一种乳酸乳球菌及微生态制剂和应用的制作方法

[0001]
本发明属于水产微生态领域，特别涉及一种乳酸菌菌株及其在水产动物养殖中的应用。


背景技术：

[0002]
鳜(siniperca chuatisi)隶属于鲈形目暖鲈科鳜亚科，是我国著名的四大淡水名鱼之一，因其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富而受到消费者的青睐。但是，目前鳜鱼的养殖模式依然是活饵饲喂，不仅成本高，工作量大，而且饵料鱼本身也是病原的载体，使鳜鱼产业的发展受到了多种限制因素。人为驯化鳜鱼摄食配合饲料势在必行，经过多年的研究发现，通过驯化鳜鱼可以摄食配合饲料，但是在驯化率、生长性能等方面还有许多问题要解决。而且不论哪种养殖模式，鳜鱼病害已经成为阻碍其发展的重要因素。其中细菌性疾病较为普遍，一般也是其他疾病的并发症，流行水温及季节较广，且从鱼卵到成鱼均会造成较大的危害。
[0003]
抗生素能够有效降低水产动物的细菌性病害的发病率，多年来被广泛应用在鳜鱼的养殖中。但是近年来，抗生素滥用导致的耐药性问题愈来愈突出。为了食品的安全和消费者的身体健康，我国已全面禁止饲料中添加抗生素。针对这种情况，寻找一种安全、无残留的抗生素替代品已成为当前水产养殖的热点。微生态制剂自身会分泌多种物质，拮抗病原微生物的生长，调节动物免疫，且无耐药性、无残留，是替代抗生素的首选。其中，乳酸菌是使用较为广泛的一种微生态制剂。已有大量的研究表明乳酸菌具有调节机体平衡，提供生长，增强免疫并产生具有抑菌活性的代谢产物。但是，不同的乳酸菌菌株的性能差异较大，且不同来源的同一种菌株性能也有区别。一般情况下，在应用中要求菌株来源与应用的目标相同或相似，才会使其发挥有效的作用。
[0004]
目前，关于鳜鱼乳酸菌的应用较少，且因为鳜鱼终生只摄食活饵的天性，使有益菌很难得到真正的应用。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述问题，本发明提供了一株鳜鱼源乳酸乳球菌。
[0006]
本发明的乳酸乳球菌(lactococcus lactis)菌株3-c-18，其保藏编号为cgmcc no.17347。
[0007]
所述的乳酸乳球菌菌株3-c-18从鳜鱼肠道中分离纯化获得。
[0008]
本发明还提供含有乳酸乳球菌菌株3-c-18的微生态制剂。
[0009]
在本发明一个实施方案中，所述的微生态制剂包含所述乳酸乳球菌的发酵液。
[0010]
其中，所述乳酸乳球菌活菌数为1
×
10
8
cfu/ml～1
×
10
10
cfu/ml。
[0011]
本发明还提供含有所述的乳酸乳球菌或所述微生态制剂的饲料。
[0012]
其中，饲料中所述乳酸乳球菌活菌数为1
×
10
5
cfu/g～1
×
10
7
cfu/g。
[0013]
本发明还提供所述乳酸乳球菌的发酵方法，采用液体发酵培养基，培养基组成：蔗
糖2％，蛋白胨0.9％，酵母粉0.1％，nacl 0.25％，caco
3 0.1％，mgso
4
·
7h
2
o 0.1％，消泡剂0.0625％；发酵条件：自然ph，发酵温度35～38℃，转速80～120rpm，通气比1：0.1～0.5vvm，罐压0.03～0.07mpa。
[0014]
本发明还提供所述的乳酸乳球菌或所述微生态制剂在鳜鱼养殖中的应用。
[0015]
本发明还提供所述的乳酸乳球菌在制备抑制嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌药物中的应用。
[0016]
具体的，包括利用该菌株或者复合微生态制剂制备成嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的抑制剂。
[0017]
本发明所提供的乳酸乳球菌(lactococcus lactis)菌株3-c-18，于2019年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmcc no.17347。
[0018]
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0019]
(1)本发明的乳酸乳球菌3-c-18具有产酸、耐酸、不溶血等特性，且体外实验表明，乳酸乳球菌3-c-18对多种水产病原菌具有抑制作用，尤其对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌都有较强的抑菌性，可以作为抗生素促生长剂替代品，具有良好的应用前景。
[0020]
(2)本发明的乳酸乳球菌3-c-18来源于鳜鱼肠道，能够明显提高鳜鱼肝脏组织的健康水平，改善其营养物质代谢，降低饵料系数，能够有效的促进鳜鱼的生长，可作为饲料伴侣应用于鳜鱼的养殖中。
[0021]
(3)在养殖中，本发明的乳酸乳球菌3-c-18对常见的水产有害菌嗜水气单胞菌的感染具有有一定抵抗作用，具备较好的应用前景。
附图说明
[0022]
图1为乳酸乳球菌3-c-18(l.lactis)在培养基平板上生长的照片。
[0023]
图2为添加乳酸乳球菌3-c-18发酵液对鳜鱼的生长性能和饲料利用效率影响。
[0024]
图3为添加乳酸乳球菌3-c-18发酵液对鳜鱼血清生化指标的影响。
[0025]
图4为添加乳酸乳球菌3-c-18发酵液对鳜鱼肝脏生化指标的影响。
[0026]
图5为添加乳酸乳球菌3-c-18发酵液对鳜鱼抗嗜水气单胞菌感染的影响。
[0027]
图6为添加乳酸乳球菌mg1614发酵液对鳜鱼的生长性能和饲料利用效率影响。
[0028]
图7为添加乳酸乳球菌mg1614发酵液对鳜鱼抗嗜水气单胞菌感染的影响。
[0029]
图8添加乳酸乳球菌s6-2发酵液对鳜鱼的生长性能和饲料利用效率影响。
[0030]
图9添加乳酸乳球菌s6-2发酵液对鳜鱼抗嗜水气单胞菌感染的影响。
具体实施方式
[0031]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032]
实施例1乳酸乳球菌(l.lactis)3-c-18的筛选
[0033]
1、初筛
[0034]
从鳜鱼养殖池塘中取鳜鱼五条，用无菌操作方法解剖鳜鱼，取出肠道内容物，混匀，放入冻存管中。分别称取5g样品，加入45ml的无菌磷酸盐缓冲液(pbs)，振荡混匀制成菌
悬液，并用pbs稀释至合适的梯度，涂布于乳酸菌培养基(mrs)上，培养获得64株疑似乳酸菌菌株。
[0035]
将获得的64株菌株，继续在mrs培养基上分离纯化。
[0036]
将分离纯化的菌株接种在溴甲酚紫乳糖蛋白胨(bcp)培养基上进行培养，观察菌株产酸现象培养基由紫色变为黄色的即为待选菌株。
[0037]
将获得的待选菌株接种在溶血平板上进行培养，观察溶血现象。选取没有溶血现象的菌株进行下一步实验。
[0038]
pbs缓冲液的配制方法：分别配制浓度为0.1mol/l的kh
2
po
4
和na
2
hpo
4
·
2h
2
o，全部溶解后，等体积混合均匀。
[0039]
mrs液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，k
2
hpo
4
·
3h
2
o 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，mgso
4
·
7h
2
o 0.58g，mnso
4
·
h
2
o 0.25g，蒸馏水1000ml，ph值为6.4，121℃灭菌15min。
[0040]
mrs固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，k
2
hpo
4
·
3h
2
o 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，mgso
4
·
7h
2
o 0.58g，mnso
4
·
h
2
o 0.25g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph值为6.4，121℃灭菌15min。
[0041]
bcp固体培养基：酵母膏25g，蛋白胨5g，乳糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph 7.2，115℃灭菌30min。
[0042]
2、复筛
[0043]
(1)待选菌株的产酸能力
[0044]
将待选菌株的种子液按照1％的量接种到mrs液体培养基中，37℃静置培养，在不同的时间点取培养液，测定其ph值。选取产酸相对较快、较多的菌株作为待选菌株。
[0045]
(2)待选菌株的耐酸能力
[0046]
将待选菌株的种子液按照1％的量接种到不同ph(6.5、5.5、4.5、3.5、2.5和1.5)的mrs液体培养基中，培养24h。培养期间，在不同的时间点取培养液，测其od值。从中选取耐酸效果较好的菌株。
[0047]
实验结果表明乳酸乳球菌3-c-18的产酸性能较好，发酵72h时培养液的ph为4.3。当培养液的ph高于4.5时，菌株可以正常生长，且生长较快。
[0048]
平板菌落计数法检测乳酸乳球菌3-c-18菌液的活菌数约为1
×
10
10
cfu/ml。
[0049]
乳酸乳球菌3-c-18(l.lactis)在培养基平板上生长的照片如图1所示。
[0050]
实施例2乳酸乳球菌(l.lactis)3-c-18的抑菌研究
[0051]
供试菌株：实施例1中筛选得到的菌株乳酸乳球菌3-c-18，分离自市售mg1614乳酸乳球菌菌粉的mg1614和实验室内保藏菌株乳酸乳球菌s6-2，保藏号为cgmcc no.9135。
[0052]
指示菌：金黄色葡萄球菌、溶血弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
[0053]
分别活化供试菌株和指示菌。
[0054]
分别配制含有2％琼脂的纯琼脂平板培养基和含有1％琼脂的lb软平板培养基，121℃灭菌20min。
[0055]
灭菌完成后，先拿出纯琼脂平板培养基，此时lb软平板培养基处于保温状态，倒平板，每个平板约10ml。待琼脂平板凝固后，将灭过菌的5个牛津杯均匀放到已经凝固的平板上。拿出lb软平板培养基，当温度降到约50℃时，分别向培养基中入100μl的指示菌菌液，混
匀，均匀倒入放有牛津杯的琼脂平板中。
[0056]
待抑菌平板凝固后，用镊子小心拔出牛津杯。在平板上标记供试菌株加样的位置，向孔中加入100μl供试菌株的菌液，37℃培养约24h。观察抑菌圈的有无及大小，并记录。实验结果见表1。
[0057]
表1乳酸乳球菌抑菌圈的直径(单位：mm)
[0058][0059]
注：-表示没有明显的抑菌圈
[0060]
试验结果表明：乳酸乳球菌3-c-18对嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌都有较强的抑菌性，且抑菌效果优于mg1614和s6-2。因此，此菌株是选择性抑制嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌较强的菌株。
[0061]
实施例3乳酸乳球菌(l.lactis)3-c-18的发酵和菌液制备
[0062]
乳酸乳球菌3-c-18的发酵：所用发酵培养基配制为：蔗糖2％，蛋白胨0.9％，酵母粉0.1％，nacl 0.25％，caco
3 0.1％，mgso
4
·
7h
2
o 0.1％，消泡剂0.0625％。按比例配制成发酵液，初始ph约6.8。121℃灭菌30min，降温至37℃，向其中接入菌龄为14h的种子液，接种量为2％。发酵期间保持转速100rpm，通气比1:0.25vvm，罐压0.05mpa。培养至10h为发酵终点，检测乳酸乳球菌3-c-18的活菌数约为7.4
×
10
10
cfu/ml。
[0063]
向发酵液中加入灭过菌的高浓度盐水，抑制乳酸菌的发酵，发酵液中nacl的终浓度为10％。
[0064]
实施例4乳酸乳球菌(l.lactis)3-c-18在鳜鱼养殖中的应用
[0065]
本实验研究了不同浓度乳酸菌菌液添加对鳜鱼的影响。实验用乳酸菌为上述从鳜鱼肠道内分离得到的乳酸乳球菌3-c-18。
[0066]
实验用鳜鱼为翘嘴鳜，经过驯化，可以较好的摄食人工配合饲料。实验用饲料为福建大北农水产科技集团生产的鳜鱼专用配合粉料，加水制成软颗粒投喂。
[0067]
将初始体重为47.74
±
5.70g的鳜鱼640尾随机分为四组，一个对照组和三个实验组，四组初始体重没有显著性差异。每个处理组4个重复，每个重复40尾鱼，实验周期为60天。
[0068]
对照组鳜鱼饲喂无添加乳酸菌的饲料，实验组1、2和3饲喂添加了乳酸乳球菌3-c-18菌液的饲料，最终饲料中的有效菌数分别约为1
×
10
5
cfu/g、1
×
10
6
cfu/g、1
×
10
7
cfu/g。
[0069]
实验结束后，禁食24h后取样，测量相关指标。检测鳜鱼的生长性能，血清和肝脏生化指标，并对实验后的剩余鳜鱼进行攻毒实验。
[0070]
从图2可以看出，实验组1和实验组2的鳜鱼增重率和饲料系数显著优于对照组和实验组3(p﹤0.05)，这表明适当浓度的乳酸菌发酵液对生长有促进作用。
[0071]
由图3可以看出实验组鳜鱼血清谷草转氨酶(ast)活性和丙二醛(mda)含量均显著
低于(p﹤0.05)对照组；且饲料中添加一定浓度的乳酸乳球菌3-c-18可以降低鳜鱼血清碱性磷酸酶(alp)、谷丙转氨酶(alt)活性和葡萄糖(glu)的含量，提高过氧化氢酶(cat)活性。以上结果表明，饲料中添加适量的乳酸乳球菌3-c-18可以改善鳜鱼的营养物质代谢，提高其健康水平。
[0072]
由图4可以看出，饲料中添加乳酸乳球菌3-c-18可显著提高肝脏酸性磷酸酶(acp)、碱性磷酸酶(alp)和溶菌酶(lzm)的活性，表明鳜鱼摄食添加了乳酸乳球菌3-c-18后，肝脏健康水平提高。
[0073]
由图5可以看出，饲料中添加乳酸乳球菌3-c-18可显著提高鳜鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。
[0074]
实验结果表明：在鳜鱼养殖中添加适量的鳜鱼源乳酸乳球菌3-c-18，可以促进生长，改善鳜鱼的营养物质代谢，提高肝脏组织的健康水平，增强对嗜水气单胞菌感染的抵抗力。
[0075]
实施例5非鳜鱼源乳酸乳球菌(l.lactis)mg1614在鳜鱼养殖中的应用
[0076]
本实验研究了非鳜鱼源乳酸菌菌液不同浓度添加到饲料中对鳜鱼的影响。实验用乳酸菌为乳酸乳球菌mg1614分离自mg1614乳酸乳球菌菌粉。在实验室活化后，制成一定浓度的菌液。
[0077]
对照组鳜鱼饲喂无添加乳酸菌的饲料，实验组1、2和3饲喂添加了乳酸乳球菌mg1614菌液的饲料，最终饲料中的有效菌数分别约为1.8
×
10
5
cfu/g、2.1
×
10
6
cfu/g、1.2
×
10
7
cfu/g。
[0078]
实验用鳜鱼、实验设计及养殖管理同上述实施例4。
[0079]
从图6可以看出实验组鳜鱼的肥满度、增重率、成活率和饲料系数与对照组之间没有显著性差异。这表明非鳜鱼源乳酸菌mg1614发酵液对鳜鱼生长作用不明显。
[0080]
由图7可以看出，饲料中添加高浓度的乳酸乳球菌mg1614可显著提高鳜鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。
[0081]
实施例6：非鳜鱼源乳酸乳球菌(l.lactis)s6-2在鳜鱼养殖中的应用。
[0082]
本实验研究了非鳜鱼源乳酸菌菌液不同浓度添加到饲料中对鳜鱼的影响。实验用乳酸乳球菌s6-2为实验室内保藏菌株，保藏号为cgmcc no.9135。在实验室活化后，制成一定浓度的菌液。
[0083]
对照组鳜鱼饲喂无添加乳酸菌的饲料，实验组1、2和3饲喂添加了乳酸乳球菌s6-2菌液的饲料，最终饲料中的有效菌数分别约为2.3
×
10
5
cfu/g、1.4
×
10
6
cfu/g、1.6
×
10
7
cfu/g。
[0084]
实验用鳜鱼、实验设计及养殖管理同上述实施例4。
[0085]
从图8可以看出实验组鳜鱼的肥满度、成活率和饲料系数与对照组之间没有显著性差异。实验组2和3鳜鱼的增重率与对照组也没有显著性的差异，这表明非鳜鱼源乳酸菌s6-2发酵液对鳜鱼生长作用不明显。
[0086]
由图9可以看出，饲料中添加乳酸乳球菌s6-2对鳜鱼抵抗嗜水气单胞菌感染没有显著性的影响。
[0087]
尽管已经对上述各实施案例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施案例做出另外的变更和修改，所以，以上所述仅为本发明的实
施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

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