一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用的制作方法

2021-02-02 11:02:50|

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[0001]
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用。

背景技术：

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随着人们生活水平的提高，加上不健康的生活方式，肥胖越来越成为一个值得关注的问题。由于肥胖导致的诸如糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病，严重威胁人类的健康。目前已经发现多种分子机制参与调控体重，并基于此发现了多种减肥治疗方案，然而，这些药物或者缺乏靶标专一性，或者能够影响靶蛋白下游的多种信号通路，产生多种副作用，而不能长期使用。所以，安全高效的减肥方法是目前急需的。
[0003]
g蛋白偶联受体(gpcr)是市场上大约30％的药物的作用靶标，也是新药研发的重要靶向。一般当gpcr和配体结合后，会通过与gtp结合蛋白(简称g蛋白)互作，传导信号，调控基因转录，其后涉及grks(gpcr kinases)磷酸化和β-arrestin蛋白质结合，结合β-arrestin后将抑制g蛋白和gpcr的相互作用。
[0004]
研究证实黑皮质素4受体(melanocortin 4receptor，mc4r)是参与体重调控的重要gpcr，进食后会诱发黑皮质素肽、α和β-促黑激素的释放，进而激活mc4r表达的神经元，从而减少进食。啮齿类动物中靶向敲除mc4r基因会导致体重增加。一些肥胖的孩童和成年人中则检测出mc4r基因突变，突变体导致gα
s-介导的camp聚集减少。前人基于此遗传发现研发减肥药，第一代mc4r激活剂虽然能够减肥，却导致血压增高，限制其应用。第二代mc4r激动剂由于脱靶，影响黑皮质素1受体，也限制了其广泛应用。
[0005]
通过研究发现某些mc4r突变体与肥胖密切相关，因为这些突变体会导致mc4r功能丧失，和mc4r基因敲除有类似的功效。当然，也发现某些功能获得的mc4r突变体与低bmi和降低患肥胖、二型糖尿病及冠状动脉疾病几率等密切相关。
[0006]
β-arrestin 2的结合能够将mc4r从g蛋白上释放，进而促使mc4r脱敏、内吞。而选择性干扰β-arrestin 2和mc4r的相互作用，阻止β-arrestin 2到mc4r的聚集，可能阻止mc4r脱敏和内吞，消除影响。因此，研究和开发阻断β-arrestin 2和mc4r相互作用的干扰多肽，将具有很好的减肥作用。

技术实现要素：

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本发明的第一个目的是提供一种具有抑制肥胖作用的多肽，能够进入细胞内靶向结合β-arrestin 2，从而阻断β-arrestin 2和mc4r的相互作用。
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为实现上述目的，本发明提供一种具有抑制肥胖作用的多肽，名称为tat-mc4r1，为seq id no：1所示的氨基酸序列的多肽。
[0009]
其中，序列表中seq id no：1所示的氨基酸序列由29个氨基酸残基组成，序列1中第1-11位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域，该区域可以被具有相同作用的其他序列替换；序列1中第12-39位氨基酸残基构成能够取代mc4r1受体和β-arrestin 2蛋白质
no.5)和下游引物5'catcgggtaccctagcaaaactggtcatcacagtca 3'(seq id no.6))和报告基因载体pg5luc，共转染hek293细胞，加入1μm ndp-αmsh处理细胞，继续培养48h之后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(beyotime rg009)使用glomax-multi detection system(promega)检测荧光素酶的活性。
[0029]
由图1结果可知，mc4r1多肽片段能够与β-arrestin 2发生相互作用，这种相互作用依赖于激动剂的存在。
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(2)具有穿膜活性的tat-mc4r1多肽获得
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通过pcr获得mc4r1受体羧基末端多肽序列，其上游引物：ccatctcgagatgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtcggagtcaagaactgaggaaaaccttcaaagagatcgtctgtt(seq id no.7)，下游引物：5'cgtcggatccatatctgctagacaagtcacaaaggcctcccaggggatagcaacagacgatctctttgaagg 3'(seq id no.8)，在上游引物内插入tat编码序列，在上下游引物分别加入xhoi和bamhi酶切位点，通过酶切连接法构建大肠杆菌表达载体pwaldo-tat-mc4r1，转化bl21(de3)获得重组子。
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接种重组子菌株于500ml lb培养基中，37℃培养过夜，转种50ml培养物至1l lb培养基中，37℃培养至od
600
约0.5～0.6，加入终浓度为0.2mm的iptg，20℃继续培养20h左右，5000g离心15min收集细胞。
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将细胞悬浮于100ml裂解缓冲液中(20mm tris-hcl，ph 7.5；300mm nacl和5％甘油)，加入50μg/ml溶菌酶，200u dnasei和1片蛋白酶抑制剂(cocktail)，1200bar高压破碎细胞，10,000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片；将上清与已经平衡的ni-nta柱子结合(平衡缓冲液：20mm tris-hcl，ph 7.5；300mm nacl和5％甘油)，让含有目的蛋白质的样品自然通过柱子；冲洗缓冲液(20mm tris-hcl，ph 7.5，300mm nacl，5％甘油和30mm咪唑)洗100ml，再用洗脱缓冲液(20mm tris-hcl，ph7.5，300mm nacl，5％甘油和300mm咪唑)洗脱，收集蛋白质样品，通过akta pure m系统分子筛柱子(缓冲液：20mm tris-hcl，ph7.5，300mm nacl，5％甘油)进行纯化，此步骤能够获得较高纯度的tat-mc4r1多肽和gfp融合的产物。
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为了进一步获得tat-mc4r1多肽，收集的蛋白质样品加入200μl浓度为3mg/ml的tev(烟草花叶病毒)蛋白酶，4℃酶切过夜。样品重新通过ni柱，将没有酶切完全的含有gfp的蛋白质和酶切后的gfp去掉。最终收集的tat-mc4r1多肽样品，通过截留分子量1,000的浓缩管，浓缩至5mg/ml左右。sds-page检测样品的纯度>95％，可以用于功能研究。纯化的多肽tat-mc4r1氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码的核苷酸序列如seq id no.2所示。
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实施例2多肽tat-mc4r1的应用研究
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小鼠每天腹腔注射10mg/kg的tat-mc4r1多肽，对照组给与等量对照多肽，连续给药15天，检测小鼠进食情况和小鼠体重变化。
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由图2、图3可知，tat-mc4r1能够明显减少小鼠进食量，促使小鼠体重降低。且给予多肽后与对照组相比，小鼠健康未发现明显异常。

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