具体实施方式
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下面结合附图对本发明进一步说明。
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实施例1
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本发明采用之前文献报道(d.wang,m.yu,et al.chem.sci.10,4966-4972)的锍盐稳定多肽技术，通过多肽上甲硫氨酸与半胱氨酸与双烷基化试剂反应形成锍盐环肽，既能稳定多肽，又能与靶蛋白相互作用位点上的半胱氨酸发生共价修饰，阻断抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的结合，促凋亡蛋白的释放促进肿瘤细胞的凋亡。
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发明人合成了多条不同的多肽，并对其中七条多肽进行了重点研究，如表1所示。
然后通过对bfl-1的共价反应来筛选共价效果好的多肽分子。图11是抗肿瘤共价多肽抑制剂通过与bfl-1共价反应促进细胞凋亡示意图。
[0031]
表一：不同靶向抗凋亡蛋白bfl-1的稳定多肽类蛋白共价抑制剂分子序列
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其中，b4、b6和b7序列一样，但是关环方式不一样，b4是1,3,5-三溴甲基苯，b6是2，6-二(溴甲基)吡啶，b7是e-1,4-二(溴甲基)-2-丁烯。
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实施例2多肽的制备及分离纯化步骤：
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按照氨基酸序列固相合成多肽，制备上述稳定多肽的核心步骤如下(以b4-mc为例)：
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具体操作步骤(图1)为：
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(1)多肽固相合成：称取rink amide mbha树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(dcm)，鼓氮气溶胀30min。加入50％(v/v)吗啡啉的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液，鼓氮气30min，脱去fmoc保护基团。用dmf和dcm交替洗涤树脂之后，将配好的fmoc-aa-oh(5eq,0.4m,dmf)溶液，6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)(5eq，0.38m，dmf)溶液，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气1h。抽掉反应液，按上述方法洗树脂后
2细胞。
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为了评估该多肽对不同癌细胞的杀伤能力，选择了bfl-1高表达细胞系a375和miapaca-2作为代表。同时选择bfl-1不表达细胞系hela细胞、a549细胞和正常细胞hek293t来排除多肽b4-mc的非特异性毒性。
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细胞活力通过mtt测定法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylt-etrazolium bromide))。细胞在96孔板中以4
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接种，用溶于培养基(5％血清)的多肽处理24h，将mtt加入培养基孵育4h。然后加入dmso溶解沉淀物，采用酶标仪在490nm测定吸光度。其中未处理的细胞存活率为100％。
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结果表明，多肽b4-mc只有对a375和miapaca-2细胞具有明显的细胞增殖抑制以及浓度依赖性。对hela、a549和hek 293t细胞基本没有毒副作用。这些结果表明该多肽的特异性。(图9)
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实施例7多肽b4-mc对细胞凋亡作用的影响
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接下来，通过细胞凋亡实验来研究多肽b4-mc是否通过凋亡途径杀死癌细胞。将多肽处理后的细胞用胰酶收集，采用fitc annexin v凋亡试剂盒检测，用流式细胞仪分析。结果表明b4-mc通过细胞凋亡途径杀死a375(图10)。

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