提高肿瘤细胞微卫星不稳定状态检测灵敏度的前处理体系的制作方法

2021-02-02 12:02:44|

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[0001]
本发明属于生物医学领域中的临床分子诊断检测技术。本发明涉及一种提高微卫星不稳定(msi)检测灵敏度的方法，特别是可以应用于液体活检的msi检测方法。

背景技术：

[0002]
微卫星序列是指核心序列为1～6个碱基的短串联重复结构，这些重复序列分布在整个人类基因组中。在dna复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象被称之为微卫星不稳定(microsatellite instability，msi)。
[0003]
微卫星不稳定(msi)现象在很多实体瘤中都存在。msi发生率最高的肿瘤类型包括子宫内膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、结直肠癌(10-15％)、甲状腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壶腹癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织瘤、头颈癌、肾癌等中发生率也有一定比例(2-10％)。
[0004]
以研究msi相对较早和较为深入的结直肠癌为例：有大量证据表明，dmmr/msi-h是ii期结直肠癌患者预后良好的一个标志物，对于具有dmmr/msi-h肿瘤的ii期结直肠癌患者，3/4级分化(低分化)不再认为是高危因素；对于具有dmmr/msi-h的ii期结直肠癌患者，给予5-fu辅助化疗不能带来生存获益，反而会对患者不利。因此，ii期crc患者是否需要辅助化疗，需要综合考虑临床高危因素和msi状态；随着免疫治疗相关研究的深入以及多款pd1/pd-l1药物上市，msi检测作为预测pd1/pd-l1药物适用性主要指标之一，其检测需求更加重要和广泛。
[0005]
检测msi结直肠癌的方法主要有检测错配修复蛋白缺陷的免疫组织化学法和基于msi检测的pcr方法。免疫组织化学检测4种主要的错配修复蛋白mlh1、msh2、msh6、pms2，通过检测错配修复蛋白缺失情况反应肿瘤的msi状态。免疫组化的方法易受组织固定、染色条件等的影响而出现假阳性或假阴性结果，而且操作相对复杂、检测周期较长。
[0006]
pcr方法通过扩增特定微卫星序列，比较正常组织与肿瘤组织微卫星序列长度的差异判断肿瘤msi状态。美国国立癌症研究所(nci)于1996和2004年颁布了bethesda指南及该指南修订版。该指南对遗传性非息肉结直肠癌及散发性结直肠癌的msi检测，推荐检测体系包括五个位点，其中两个位点为单碱基重复，三个为双碱基重复。同时，bethesda指南确定msi的标准为：>30％的位点不稳定为msi-h，10％～30％为msi-l，<10％为mss。这一判定标准得到大多数临床和科研工作者认可。由于双碱基重复位点多态性、峰型判定困难以及双碱基重复位点常引起msi-l检测结果，所以很多研究者认为双碱基重复位点不适合用于检测msi，应该使用更多的单碱基重复位点。目前已有多款检测单碱基重复位点的体系或产品被广泛应用于科研与临床领域，如本公司基于专利cn201810126825.6的检测试剂盒，作为首款获得国家药品监督管理局批准的msi检测产品，可用于临床检测。
[0007]
液体活检一般指通过体液样本(如外周血、尿液、脑脊液等)而非传统组织样本进行检测的方法，主要检测对象包括循环肿瘤dna(ctdna)、循环肿瘤细胞(ctc)和肿瘤特异抗体等。液体活检具有快速简便、无创、样本量充足、可连续性监测等优点，目前已成为个体化
精准治疗研究和应用的热点之一。
[0008]
常规的msi检测是针对肿瘤组织进行的检测，如果能实现液体活检，将大幅扩展msi检测的应用场景，同时为临床治疗提供更充分有效的辅助信息。液体活检msi检测相对于传统msi检测，可能的新应用领域包括：早期肿瘤筛查；术前判断msi状态以选择适宜的治疗方案，如新辅助放化疗；术后复发检测；难以手术取样组织的检测，等。
[0009]
液体活检在技术上首要的问题是，如何在大量的正常野生型基因组背景下有效检测目的片段。对于通常的ctdna液体活检检测，其检测目的片段是来源于肿瘤组织的突变dna，多数是序列突变或非正常融合的dna，相对而言还是较易与正常基因组dna相区别。然而对于msi检测，其目的片段是不稳定的微卫星位点序列，更难以与正常基因组dna相区别。以nr27位点为例，正常基因组在该位点序列包含27个连续的a碱基，目的片段不稳定的微卫星位点通常包含15-24个连续的a碱基。从27个连续的a背景下区分15-24个连续的a，显然要比区分snp、插入、缺失、融合等更为困难。常规技术方案(包括pcr、qpcr、hrm、ngs等)几乎无法实现所需的灵敏度和特异性。
[0010]
为了解决上述困难，有研究者通过收集循环肿瘤细胞(ctc)回避灵敏度问题，但利用ctc的检测大幅增加了检测的成本和周期，而且对样本量的要求也更大，这些都不利于其在实际应用中使用。
[0011]
目前已有少数通过不同的方法提高msi检测检测灵敏度的报道，如：通过cold-pcr技术在pcr中富集不稳定位点并抑制野生型扩增，可以实现对hsp110一个位点的检测(how-kit a,daunay a,buhard o,et al.major improvement in the detection of microsatellite instability in colorectal cancer using hsp110 t17 e-ice-cold-pcr[j].human mutation,2017.)；通过name-pro方法在扩增前倾向性消化野生型dna，从而富集不稳定位点(ladas i,yu f,leong kw,et al.enhanced detection of microsatellite instability using pre-pcr elimination of wild-type dna homo-polymers in tissue and liquid biopsies[j].nucleic acids research,2018.)；在pcr扩增体系中引入与野生型结合能力更强的blocker，以降低野生型扩增效率，从而提高不稳定片段比例(专利202010054790.7)。cold-pcr虽然操作较简单，但对反应条件要求较高，难以同时检测多个微卫星位点。blocker只是一定程度提高不稳定模板相对野生型模板的扩增效率，而且如何保证抑制特异性也是问题。name-pro反应条件较为稳定，但增加了消化步骤，操作略为繁琐。后两种方法都有报道可以实现多个位点同时检测，但是由于多重检测体系中同时存在多个blocker或者多个消化探针，需要保证它们之间不要发生相互作用，以保证它们正常发挥作用并保证特异性。由于msi位点序列的特殊性，blocker或消化探针都需要带有大量的a或t，也就是说它们在序列上非常相近，易于发生相互作用，进而导致抑制或者消化效率不足够高，使得在最终检测结果中还存在非常大量的野生型信号，影响了检测灵敏度。

技术实现要素：

[0012]
鉴于以上不足，在已有方法基础上，本发明提出一种相对简化的消化探针设置方式，尽量降低它们之间的相互作用，实现高灵敏度的多重msi检测，并进一步优化反应条件，尤其是使用优化的消化探针，使体系对野生型的消化效率显著提高，满足液体活检需要。
[0013]
为了达到此目的，我们把每个位点的两条消化探针设置为一条对msi位点特异但不区分稳定型和不稳定型的探针和一条对稳定型特异的探针。进一步地，我们把所有位点对稳定型特异的探针设置为含有相同的重复碱基(a或t)。
[0014]
一个用于在msi检测前进行依赖消化探针的模板dna消化体系，所扩增和检测的位点包含一个或多个单碱基重复位点，所述msi检测中的每个位点设计有两条消化探针，其特征是：
[0015]
1)一条特异性消化探针与对应位点单碱基重复序列互补，探针所包含重复序列碱基数量与对应位点野生型目的片段单碱基重复序列的重复数相同，或少一至两个；
[0016]
2)另一条非特异性消化探针与对应位点单碱基重复区域周边的区域互补，与对应位点单碱基重复区域没有重叠；
[0017]
两条探针，它们所对应的目的位点的互补序列没有重叠，不会形成互补双链结构。
[0018]
所述msi检测的位点有多个，各个位点对应的特异性消化探针所包含的单碱基重复序列的重复碱基是相同的，均为连续的多个a或连续的多个t。
[0019]
所述两条探针3
’
端区域碱基添加有修饰，或以修饰剪辑取代正常碱基，以提升3
’
端结合能力，所述修饰包括mgb修饰、荧光基团修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、空间子修饰。
[0020]
如一组消化探针：
[0021]
表一一组优化的消化探针
[0022]
消化探针探针序列nr21-acgcgtttacaaacaagaaaagtgttgcnr21-rtttttttttttttttttttttagcaa(+c)anr24-actgggcccagggaagagaagagtttnr24-rttttttttttttttttttttttttgt(+g)agnr27-accatgcttgcaaaccactggtaaaanr27-rtttttttttttttttttttttttttttac(+c)agbat25-atctttagagaatcactcccacttacbat25-rtttttttttttttttttttttttttga(+g)aabat26-attgcagcagtcagagcccttaacctbat26-rttttttttttttttttttttttttttac(+c)tmono27-aagcgtgggagacagagcaagactctmono27-rtttttttttttttttttttttttttttga(+g)g
[0023]
其中“+”表示lna修饰。
[0024]
整个检测流程包括核酸提取、消化、消化后模板的扩增、检测。其中除消化外的各步均为常规方法。本发明的核心在于消化步骤，其原理如下：消化体系中加入待检测核酸样本，以及与野生型目的片段模板互补的消化探针，消化探针可以与野生型目的片段模板形成较稳定的双链结构。如果样本中存在微卫星不稳定的目的片段，由于其长度与消化模板不一致，不能形成稳定的双链结构。再向体系中加入有消化双链dna活性的核酸外切酶，该酶可以切断双链dna，但它不消化单链dna。在适当的条件下，野生型目的片段由于形成双链而被全部或大部分消化掉，而存在微卫星不稳定的目的片段由于不能形成双链结构而得以
保留，最终达到富集微卫星不稳定的目的片段的效果。
[0025]
常规的消化探针设置方式是，两条探针都对野生型片段特异。这样两条探针肯定会有一定的重叠区域。由于msi位点的特殊性，两条探针都要包含大量连续的互补碱基。以nr27位点为例，需要从27个连续的a背景下区分24个或更少的连续的a，两条探针一条要包含约27个a，另一条要包含约27个t。在保证每条探针与目的模板结合能力和特异性的同时，还要避免含有27个a的探针和27个t的探针形成互补双链，否则探针双链就会被消化双链dna活性的核酸外切酶降解。虽然这可以通过在探针重复序列两侧增加不同长度侧翼序列来实现，但对引物设计和操作条件的要求较为严格，反应稳定性可能受到影响。更重要地，当体系内同时含有多个位点的消化探针时，由于每条探针都含有二十多个连续的a或t，他们之间相互影响的可能性大大增加，使得消化能力和特异性都受到影响。这也就是多重消化效果不如单重消化效果的主要原因，如实施例1。
[0026]
我们的方案是，把每个位点的两条消化探针设置为一条对msi位点特异但不区分稳定型和不稳定型的探针和一条对稳定型特异的探针。这样的目的是避免了探针之间的结合和相互影响，保证多重消化检测时的扩增效率、灵敏度和特异性。虽然其中不含重复序列的探针不体现特异性，会完全降解对应位点所有序列，无论是稳定型还是不稳定型，但是可以有另一条探针实现特异性地对稳定型模板的降解。
[0027]
两条探针中一条与常规探针一样，包含单碱基重复序列和部分周边序列；另一条设置在单碱基重复序列附近区域，但不含有连续碱基，与前一条探针完全没有任何重叠区域。这样两条探针完全不会形成互补的双链结构。而且各个位点不含有连续碱基的探针之间也不会形成互补的双链结构。
[0028]
进一步地，我们把所有位点对稳定型特异的探针设置为含有相同的重复碱基(a或t)，这样，它们之间也完全不会形成互补的双链结构。
[0029]
通过以上设置，我们可以完全从序列上防止探针之间相互结合，从而保证多重消化检测时的扩增效率、灵敏度和特异性。
[0030]
本发明方法的特点：
[0031]
通过将每个位点的一条探针设置在重复碱基周围区域，所有位点的另一条探针设置为含有相同的重复碱基(a或t)，从而避免探针之间相互结合和相互影响，保证多重消化检测时的扩增效率、灵敏度和特异性。
[0032]
本发明在原有探针的基础上进行序列优化，使得利用少量外周血cfdna能够快速准确判读nr-21、nr-24、nr-27、mono-27、bat-25、bat-26这6个单核苷酸重复位点的不稳定性状态。检测结果在判定msi状态的基础上，可实现对lynch综合征进行排查以及在预测药物疗效和评价预后方面提供参考。
附图说明
[0033]
图1为以外周血样本进行常规msi检测的检测结果图。
[0034]
图2为以肿瘤组织石蜡包埋组织样本进行常规msi检测的检测结果图。
[0035]
图3为以外周血样本，使用单个常规消化探针经消化后，进行msi检测的检测结果图。
[0036]
图4为以外周血样本，使用五个常规消化探针经消化后，进行msi检测的检测结果
图。
[0037]
图5为以外周血样本，使用六个优化的消化探针消化后，进行msi检测的检测结果图。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0039]
下述所用的试剂盒均为市售。
[0040]
实施例1：常规msi检测。
[0041]
常规msi检测需要对同一个体的两个样本同时进行检测，通常以肿瘤组织样本为检测样本，外周血或者癌旁组织样本为对照样本。通过比较肿瘤组织样本结果与对照样本结果是否存在差异，判定样本是否存在msi。
[0042]
本实施例中所检测的样本来自一位直肠癌患者。对照样本为术前采集的外周血样本a，检测样本为石蜡包埋的肿瘤组织样本b。
[0043]
1.1 dna提取
[0044]
采用常规血液提取试剂盒对外周血样本a进行dna提取；采用常规石蜡包埋组织dna提取试剂盒对肿瘤组织样本b进行dna提取，提取完毕后用紫外分光光度计测定浓度，并稀释成10ng/ul。
[0045]
1.2 pcr扩增
[0046]
利用本公司生产的微卫星不稳定检测试剂盒(专利cn201810126825.6)进行微卫星不稳定检测。该试剂盒扩增包含pcr反应液、引物混合液、酶混合液等。引物混合液包括6个单核苷酸重复位点、3个对照位点共9对引物，引物序列如下：
[0047]
nr-21引物：
[0048]
正向引物：5
’-
gagtcgctggcacagttcta-3
’
[0049]
反向引物：5
’-
fam-atattcctactccgcattcacac-3
’
[0050]
nr-24引物：
[0051]
正向引物：5
’-
ttgctgaattttacctcctgac-3
’
[0052]
反向引物：5
’-
tamar-attgtgccattgcattccaa-3
’
[0053]
nr-27引物：
[0054]
正向引物：5
’-
ggaaacaaagcattgaagtctgcagt-3
’
[0055]
反向引物：5
’-
hex-gaggttctgagtcgataatactagc-3
’
[0056]
bat-25引物：
[0057]
正向引物：5
’-
ctcgcctccaagaatgtaagt-3
’
[0058]
反向引物：5
’-
hex-tctgcattttaactatggctc-3
’
[0059]
bat-26引物：
[0060]
正向引物：5
’-
ggacagtttgaactgactactt-3
’
[0061]
反向引物：5
’-
fam-agctcctttataagcttcttcagt-3
’
[0062]
mono-27引物：
[0063]
正向引物：5
’-
gaaatggtgggaacccag-3
’
[0064]
反向引物：5
’-
tamar-ggtggatcaaatttcacttgg-3
’
detection of microsatellite instability using pre-pcr elimination of wild-type dna homo-polymers in tissue and liquid biopsies[j].nucleic acids research,2018.)，5对探针针对nr-21、bat-26、bat-25、nr-27、nr-24五个位点。探针序列信息如下：
[0088]
nr-21探针：
[0089]
正向探针：5
’-
ctggccttttttttttttttttttttt-3
’
[0090]
反向探针：5
’-
tgttgctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagg-3
’
[0091]
nr-24探针：
[0092]
正向探针：5
’-
gtcctatttttttttttttttttttttttgtg-3
’
[0093]
反向探针：5
’-
gtctcacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatag-3
’
[0094]
nr-27探针：
[0095]
正向探针：5
’-
taaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcca-3
’
[0096]
反向探针：5
’-
ctttttttttttttttttttttttttttaccag-3
’
[0097]
bat-25探针：
[0098]
正向探针：5
’-
tgatttttttttttttttttttttttttgagaac-3
’
[0099]
反向探针：5
’-
tcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatcaaaaaaa-3
’
[0100]
bat-26探针：
[0101]
正向探针：5
’-
gtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggtta-3
’
[0102]
反向探针：5
’-
cttttttttttttttttttttttttttacctga-3
’
[0103]
消化体系包含：pcr反应液3.75ul，酶反应液0.75ul，所要消化位点对应的探针1ul，模板1ul，用无核酸酶纯水配制成10ul反应体系。置于pcr仪上进行消化反应，反应条件如下：98℃反应2min，添加dsn酶(0.5u)，61℃消化20min，95℃失活2min。反应结束后立即进行下一步操作。
[0104]
对同一样本，术前采集的外周血样本a，分别进行对各个位点的单独消化(即只加入某一位点的两条探针)和五位点共同消化(即加入所有五个位点的10条探针)。
[0105]
2.3 pcr扩增
[0106]
利用本公司生产的微卫星不稳定检测试剂盒进行微卫星不稳定检测。10ul扩增体系中加入1ul消化产物作为模板。其余所有操作步骤同实施例1。
[0107]
2.4检测与数据分析
[0108]
检测与数据分析方法同实施例1。单位点消化检测的结果如图3，五位点共同消化的检测结果如图4。
[0109]
2.5结果判读
[0110]
单位点消化检测的结果如图3，其中abcde分别为nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26位点单独消化检测后的结果，只截取了对应位点区域。通过与常规外周血检测结果(图1)对比，在nr-21、bat-26、bat-25、nr-27、nr-24五个经过消化处理的位点上，可以明确看到不稳定的产物。通过与常规肿瘤组织检测结果(图2)比较，各个不稳定产物的位置与组织样本中的不稳定样本大小一致，说明检测到的不稳定产物确实是来源于肿瘤组织的cfdna。
[0111]
五位点共同消化检测的结果如图4。五位点共同消化检测的结果(图4)在每个位点
的表现都较单位点消化结果(图3)差，体现在不稳定产物信号低。其中nr21和nr24位点，已无法有效检出不稳定产物，bat-26、bat-25、nr-27三个位点中不稳定产物信号也显著低于单位点消化结果(图3)。
[0112]
通过增加消化步骤，可以实现不通过肿瘤组织，仅以外周血样本实现msi检测。但其检测效果并不足够理想。5个位点都会有相当比例的野生型目的片段扩增产物，表明对野生型目的片段消化不完全，说明消化效率不够高以至于还有较大量野生型模板未被有效消化。另一方面，还有部分位点微卫星不稳定的目的片段扩增产物量非常低甚至无法有效识别(nr21和nr24)，这表明消化对不稳定的目的片段消化特异性不够好，有一定比例不稳定的目的片段也被消化损失了。
[0113]
值得注意地，单位点消化结果显著优于五位点共同消化的结果，这说明不同消化探针之间存在相互影响。由于每条探针都含有二十多个连续的a或t，他们之间相互影响的可能性大大增加，使得消化能力和特异性都受到影响。
[0114]
实施例3：使用优化的消化探针消化的msi检测
[0115]
针对实施例2结果中表现出的消化探针之间存在的不利相互影响，我们使用一组根据本申请设计原则进行优化后的msi消化探针进行消化。所检测样本与实施例2所检测样本为同一样本，即实施例1中术前采集的外周血样本a。
[0116]
3.1 cfdna提取
[0117]
采用实施例2中从外周血样本a中提取出的cfdna进行本次实验。
[0118]
3.2探针消化
[0119]
使用的消化探针为经过优化的6对消化探针，针对位点nr-21、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26和mono-27。消化探针序列信息见表一。
[0120]
消化体系试剂配制及反应条件同实施例2。
[0121]
3.3 pcr扩增
[0122]
扩增体系试剂配制及反应条件同实施例2。
[0123]
3.4检测与数据分析
[0124]
检测与数据分析方法同实施例1。检测结果如图5。
[0125]
3.5结果判读
[0126]
使用优化后探针消化的msi检测结果如图5。将常规外周血检测结果(图1)作为对照，可以看到经消化的检测结果(图5)在所有6个经过消化处理的位点上，可以明确看到不稳定的产物。说明该患者肿瘤为msi高度不稳定型。通过与常规肿瘤组织检测结果(图2)比较，各个不稳定产物的位置与组织样本中的不稳定样本大小一致，说明检测到的不稳定产物确实是来源于肿瘤组织的cfdna。
[0127]
将使用优化后探针消化的msi结果(图5)与非优化探针消化的结果(图4)对比，图5中突变峰与野生峰的比例明显高于图4，部分位点野生产物信号完全不可见或低至接近基线。这说明优化后的探针作用效果更加有效，以至于可以接近完全消化掉所有野生型模板并且不稳定模板没有显著损失。实际上，使用优化后探针消化的msi结果(图5)在大多数位点的检测效果要优于使用常规探针的单位点消化结果(图3)。
[0128]
发明人认为正是对消化探针的设计优化带来了上述性能的提升，由于从序列上将各消化探针的序列完全区分开，使其不存在可能出现形成双链的序列条件，从而保证了消
化的特异性和消化能力。

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