嵌合载体的制作方法

嵌合载体
相关申请的交叉引用
[0001]
本专利申请要求2018年4月23日提交的共同未决的美国临时专利申请第62/661,320号的权益，将所述临时专利申请通过引用以其整体并入本文。关于联邦赞助的研究和开发的声明
[0002]
本发明是在政府支持下由国立卫生研究院的国家过敏及传染性疾病研究所完成的，项目编号为1zia000372-33。政府享有本申请的某些权利。以电子方式提交的材料通过引用并入
[0003]
通过引用以其整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“742179_st25.txt”，日期为2019年4月5日的一份153,440字节ascii(文本)文件。发明背景
[0004]
人类病原体是重要的健康问题。尽管进行了持续的研究，但仍需要预防和治疗病原体感染(尤其是来自病毒如人呼吸道合胞病毒(“rsv”))的改进方法。发明简述
[0005]
本发明的实施方案提供了活的嵌合的非人单股反链病毒目(mononegavirales)载体，其允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质.
[0006]
本发明的另一实施方案提供了组合物，其包含本发明的载体和药学上可接受的载体。
[0007]
本发明的另一实施方案提供了引发对至少一种人病原体的免疫应答的方法，其包括向人施用本发明的非人单股反链病毒目载体、或本发明的组合物。
[0008]
本发明的另一实施方案提供了制备活的嵌合的非人单股反链病毒目载体的方法，所述载体允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质，所述方法包括(a)在非人单股反链病毒目载体中插入编码来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质的非天然基因。
[0009]
本发明的另一实施方案提供了用于引发免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含(a)本发明的组合物，以及(b)至少一个用于容纳所述组合物的容器。
[0010]
出乎意料的是，如本文讨论的，鼠肺炎病毒(mpv)基因组是用于提供针对非mpv病毒的宿主保护的理想载体，与其它类型的载体相比具有若干优点。
[0011]
mpv基因组的一个优点是它相对较小(<15kb)并且可以容易地通过反向遗传学进行操纵。具体地，可以通过标准重组dna方法将改变引入到病毒基因组的克隆的cdna中，并且可以在转染的组织培养细胞中回收所得的修饰的病毒。特别地，可以将表达一种或多种异源抗原，如来自异源病原体的保护性抗原的一种或多种额外基因引入到mpv基因组。
[0012]
mpv基因组的另一个出乎意料的优点是mpv基因组中的非天然插入物在体外和体内复制期间相对稳定。例如，插入了rsv f蛋白的mpv载体是非常稳定的，并且尽管进行了持续的研究，但发明人尚未观察到从mpv基因组中缺失f蛋白序列。这是出乎意料的，因为通常在一些类型的载体中插入的序列可在一些(或几次)复制之后被缺失。此外，载体中的插入
序列通常在复制期间累积点突变，使其表达沉默；然而，这仅偶尔发生在mpv基因组中。
[0013]
此外，mpv生物学的几个特征使其用作载体(尤其是在人中)是安全的。例如，mpv是在呼吸道粘膜的浅表上皮细胞中复制的亲肺病毒，因此不是高侵入性或系统性病毒。另外，mpv是细胞质rna病毒，并且不整合到宿主基因组中或以其他方式干扰宿主基因组。感染是急性的，没有已知的长期感染。此外，这种类型的病毒(非分段负链rna病毒)在病毒基因组之间具有非常低的重组发生率(spann等人,j.virol.,77:11201-11211(2003)(通过引用以其整体并入本文))。
[0014]
另外，mpv在人中很可能通过宿主范围限制而天然地减毒，正如它在非人灵长类中一样。啮齿动物是mpv的天然宿主，由于宿主范围限制，该病毒在非人灵长类中高度减毒，因此推测在人类中也是高度减毒的。通过宿主范围限制来减毒副粘病毒或肺炎病毒被认为是多基因的和稳定的，如通过在非人灵长类和人类中牛副流感病毒3型的宿主范围限制所示例的(skiadopoulos等人.,j.virol.,77:1141-1148(2003)(通过引用以其整体并入本文))。
[0015]
此外，没有mpv感染人的证据，并且人类缺乏针对该病毒的获得性免疫力(brock等人,j.virol.,86:5829-5843(2012)(通过引用以其整体并入本文))。尽管mpv和rsv(后者是与mpv最密切相关的人病原体)的蛋白质之间有10-60％的氨基酸序列同一性，但rsv特异性免疫不能交叉中和mpv或交叉保护抵抗mpv(在小鼠模型中测试的)。因此，预期本发明实施方案的基于mpv的载体在人类中的使用不应受到现有免疫，特别是针对rsv的免疫的限制。
[0016]
另一个优点是mpv在呼吸道粘膜中复制并诱导呼吸道的局部免疫以及全身免疫。因此，mpv载体预示对呼吸道病原体特别有效。附图中几个视图的简述
[0017]
图1描述了显示在第一(f1)、第三(f3)或第四(f4)基因位置上含有作为额外基因添加的rsv f基因的rmpv反基因组的图。mpv基因显示为未填充的矩形，rsv f基因显示为阴影矩形。mpv基因起始(“gs”)和基因终止(“ge”)转录信号分别由未填充的和填充的柱条表示，侧面有包括额外的rsv f基因的每个基因。侧面有rsv f orf的核苷酸序列在每个基因图谱下显示，鉴定了以下特征：rsv f orf(以阴影框表示)，gs和ge转录信号(以粗体显示)，基因间区域(“ig”)，和位于rsv f orf上游以促进有效翻译的“kozak”序列(以双下划线显示，seq id no:63)。
[0018]
图2描述了双重染色噬斑测定的结果，其说明了rmpv载体表达rsv f的稳定性。简而言之，用p1病毒原液的系列稀释液接种vero细胞，并在0.8％甲基纤维素覆盖下孵育4天。固定单层并使用特异性抗体随后使用相应的红外染料缀合的二抗探测rsv f和mpv抗原。rsv f和mpv抗原分别显现绿色和红色，并且在合并时显现黄色。选择代表来自四次独立实验的结果的一个图像。在标记为“mpv抗原”的上排板中，灰度表示红色。在标记为“rsv f”的中间板中，灰度表示绿色。在标记为“合并的”的底排板中，在“rmpv-f1”、“rmpv-f4”和“rmpv-f3”列的板中，灰度表示黄色。在标记为“合并”的底排板中，在“rmpv-空载体”列的板中，灰度表示红色。
[0019]
图3描述了rmpv-rsv-f载体在人a549肺上皮细胞中的多周期生长动力学。用rmpv-f1(具有三角形的虚线)、rmpv-f3(具有空心圆圈的虚线)、rmpv-f4(具有xs的实线)或rmpv-空载体(具有实心黑色圆圈的实线)，以0.1噬斑形成单位(“pfu”，感染性病毒颗粒的数量的
量度)/细胞的感染复数(“moi”)感染a549细胞的复制培养物。在24小时间隔，通过刮擦和涡旋收获两种培养物/病毒/细胞系，制备澄清的上清液并快速冷冻。随后通过噬斑测定一式两份地测定病毒滴度。感染后的天数在x轴上，log
10 pfu/ml在y轴上。数据显示为平均值和平均值的标准误差，尽管在许多情况下，考虑到小的误差界限，误差条被符号遮盖。检测限是0.7log
10 pfu/ml(虚线)。
[0020]
图4描述了rmpv-rsv-f载体在vero细胞中的多周期生长动力学。用rmpv-f1(具有三角形的虚线)、rmpv-f3(具有空心圆圈的虚线)、rmpv-f4(具有xs的实线)或rmpv-空载体(具有实心黑色圆圈的实线)，以0.1pfu/细胞的moi感染vero细胞的复制培养物。在24小时间隔，通过刮擦和涡旋收获两种培养物/病毒/细胞系，制备澄清的上清液并快速冷冻。随后通过噬斑测定一式两份地测定病毒滴度。感染后的天数在x轴上，log
10 pfu/ml在y轴上。数据显示为平均值和平均值的标准误差，尽管在许多情况下，考虑到小的误差界限，误差条被符号遮盖。检测限是0.7log
10 pfu/ml(虚线)。
[0021]
图5描述了用rmpv-rsv-f载体感染vero细胞时的致细胞病变作用。用指定的rmpv-rsv-f载体、空载体或wt rrsv以10pfu/细胞的moi感染vero细胞单层或模拟感染。将培养物在32℃下孵育96小时，并在200x放大率下进行光学显微照相术。所示的图像代表两个独立的实验。模拟感染和rmpv-空载体感染的细胞未显示出任何感染迹象，而wt rsv、rmpv-f1、rmpv-f3和rmpv-f4感染的细胞显示出明显的病毒感染迹象。
[0022]
图6描述了用于评价rsv f蛋白和rmpv蛋白在感染的细胞中表达的蛋白质印迹的结果。在接种(“hpi”)后96小时，使用来自图5中所示实验的感染的细胞制备细胞裂解物。对变性和还原的裂解物进行蛋白质印迹分析。如图6所示，rmpv-f1、rmpv-f3和rmpv-f4(泳道1、2和3)均含有rsv f蛋白(而rmpv-空载体[泳道4]和wt rmpv[泳道5]不含有rsv f蛋白)。
[0023]
图7描述了感染的细胞中rsv f蛋白表达的水平。用小鼠单克隆抗体检测rsv f蛋白。蛋白质条带的定量图来自图6所示的蛋白质印迹分析，并代表三次独立的实验。相对rsv f蛋白表达在y轴上，载体在x轴上列出。显示了标准误差。如图7所示，rmpv-f1、rmpv-f3、rmpv-f4和wt rrsv均表达高水平的rsv f蛋白。
[0024]
图8描述了感染的细胞中rmpv g、n、p、f、ns1和ns2蛋白表达的水平。用针对蔗糖梯度纯化的rmpv病毒体产生的超免疫血清检测mpv g、n和p蛋白。用针对仅表达mpv f蛋白的重组牛痘病毒产生的兔多克隆抗血清检测mpv f蛋白。用各自针对衍生自相应蛋白的合成肽产生的单独兔超免疫血清检测mpv ns1和ns2蛋白。将微管蛋白作为上样对照进行探测，并用于使每个样品标准化。蛋白质条带的定量图来自图5所示的相同实验，并且代表三次独立的实验。每种蛋白质的相对表达显示在y轴上，载体在x轴上列出。显示了标准误差。星号表示统计学显著性(p值小于0.05)。如图8所示，感染的细胞表达每种测试的蛋白。发明详述
[0025]
本发明的实施方案提供了活的嵌合的非人单股反链病毒目载体，其允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质。载体
[0026]
如本文所用，“嵌合”载体是包含非天然遗传信息的载体。例如，非人单股反链病毒目载体，其包含来自人病原体的遗传信息或材料(例如，包含来自人病原体的遗传信息或材料的啮齿动物载体或者包含来自rsv的遗传信息的mpv载体)。
[0027]
如本文所用，“非人单股反链病毒目载体”是天然宿主不是人的单股反链病毒目的病毒。
[0028]
本文所述的载体在提供给人时是减毒的。减毒载体能够在体内复制，但在人宿主中具有低毒力或无毒力。载体减毒可能是由于可降低载体复制和/或毒力的多种因素中的任一种导致的，包括但不限于非天然宿主的感染(宿主范围限制)、一个或多个氨基酸和/或核苷酸取代的存在、异源基因的添加或者载体基因的部分或全部的去除。例如，部分由于宿主范围限制，mpv载体在人中是减毒的。非人单股反链病毒目载体
[0029]
本发明的非人单股反链病毒目载体可以来自单股反链病毒目的任何成员，只要病毒的天然宿主是非人动物。在实施方案中，病毒的天然宿主是非人动物。优选地，病毒的天然宿主是非人哺乳动物。优选地，病毒的天然宿主是在啮齿目中。优选地，病毒的天然宿主在鼠科中。优选地，病毒的天然宿主在鼠亚科中。优选地，病毒的天然宿主是小鼠。
[0030]
病毒是单股反链病毒目的成员，如果其基因组是线性的，通常是非分段的、单链非感染性负极性rna，其在感染细胞和病毒体中被紧密地包裹在核衣壳中；具有反向互补3
’
和5
’
末端；不与蛋白质共价连接；其基因组具有特征性基因顺序3
’-
utr-核心蛋白基因-包膜蛋白基因-rna-依赖性rna聚合酶基因-5
’-
utr(3
’-
n-p-m-g-l-5
’
)；其经由位于基因组3
’
末端的单个启动子的极性顺序转录从其基因组产生5-10个不同的mrna；mrna是5
’
加帽的和聚腺苷酸化的；它通过合成基因组的完全正义拷贝(称为反基因组)来复制；它形成感染性的螺旋核糖核衣壳作为合成mrna、反基因组和基因组的模板；其编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp,l)；和/或它通常产生有包膜的病毒体。
[0031]
非人单股反链病毒目载体可以来自肺病毒科(pneumoviridae)、博尔纳病毒科(bornaviridae)、丝状病毒科(filoviridae)、副粘病毒科(paramyxovirdae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)和目前未分配至科的那些。
[0032]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体来自肺病毒科。来自肺病毒科的非人单股反链病毒目载体可以包括来自偏肺病毒属的那些，例如禽类偏肺病毒种。禽类偏肺病毒种包括禽类偏肺病毒(avian metapneumovirus,“ampv”)。
[0033]
来自肺病毒科的非人单股反链病毒目载体也可以包括来自正肺病毒属的那些，例如牛正肺病毒种和鼠正肺病毒种。牛正肺病毒种包括牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,“brsv”)。鼠正肺病毒种包括鼠肺炎病毒(murine pneumonia virus,“mpv”，先前也称为小鼠肺炎病毒，pvm)。优选地，本发明实施方案的非人载体是mpv。
[0034]
来自博尔纳病毒科(bornaviridae)的非人单股反链病毒目载体可以包括来自博尔纳病毒属的那些，例如，以下物种：眼镜蛇1博尔纳病毒(elapid 1 bonavirus)、哺乳动物1博尔纳病毒(mammalian 1 bonavirus)、哺乳动物2博尔纳病毒(mammalian 2bonavirus)、雀形目1博尔纳病毒(passeriform 1 bonavirus)、雀形目2博尔纳病毒(passeriform 2 bonavirus)、鹦鹉1博尔纳病毒(psittaciform 1 bornavirus)、鹦鹉2博尔纳病毒(psittaciform 2 bornavirus)和水鸟1博尔纳病毒(waterbird 1 bornavirus)。
[0035]
来自丝状病毒科的非人单股反链病毒目载体可以包括来自cuevairus属的奎瓦病毒(lloviu cuevavirus)种。
[0036]
来自副粘病毒科的非人单股反链病毒目载体可以包括来自禽副粘病毒属(avulavirus)的那些，例如禽类禽副粘病毒(avian avulavirus)1-禽类禽副粘病毒13；来自亨尼巴病毒属(henipavirus)的那些，例如松湾亨尼巴病毒(cedar henipavirus)种、加纳蝙蝠亨尼巴病毒(ghanaian bat henipavirus)种、亨德拉亨尼巴病毒(hendra henipavirus)种、mojiang亨尼巴病毒种和尼巴亨尼巴病毒(nipah heniparus)种(例如，尼帕病毒(nipah virus))；来自麻疹病毒属的那些；来自腮腺炎病毒属(rubulavirus)的那些，例如病毒种achimoto腮腺炎病毒1、achimoto腮腺炎病毒2、蝙蝠腮腺炎腮腺炎病毒(bat mumps rubulavirus)、犬腮腺炎病毒(canine rubulavirus)、马普埃拉腮腺炎病毒(mapuera rubulavirus)、menangly腮腺炎病毒、猪腮腺炎病毒(porcine rubulavirus)、猿腮腺炎病毒(simian rubulavirus)、sosuga腮腺炎病毒、teviot腮腺炎病毒、刁曼腮腺炎病毒(tioman rubulavirus)、tuhoko腮腺炎病毒1、tuhoko腮腺炎病毒2、tuhoko腮腺炎病毒3和副流感病毒5。
[0037]
来自弹状病毒科的非人单股反链病毒目载体可以包括来自暂时热病毒属(ephemerovirus)的那些，例如牛发热暂时热病毒(bovine fever ephemerovirus)；来自hapavirus属的那些；来自ledantevirus属的那些；和来自狂犬病毒(lyssavirus)属的那些，例如，欧洲蝙蝠1狂犬病毒(european bat 1lyssavirus)、欧洲蝙蝠2狂犬病毒(european bat 2 lyssavirus)、拉各斯蝙蝠狂犬病毒(lagos bat lyssavirus)、rabies lyssavirus、希莫尼蝙蝠狂犬病毒(shimoni bat lyssavirus)和西高加索蝙蝠狂犬病毒(west caucasian bat lyssavirus)。
[0038]
另外，本发明的载体可以来自本领域技术人员目前未知的单股反链病毒目的病毒(即，天然存在但尚未发现的那些或者尚未通过天然或人工方法产生的那些)。
[0039]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是副粘病毒仙台病毒(sendai virus)，并且人病原体不是埃博拉病毒或呼吸道合胞体病毒。在实施方案中，人病原体是埃博拉病毒或呼吸道合胞体病毒，并且非人单股反链病毒目载体不是副粘病毒仙台病毒。
[0040]
在一个实施方案中，非人单股反链病毒目载体是副粘病毒副流感病毒5，并且人病原体不是rsv、流感病毒或狂犬病毒。在一个实施方案中，人病原体是rsv、流感病毒或狂犬病毒，并且非人单股反链病毒目载体不是副粘病毒副流感病毒5。
[0041]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是弹状病毒水疱性口炎病毒(“vsv”)，并且人病原体不是埃博拉病毒或马尔堡病毒。在实施方案中，人病原体是埃博拉病毒或马尔堡病毒，并且非人单股反链病毒目载体不是副粘病毒弹状病毒水疱性口炎病毒。
[0042]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是新城疫病毒，并且人病原体不是流感病毒。在实施方案中，人病原体是流感病毒，并且非人单股反链病毒目载体不是新城疫病毒。
[0043]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体来自肺病毒科。优选地，非人单股反链病毒目载体来自鼠正肺病毒属。优选地，非人单股反链病毒目载体是mpv。
[0044]
优选地，非人单股反链病毒目载体是感染呼吸道的载体。优选地，非人单股反链病毒目载体来自肺病毒科并且感染呼吸道。
[0045]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体来源于野生型mpv(genbank登录号ay729016)。在实施方案中，可以在反向遗传系统的mpv编码序列中引入突变以产生用于克
隆的独特限制酶位点(参见krempl等人,j.virol.,81(17):9490-501(2007)(通过引用以其整体并入本文))。在实施方案中，限制酶位点可以分别在基因组核苷酸位置4509和8461处包括agei和bstbi。在实施方案中，可以通过密码子对优化来部分修饰l聚合酶orf，目的是增加l蛋白的表达。
[0046]
在实施方案中，mpv载体具有与acgcgaaaaaatgcataacaaaactatcaacctgaaaaaagtt(seq id no:1)具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的基因组启动子。
[0047]
在实施方案中，mpv载体具有与ttgatatctcacaggttgtaaacatagttcttttataattattgttagttaaactattgtgtttgacttcctttgggtatttttttcccgt(seq id no:2)具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的反基因组启动子。
[0048]
在实施方案中，sh与g基因之间以及m2与l基因之间的基因间区域可以通过引入如上文所示的独特限制酶位点(例如，agei和bstbi)来修饰以产生反向遗传系统，并且针对下表1中所示的这些区域显示了修饰序列。表1.mpv转录信号
[0049]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30和/或seq id no:31具有至少95％(即96％、97％、98％、99％或100％)同一性的转录信号。
[0050]
在实施方案中，mpv载体包含核苷酸序列，其编码(以3
’
至5
’
基因顺序列出)：非结构蛋白1(“ns1”)、非结构蛋白2(“ns2”)、核蛋白(“n蛋白”)、磷蛋白(“p蛋白”)、基质蛋白(“m蛋白”)、小的疏水性蛋白(“sh蛋白”)、附着蛋白(g蛋白)、融合蛋白(f蛋白)、m2-1和m2-2蛋白以及聚合酶蛋白(“l蛋白”)。
[0051]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:32至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的ns1的序列(例如，genbank登录号ay729016)。
[0052]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:33具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白ns1。
[0053]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:34至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的ns2的序列(例如，genbank登录号ay729016)。
[0054]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:35具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白ns2。
[0055]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:36至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的n的序列。
[0056]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:37具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白n。
[0057]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:38具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的p的序列。
[0058]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:39具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白p。
[0059]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:40具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的m的序列。
[0060]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:41具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白m。
[0061]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:42具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的sh的序列。
[0062]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:43具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白sh。
[0063]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:44具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的g的序列。
[0064]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:45具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白g。
[0065]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:46具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f的序列。
[0066]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:47具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白。
[0067]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:48具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的m2-1的序列。
[0068]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生具有与seq id no:49至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白m2-1。
[0069]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:50具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的m2-2的序列。
[0070]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生具有与seq id no:51至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白m2-2。
[0071]
在实施方案中，mpv载体具有与seq id no:52具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的l的密码子对优化序列。
[0072]
在实施方案中，mpv载体允许细胞产生与seq id no:53具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的蛋白l。
[0073]
在一些实施方案中，“kozak”序列(gccgccacc(seq id no:63))在aug起始密码子的上游。“kozak”序列可以为翻译起始提供有效的环境。其它序列是本领域技术人员已知的，并且可以用于提高翻译效率。人病原体
[0074]
本发明的载体可以表达来自任何人病原体的蛋白质。如本文所用，“人病原体”是可以在人类中引起感染的病原体。人病原体可以包括病毒、细菌、原生动物、朊病毒和真菌。
[0075]
病原体细菌包括来自以下种的那些：衣氏放线菌(actinomyces israelii)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、百日咳杆菌(bordetella pertussis)、疏螺旋体(borrelia)、布鲁氏菌(brucella)、空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)、衣原体(chlamydia)、鹦鹉热衣原体(chlamydophila psittaci)、梭菌(clostridium)、白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae)、埃立克体(ehrlichia)、肠球菌(enterococcus)、埃希氏杆菌(escherichia)、土拉弗朗西斯菌
(francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、克雷伯氏肺炎菌(klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、钩端螺旋体(leptospira)、单核细胞增多性李斯特氏菌(listeria monocytogenes)、分支杆菌(mycobacterium)、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae)、奈瑟氏菌(neisseria)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、星状诺卡氏菌(nocardia asteroides)、立氏立克次体(rickettsia rickettsii)、沙门氏菌(salmonella)、志贺氏菌(shigella)、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌(streptococcus)、梅毒螺旋体(treponema pallidum)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)和鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)。
[0076]
致病性真菌包括来自以下物种的那些：念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌、肺囊虫和葡萄穗霉菌。
[0077]
致病性原生动物包括引起以下疾病的那些：疟疾(由疟原虫引起)、阿米巴病、贾第虫病、弓形体病、隐孢子虫病、滴虫病、查加斯病(chagas disease)、利什曼病、非洲锥虫病、阿米巴痢疾、棘阿米巴角膜炎和原发性阿米巴脑膜脑炎(纳归虫病)。
[0078]
致病性朊病毒包括引起以下疾病的那些：克雅氏病、医源性克雅氏病、变异型克雅氏病、家族性克雅氏病、散发型克雅氏病、gerstmann
––
scheinker综合征、致命性家族性失眠症、库鲁病、家族性海绵状脑病和多系统萎缩症。
[0079]
致病性病毒包括来自以下科(或目)的那些：副粘病毒科，其包括人副流感病毒血清型1、2和3(hpiv1、2、3)和麻疹病毒；亨尼巴病毒(henipaviridae)科，其包括亨德拉病毒(hendra virus)和尼帕病毒；正粘病毒科，其包括禽流感a病毒；冠状病毒科，包括严重急性呼吸综合征(sars)、冠状病毒和中东呼吸综合征(mers)冠状病毒；丝状病毒科，其包括埃博拉病毒和马尔堡病毒；沙粒病毒科，其包括拉沙病毒；bunyavirales目(先前被称为布尼亚病毒科)，其包括克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒和汉坦病毒；黄病毒科和披膜病毒科，其包括西尼罗河病毒、登革病毒、寨卡病毒和基孔肯亚病毒；以及肺病毒科，其包括人呼吸道合胞病毒(rsv)和人偏肺病毒。
[0080]
优选地，人病原体是病毒。优选地，人病原体是肺病毒科病毒。
[0081]
优选地，人病原体是rsv。rsv是有包膜的单链负义rna病毒。rsv具有编码11种蛋白的10个基因。融合f(“f蛋白”)和附着g(“g蛋白”)表面糖蛋白是两种病毒中和抗原并且是主要的保护性抗原。rsv f是i型跨膜包膜糖蛋白，其介导进入期间病毒体包膜与宿主细胞膜的融合。来自人病原体的蛋白
[0082]
由本发明的载体感染的细胞表达的来自至少一种人病原体的至少一种蛋白可以包括允许宿主对人病原体产生免疫应答的任何蛋白。
[0083]
在实施方案中，蛋白是副粘病毒科的融合蛋白(f)和血凝素(h)或血凝素-神经氨酸酶(hn)蛋白，如由人副流感病毒血清型1、2和3(hpiv1、2、3)和麻疹病毒所例示的。
[0084]
在实施方案中，蛋白是henipaviridae科的融合(f)和附着(g)蛋白，如由亨德拉病毒和尼帕病毒所例示的。
[0085]
在实施方案中，蛋白是正粘病毒科的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)蛋白，如由高致病性禽流感a病毒所例示的。
[0086]
在实施方案中，蛋白是冠状病毒科的突刺(s)蛋白，如由严重急性呼吸综合征(sars)、冠状病毒和中东呼吸综合征(mers)冠状病毒所例示的。
[0087]
在实施方案中，蛋白是丝状病毒科成员的gp蛋白，如由埃博拉病毒和马尔堡病毒所例示的。
[0088]
在实施方案中，蛋白是沙粒病毒科的gp1和gp2蛋白(表达为前体gpc)，如由拉沙病毒所例示的。
[0089]
在实施方案中，蛋白是布尼亚病毒目(先前被称为布尼亚病毒科)成员的gn(gp1)和gc(gp2)蛋白，如由克里米亚-刚果出血热病毒、裂谷热病毒和汉坦病毒所例示的。
[0090]
在实施方案中，蛋白是黄病毒科和披膜病毒科成员的糖蛋白物质，如由西尼罗河病毒、登革病毒、寨卡病毒和基孔肯亚病毒所例示的。
[0091]
优选地，蛋白是肺病毒科的融合蛋白(f)或糖蛋白(g)，如由呼吸道合胞体病毒(rsv)和偏肺病毒(mpv)所例示的。肺病毒科的融合蛋白(f)
[0092]
有该蛋白的两种野生型(a和b，或者a1和b2)及其许多天然变体。此外，可以通过密码子优化来修饰核苷酸序列的开放阅读框以增强蛋白的表达。另外，核苷酸序列可以被修饰以含有与野生型中存在的那些相同的两个hek氨基酸分配(66e和101p，参见seq id no:54)。而且，序列可以具有突变、缺失和插入，只要它们不显著影响表达的蛋白引发期望的免疫应答的能力即可。
[0093]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体具有与seq id no:54具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv a2)的序列。
[0094]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体允许细胞产生与seq id no:55具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv a2)。
[0095]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体具有与seq id no:56具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv a2)的序列。
[0096]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体允许细胞产生与seq id no:57具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv a2)。
[0097]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体具有与seq id no:58具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv b1)的序列。
[0098]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体允许细胞产生与seq id no:59具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的f蛋白(来自rsv b1)。
[0099]
优选地，rsv f蛋白以其融合前形式维持，与融合形式相比，其允许增强的免疫应答。通过在其球状头部引入导致二硫键形成的突变或空腔填充突变，rsv f蛋白可以以融合前形式稳定。稳定的rsv f蛋白不太可能解折叠(当其与宿主细胞接触时是尤其需要的)(参
见mclellan等人,science,340:1113-1117(2013)；mclellan等人,science,342:592-598(2013)；和joyce等人,nature structural and molecular biology,doi:10.1038/nsmb.3267(2016)；将其各自通过引用以其整体并入本文)。
[0100]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是mpv载体，并且允许细胞表达(肺病毒科的)f蛋白。编码f蛋白的序列可以在mpv载体基因组中的任何合适的位置，使得表达f蛋白，并且条件是它不破坏载体基因。例如，编码f蛋白的序列可以如图1所示插入。编码f蛋白的序列的侧面应连接有载体基因起始序列和基因末端序列。在开放阅读框的任一侧可以有一些或多达200个核苷酸。优选地，在编码f蛋白的序列开始之前存在约10-20个核苷酸以允许核糖体负载，从而有效表达该蛋白。
[0101]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是mpv载体，允许细胞表达(肺病毒科的)f蛋白，并且包含与seq id no:60(rmpv-f1)具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
[0102]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是mpv载体，允许细胞表达(肺病毒科的)f蛋白，并且包含与seq id no:61(rmpv-f3)具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
[0103]
在实施方案中，非人单股反链病毒目载体是mpv载体，允许细胞表达(肺病毒科的)f蛋白，并且包含与seq id no:62(rmpv-f4)具有至少85％(即，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
[0104]
在实施方案中，表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质的细胞是人细胞。载体组合物
[0105]
本发明的实施方案提供了组合物，其包含本发明实施方案的载体和药学上可接受的载体。
[0106]
组合物可以适于施用至有需要的对象。在实施方案中，载体组合物适于施用至哺乳动物。在实施方案中，载体基本上不含内毒素或外毒素。内毒素可以包括热原，如脂多糖(“lps”)分子。载体也可以基本上不含可以引起发热或其它副作用的无活性蛋白片段。在实施方案中，组合物含有小于约1％、小于约0.1％、小于约0.01％、小于约0.001％或小于约0.0001％的内毒素、外毒素和/或无活性蛋白片段。在一些实施方案中，载体组合物具有比工业水，自来水或蒸馏水更低水平的热原。其它载体组合物组分可以使用本领域已知的方法纯化，如离子交换层析、超滤或蒸馏。在其它实施方案中，在施用至患者之前，可以将热原灭活或破坏。载体组合物的原料，如水、缓冲液、盐和其它化学品也可以进行筛选和去热原。载体组合物中的所有材料可以是无菌的，并且可以测试每批载体组合物的无菌性。
[0107]
在实施方案中，载体组合物包含小于约50％、小于约20％、小于约10％或小于约5％(以干重计)的污染蛋白。在实施方案中，多糖荚膜蛋白在基本上不存在其它生物大分子，如其它蛋白(特别是可以基本上掩盖、减少、混淆或改变组分蛋白作为纯化的制剂或者在主题复原(reconstituted)混合物中它们的功能的特征的其它蛋白)的情况下存在。在一些实施方案中，相对于纯化亚基的量，包含纯化的亚基蛋白的载体组合物含有小于约5％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、小于约0.2％、小于约0.1％的来自表达亚基蛋白的宿主细胞的蛋白。
[0108]
在一些实施方案中，载体对宿主具有低毒性或无毒性。在某些实施方案中，载体组
合物包含浓度小于接种疫苗的动物的ld
50
测量值的成分。ld
50
测量值可以在小鼠或其它实验模型系统中获得，并外推至人和其它动物。用于估计化合物在人和其它动物中的ld
50
的方法是本领域众所周知的。载体组合物可以含有在其中的任何组分，在大鼠中可以具有大于约100g/kg、大于约50g/kg、大于约20g/kg、大于约10g/kg、大于约5g/kg、大于约2g/kg、大于约1g/kg、大于约500mg/kg、大于约200mg/kg、大于约100mg/kg、大于约50mg/kg、大于约20mg/kg或大于约10mg/kg的ld50值。
[0109]
适于引入载体的组合物根据施用途径而变化。适于鼻内施用的组合物，诸如例如气雾剂溶液(例如，它们可以是“雾化的”)和滴剂溶液，两者都可以包括糖、悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、盐缓冲液和防腐剂。
[0110]
在实施方案中，包含本发明实施方案的载体的组合物包含单糖和/或二糖。在另一个实施方案中，包含本发明实施方案的载体的组合物包含葡萄糖、蔗糖和/或果糖作为糖。
[0111]
在实施方案中，包含本发明实施方案的载体的组合物包含足以调节和维持实施方案的组合物的ph在约4.0至约8.0，优选约5.5至约7.0的药学上可接受的缓冲液。合适的缓冲液可以包括柠檬酸盐、磷酸盐和甘氨酸。
[0112]
单独或者与其它合适的组分组合的载体可以制成经由吸入施用的气雾剂制剂。可以将气雾剂制剂置于加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。气雾剂制剂可以被递送到鼻通道或口中。
[0113]
适于肠胃外施用，诸如例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、皮内、腹腔内、鼻内和皮下途径的组合物，包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及一般水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶。
[0114]
用于注射的溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。适于口服施用的组合物可以由以下组成：(a)液体溶液，如有效量的悬浮在稀释剂(如水、盐水或peg400)中的多糖荚膜；(b)胶囊、药囊或片剂，各自含有预定量的呈液体、固体、颗粒或明胶的活性成分；(c)在适当液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液。片剂形式可以包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄蓍胶、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体中的一种或多种。锭剂形式可以包含在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的载体，以及包含在惰性基质中的载体的糖果锭剂，所述惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等，除了载体之外还含有的本领域已知的载体。可以将载体组合物封装在例如脂质体中，或者封装在提供载体缓慢释放的组合物中。载体施用
[0115]
根据本发明实施方案的载体可以通过施用递送至个体，通常通过全身施用(例如鼻内途径、静脉内途径、腹腔内途径、肌内途径、皮内途径、皮下途径、真皮下途径、透皮途径、颅内途径、粘膜途径、肛门途径、阴道途径、口腔途径、颊途径或它们可以被吸入)来递送，或者它们可以通过局部应用来施用。在实施方案中，施用途径是鼻内(例如，鼻喷雾剂或滴剂)。在实施方案中，施用途径是肌内。在其它实施方案中，施用途径是皮下。在其它实施
方案中，施用途径是粘膜。在某些实施方案中，施用途径是透皮或皮内。用于引发免疫应答的方法
[0116]
本发明的实施方案提供了用于引发对至少一种人病原体的免疫应答的方法，其包括将本发明实施方案的非人单股反链病毒目载体，或包含本发明实施方案的非人单股反链病毒目载体的组合物施用至人。
[0117]
本发明的实施方案提供了用于引发对至少一种人病原体的免疫应答的方法，其包括将本发明实施方案的非人单股反链病毒目载体，或包含本发明实施方案的非人单股反链病毒目载体的组合物施用至人，其中在施用时，人没有患肺病毒科病毒感染。在此种情况下，将本发明实施方案的载体或包含本发明实施方案的载体的组合物施用至人以诱导免疫应答，所述免疫应答可以例如通过防止感染(疾病中的第一步骤和必需步骤)帮助防止人肺病毒科病毒的建立。因此，在一些方面，该方法抑制未感染的人被人肺病毒科感染。在另一方面，该方法可以减少已经感染的人的感染持续时间。
[0118]
在某些实施方案中，载体或含有本发明载体的组合物赋予保护性免疫，允许接种疫苗的个体表现出症状或后遗症的延迟发作，或者降低症状或后遗症的严重程度，作为他或她暴露于载体的结果。在特定的实施方案中，已经接种疫苗的个体在与人肺病毒科接触时可以不显示出症状或后遗症、不会被人肺病毒科感染、或上述两者。保护性免疫通常通过以下机制中的一种或多种实现：粘膜、体液或细胞免疫。粘膜免疫主要是呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道粘膜表面上的分泌性iga(siga)抗体的结果。在由抗原处理细胞，b淋巴细胞和t淋巴细胞介导的一系列事件之后产生siga抗体，这些事件导致b淋巴细胞在身体的粘膜内衬组织(mucosa-lined tissue)上产生siga。体液免疫通常是血清中igg抗体和igm抗体的结果。细胞免疫可以通过细胞毒性t淋巴细胞或通过涉及树突细胞、巨噬细胞和t淋巴细胞的迟发型超敏反应以及涉及t细胞的其它机制来实现，而不需要抗体。特别地，细胞免疫可以由t
h1
或t
h17
细胞介导。剂量
[0119]
本发明实施方案的载体的剂量或包含本发明实施方案的载体的组合物的剂量是有效量，其以单剂量或多剂量诱导如上所述的预防性反应。优选地，选择剂量以使不良副作用最小化。这样的量将根据所用的具体载体而变化。在一些实施方案中，剂量包含约10
8.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，组合物的剂量包含约10
7.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
6.0
感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
5.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
4.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
3.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
2.0
感染单位(pfu)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10或甚至更少感染单位(pfu)的载体颗粒。
[0120]
在一些实施方案中，剂量包含约10
8.0
感染单位(50％组织培养感染单位，tcid
50
)的载体颗粒。在一些实施方案中，组合物的剂量包含约10
7.0
感染单位(tcid
50
)的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
6.0
感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
5.0
(tcid
50
)感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
4.0
(tcid
50
)感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约
10
3.0
(tcid
50
)感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10
2.0
(tcid
50
)感染单位的载体颗粒。在一些实施方案中，单剂量的组合物包含约10或甚至更少的感染性单位(tcid
50
)的载体颗粒。
[0121]
待递送的载体的适当量将取决于对象的年龄、体重和健康状况(例如免疫受损状态)。当存在时，佐剂通常以每剂1-250μg，例如50-150μg、75-125μg或100μg的量存在。
[0122]
在实施方案中，施用一剂本发明实施方案的载体或包含本发明实施方案的载体的组合物以实现上述结果。在其它实施方案中，在初始接种后，对象接受一次或多次加强接种，总共进行两次、三次、四次或五次接种。加强接种可以在例如初始接种后约1个月、2个月、4个月、6个月或12个月施用，使得一个接种方案涉及在0、0.5-2、4-8和12个月施用。施用分开剂量的疫苗可以是有利的，所述分开剂量的疫苗可以通过相同或不同的途径施用。
[0123]
在一些实施方案中，本发明实施方案的载体或包含本发明任何实施方案的载体的组合物将以剂量递增的方式施用，使得载体的后继施用含有比先前施用更高浓度的载体。在实施方案中，载体将以使得载体的后继施用含有比先前施用更低浓度的载体的方式施用。
[0124]
在一个实施方案中，有效量是在至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％的接受者中提供感染的量(如通过疫苗病毒的脱落所定义的)。
[0125]
在一个实施方案中，有效量是在至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％的接受者中提供感染的量(如通过针对载体的血清抗体滴度增加≥4倍所定义的)。
[0126]
在一个实施方案中，有效量是在至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％的接受者中提供感染的量(如通过针对表达的外源抗原的血清抗体滴度增加≥4倍所定义的)。载体组合物的制备和储存
[0127]
本文所述的载体和组合物可以使用多种技术制备。本发明的实施方案提供了用于制备活的嵌合的非人单股反链病毒目载体的方法，所述载体允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质，所述方法包括在非人单股反链病毒目载体中插入编码来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质的非天然基因。在实施方案中，编码来自至少一种人病原体的非天然蛋白的基因在非人单股反链病毒目载体基因起始位点的下游。在实施方案中，编码来自至少一种人病原体的非天然蛋白的基因在载体基因终止位点的上游。本文所用的“载体基因起始位点的下游”意指将编码来自至少一种人病原体的蛋白的基因插入非人单股反链病毒目载体基因起始位点下游的位置，使得基因起始位点允许病毒聚合酶l蛋白转录该基因。本文所用的“非人单股反链病毒目载体基因终止位点的上游”意指将编码来自至少一种人病原体的蛋白的基因插入到非人单股反链病毒目载体基因终止位点上游的位置，使得基因终止位点允许非人单股反链病毒目载体聚合酶蛋白在适当位置终止基因的转录。
[0128]
在实施方案中，用于制备载体的方法可以包括将一种或多种蛋白或其免疫原性片段或变体与载体和/或佐剂混合。试剂盒和组件
[0129]
本发明的实施方案提供了用于引发免疫应答的试剂盒。所述试剂盒可以包含本发
明实施方案的组合物和至少一个用于容纳所述组合物的容器。所述试剂盒任选地但优选地含有使用试剂盒以将本发明实施方案的组合物施用至人对象的说明书。试剂盒任选地含有施用所述组合物所需的组件(例如，注射器、针、雾化器、喷雾器或滴管)。
[0130]
本文所述的本发明主题的实施方案在单独或与一个或多个其它实施方案组合时可以是有益的。在不限制前述描述的情况下，以下提供了编号为(1)-(25)的本公开内容的某些非限制性实施方案。对于本领域技术人员而言，在阅读本公开内容后显而易见的是，每个单独编号的实施方案可以与前面或后面单独编号的实施方案中的任一个一起使用或组合。这旨在为实施方案的所有这些组合提供支持，并且不限于下文明确提供的实施方案的组合：
[0131]
(1)活的嵌合的非人单股反链病毒目载体，其允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质。
[0132]
(2)如实施方案(1)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体的天然宿主是非人动物。
[0133]
(3)如实施方案(1)或(2)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体的天然宿主来自啮齿目。
[0134]
(4)如实施方案(1)-(3)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体是鼠肺炎病毒(mpv)。
[0135]
(5)如实施方案(1)-(4)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是细菌或病毒。
[0136]
(6)如实施方案(1)-(5)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是病毒。
[0137]
(7)如实施方案(1)-(6)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是人肺病毒科病毒。
[0138]
(8)如实施方案(1)-(7)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是正肺病毒。
[0139]
(9)如实施方案(1)-(8)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种病原体是人呼吸道合胞病毒(rsv)。
[0140]
(10)如实施方案(1)-(9)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种蛋白质是rsv f蛋白质.
[0141]
(11)如实施方案(1)-(10)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体包含与seq id no.56具有至少90％序列同一性的序列。
[0142]
(12)如实施方案(1)-(10)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体包含与seq id no.58具有至少90％序列同一性的序列。
[0143]
(13)如实施方案(1)-(9)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种蛋白质是rsv g蛋白质。
[0144]
(14)如实施方案(1)-(13)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:60具有至少90％序列同一性的序列。
[0145]
(15)如实施方案(1)-(13)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:61具有至少90％序列同一性的序列。
[0146]
(16)如实施方案(1)-(13)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:62具有至少90％序列同一性的序列。
[0147]
(17)组合物，其包含实施方案(1)-(16)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体和药学上可接受的载体。
[0148]
(18)如实施方案(17)所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鼻内施用。
[0149]
(19)引发对至少一种人病原体的免疫应答的方法，其包括将实施方案(1)-(16)中任一项所述的非人单股反链病毒目载体或者实施方案(17)或(18)所述的组合物施用至人。
[0150]
(20)如实施方案(19)所述的方法，其中在施用时，所述人没有罹患人肺病毒科病毒感染。
[0151]
(21)如实施方案(19)或(20)所述的方法，其中在施用时，所述人没有罹患人呼吸道合胞病毒(rsv)感染。
[0152]
(22)如实施方案(19)-(21)中任一项所述的方法，其中所述非人单股反链病毒目载体是鼠肺炎病毒(mpv)。
[0153]
(23)制备活的嵌合的非人单股反链病毒目载体的方法，所述载体允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质，所述方法包括：(a)在非人单股反链病毒目载体中插入编码来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质的非天然基因。
[0154]
(24)用于引发免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)实施方案(17)或(18)所述的组合物；以及(b)至少一个用于容纳所述组合物的容器。
[0155]
(25)活的嵌合的非人单股反链病毒目载体，其允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质。
[0156]
(26)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体的天然宿主是非人动物。
[0157]
(27)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体的天然宿主来自啮齿目。
[0158]
(28)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体是鼠肺炎病毒(mpv)。
[0159]
(29)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是细菌或病毒。
[0160]
(30)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是病毒。
[0161]
(31)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是人肺病毒科病毒。
[0162]
(32)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种人病原体是正肺病毒。
[0163]
(33)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种病原体是人呼吸道合胞病毒(rsv)。
[0164]
(34)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种蛋白质
是rsv f蛋白质。
[0165]
(35)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体包含与seq id no.56具有至少90％序列同一性的序列。
[0166]
(36)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述非人单股反链病毒目载体包含与seq id no.58具有至少90％序列同一性的序列。
[0167]
(37)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其中所述至少一种蛋白质是rsv g蛋白质。
[0168]
(38)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:60具有至少90％序列同一性的序列。
[0169]
(39)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:61具有至少90％序列同一性的序列。
[0170]
(40)如实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体，其包含与seq id no:62具有至少90％序列同一性的序列。
[0171]
(41)组合物，其包含实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体和药学上可接受的载体。
[0172]
(42)如实施方案(25)所述的组合物，其中所述组合物被配制用于鼻内施用。
[0173]
(43)引发对至少一种人病原体的免疫应答的方法，其包括将实施方案(25)所述的非人单股反链病毒目载体施用至人。
[0174]
(44)如实施方案(43)所述的方法，其中在施用时，所述人没有罹患人肺病毒科病毒感染。
[0175]
(45)如实施方案(43)所述的方法，其中在施用时，所述人没有罹患人呼吸道合胞病毒(rsv)感染.
[0176]
(46)如实施方案(43)所述的方法，其中所述非人单股反链病毒目载体是鼠肺炎病毒(mpv)。
[0177]
(47)制备活的嵌合的非人单股反链病毒目载体的方法，所述载体允许细胞表达来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质，所述方法包括：(a)在非人单股反链病毒目载体中插入编码来自至少一种人病原体的至少一种蛋白质的非天然基因。
[0178]
(48)引发免疫应答的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)实施方案(42)所述的组合物；以及(b)至少一个用于容纳所述组合物的容器.
[0179]
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1
[0180]
本实施例显示了如何制备本发明实施方案的载体。
[0181]
如kremp等人所述，使用反向遗传学系统构建rmpv-rsv-f载体(“identification of a novel virulence factor in recombinant pneumonia virus of mice,”j.virol.,(81):9490-9501(2007)(通过引用以其整体并入本文)。用于表达rsv f的rmpv载体骨架来
源于克隆在pbluescript质粒载体(“pbs”)中的mpv(先前称为pvm)株15，其含有在亲本株15中不存在的两个引入的限制位点(agei和bstbi)，并且还含有部分修饰的l orf。对l orf的下游67％进行密码子对优化(“cpo”)以含有同义改变，所述同义改变增加了与在人中有效表达相关的密码子对的含量，同时保留了总的密码子使用和编码的氨基酸序列。针对人密码子使用对来自株a2的rsv f orf(genscript,piscataway,nj)进行密码子优化以获得更多的蛋白表达。rsv f还携带先前描述的两个hek氨基酸分配66e和101p，其使得编码的f蛋白氨基酸序列与wt株a2和临床分离株的早期传代的序列相同。
[0182]
设计了三种mpv载体构建体，其中rsv f插入物置于第一基因位置，ns1基因上游(rmpv-f1)；第三基因位置，ns2和n基因之间(rmpv-f3)；或第四基因位置，n和p基因之间(rmpv-f4)(参见图1)。定位rsv f插入物，使得rsv f orf在侧面与mpv基因起始(gs)和基因终止(ge)转录信号相接，以使rsv f转录为单独的mrna。将kozak共有序列gccgccacc(seq id no:63)置于rsv f aug起始密码子的上游，以提供所述翻译起始的有效环境。商业合成rsv f插入物(genscript)作为长基因组区段，其被设计用于使用前导区上游的质粒(pbs)序列中的xmai限制位点和如所示的下游kpni位点(rmpv-f1和rmpv-f3)或kpni和bmti位点(rmpv-f4)(参见图1)插入到rmpv反基因组质粒中。最终的构建体rmpv-f1含有紧接在核苷酸位置67之后(ns1的上游)的1768个另外的核苷酸，rmpv-f3含有紧接在核苷酸位置981之后(ns2和n之间)的1775个另外的核苷酸，rmpv-f4含有紧接在mpv基因组的核苷酸位置2276之后(n和p之间)的1771个另外的核苷酸。
[0183]
从在组成型表达t7 rna聚合酶的bhk bsr-t7/5细胞中的cdna(对于示例性方法，参见krempl等人，同上)回收rmpv载体。用mpv反基因组质粒以及表达mpv n、p、m2-1和l蛋白的支持质粒转染细胞。24小时后，刮下细胞，涡旋，并将细胞悬液与vero细胞单层共培养约两周以产生p1病毒原液。证实了p1病毒原液不含有在回收过程中引入的任何外来突变。具体地，分离病毒rna，并使用未克隆的重叠rt-pcr片段进行完整病毒基因组的sanger序列分析。缺乏逆转录酶的对照rt-pcr反应没有产生扩增产物，证实了pcr产物从病毒rna扩增而不是从用于病毒补救的cdna扩增。通过噬斑测定(plaque assay)和免疫染色测定病毒原液的滴度。实施例2
[0184]
本实施例显示了本发明实施方案的载体的体外稳定性。
[0185]
在他的研究中使用了vero、人肺上皮细胞和幼仓鼠肾细胞。将vero细胞(非洲绿猴肾细胞，ccl-81,atcc,manassas,va)维持在补充有4mm l-谷氨酰胺(thermofisher scientific,waltham,ma)和10％胎牛血清(“fbs”)(hyclone,logan,ut)的optipro
tm
培养基中。将人肺上皮a549(ccl-185；atcc,manassas,va)细胞维持在补充有4mm l-谷氨酰胺的f-12k培养基(atcc)中。bhk bsr t7/5细胞是bhk-21(幼仓鼠肾21)细胞，将其维持在补充有3％fbs的glasgow
’
s mem培养基(thermofisher scientific)中。将遗传霉素(thermofisher scientific)包含在培养基中，用于每隔一代传代，以确保表达t7 rna聚合酶细胞的选择。
[0186]
将重组的(r)wt rsv株a2用作对照。除非另有说明，否则所有体外组织培养实验均在37℃下进行。rmpv和rmpv-rsv-f载体通过以0.1的感染复数(“moi”)感染而在vero细胞上增殖。感染后约两周收获病毒原液，此时致细胞病变作用破坏单层。如所述通过在0.8％甲
基纤维素覆盖下对vero细胞进行噬斑测定来确定rmpv滴度。通过用针对蔗糖梯度纯化的mpv产生的兔超免疫血清，然后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg二抗(kpl,gaithersburg,md)进行免疫染色使噬斑可视化。通过与过氧化物酶底物(kpl)孵育检测结合的二抗。每个样品以一式两份进行测试，并报告平均值。
[0187]
为了评价体外复制后rsv f蛋白表达的稳定性，通过双重染色噬斑测定分析每个rmpv-rsv-f构建体的四次独立的病毒回收率，以确定rsv f表达的稳定性。如先前brock等人所述建立噬斑测定(“evaluation of pneumonia virus of mice as a possible human pathogen,”j.virol.,86:5829-5843(2012)(通过引用以其整体并入本文))，并在在感染后第4天使用80％甲醇固定细胞。为了鉴定mpv蛋白，以1:5,000使用上述兔抗-rmpv多克隆一抗，并通过山羊抗-兔680lt抗体(li-cor；lincoln,ne)检测。用各为1:200的三种rsv f特异性小鼠单克隆抗体(1129、1243和1269)的混合物，随后用山羊抗小鼠800cw二抗(li-cor)探测rsv f。两种二抗以1:800稀释度使用。将板在odyssey红外成像仪(li-cor)上扫描并分析图像以确定共表达rsv f和rmpv抗原的pfu的百分比。对于mpv和rsv f抗原，噬斑图像经假色处理而分别显现红色和绿色。在合并两个通道时，共表达rsv f的rmpv噬斑将显现黄色，而rsv f表达缺失的rmpv噬斑将显现红色。如图2所示，rmpv-空载体没有rsv f表达，因为噬斑是红色的。相比之下，当合并通道时，rmpv-f1、rmpv-f3和rmpv-f4是黄色的。
[0188]
图3显示了rmpv-rsv-f载体在人a549肺上皮细胞中的多周期生长动力学。图4显示了rmpv-rsv-f载体在vero细胞中的多周期生长动力学。实施例3
[0189]
本实施例显示了本发明实施方案的载体的体内稳定性。
[0190]
为了评价体内复制后rsv f蛋白的表达稳定性，通过噬斑测定，随后通过固定和双重染色噬斑测定(如上所述)分析来自下述恒河猴研究的鼻咽拭子和气管灌洗样品。
[0191]
为了评价多周期复制动力学，将每种病毒以0.1pfu/细胞的moi接种在t25烧瓶中的vero细胞和a549细胞的复制单层培养物，并在32℃下孵育。将病毒接种物吸附3小时，之后将单层洗涤两次并用新鲜培养基补充。对于a549，在第1天至第6天和第8天以及第10天，以及对于vero细胞，在第1天至第6天和第8天，将每种病毒和每种细胞类型的两个细胞单层刮入上清液中，涡旋，通过离心澄清，并冷冻。在vero细胞上通过噬斑测定来确定病毒滴度。
[0192]
然后，评价rsv f和mpv载体蛋白的表达。12孔板中的vero细胞单层用rmpv-rsv-f载体、空载体、wt rmpv、wt rsv以10pfu/细胞的moi感染，或被模拟感染。在感染后96小时，采集感染细胞的图像并制备细胞裂解物以通过蛋白质印迹检测病毒蛋白表达。将细胞用1xpbs洗涤两次，并用含有1x nupage
tm lds样品缓冲液thermofisher scientific),1x complete
tm ultra蛋白酶抑制剂(roche,basel,switzerland)和无蛋白酶水的200μl细胞裂解缓冲液裂解。将每种裂解物通过qiashredder旋转柱(qiagen,valencia,ca)旋转，并在干冰上快速冷冻。将90μl的每种裂解物与10μl的10x还原剂(thermofisher scientific)组合，变性并在70℃下还原10min。每一泳道上样25μl，随后进行sds-page和蛋白质印迹分析。用针对蔗糖梯度纯化的mpv病毒体产生的超免疫血清检测rmpv g、n和p蛋白。用针对表达mpv f蛋白的重组牛痘病毒产生的兔多克隆抗血清检测mpv f蛋白。分别用针对衍生自相应蛋白的合成肽tnfdrsdlet(seq id no:64)和sdseesgdea(seq id no:65)单独产生的兔超免疫血清检测ns1和ns2。如liang等人所述，用单克隆抗体探测rsv f(“chimeric bovine/
human parainfluenza virus type 3expressing respiratory syncytial virus(rsv)f protein:effect of insert position on expression,replication,immunogenicity,stability,and protection against rsv infection,”j.virol.(88):4237-4250(2014)(通过引用以其整体并入本文))。使用小鼠单克隆抗微管蛋白抗体(thermofisher scientific,目录号a-11126)检测作为上样对照的微管蛋白。用与红外染料(li-cor)缀合的相应物种特异性二抗检测一抗。在odyssey红外成像系统上扫描膜。使用imagestudio
tm lite,版本5.2.5(li-cor)获得了条带信号值，并校正背景。
[0193]
如图5所示，wt rsv、rmpv-f1、rmpv-f3和rmpv-f4感染的细胞显示出病毒感染的明显迹象。模拟感染和rmpv空载体感染的细胞没有显示出任何感染迹象。
[0194]
图6显示了蛋白质印迹分析，具体地，可以看出rmpv-f1、rmpv-f3和rmpv-f4(泳道1、2和3)均含有rsv f蛋白(而rmpv-空载体[泳道4]和wt mpv[泳道5]不含有rsv f蛋白)。图7描述了感染的细胞中rsv f蛋白表达的水平。如图7所示，rmpv-f1、rmpv-f3、rmpv-f4和wt rrsv均表达高水平的rsv f蛋白。图8描述了感染的细胞中rmpv g、n、p、f、ns1和ns2表达的水平。如图8所示，感染的细胞表达每种测试的蛋白，其中一些蛋白在f蛋白插入物的下游。这些结果表明稳定的插入。实施例4
[0195]
本实施例显示了本发明实施方案的载体在恒河猴中有效减弱mpv。
[0196]
nih国家过敏及传染性疾病研究所动物护理和使用委员会批准了本文所述的非人灵长类动物实验，该实验是根据“实验室动物的护理和使用指南”(the national academies press,washington,d.c.(2011))的建议进行的。测试8只成年早期恒河猴(猕猴(macaca mulatta))，以通过单独的prnt
60
测定证实它们对rsv和mpv都是血清反应阴性的。通过组合的鼻内和气管内途径用1.0ml接种物/部位接种两组恒河猴，每组4只，所述接种物含有在l-15培养基(thermofisher scientific)中稀释的10
6
pfu的rmpv-f1或rmpv-f3。在单独的研究中，将与用于rmpv载体的那些相同群组的四只恒河猴接种7.0log
10
pfu/部位的重组wt rsv株a2。预先筛选所有4只动物为rsv血清反应阴性。每天进行临床观察。在第0-10天、第12天、第14天、第21天和第28天收集鼻咽(“np”)拭子。在感染后，第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天、第14天、第21天和第28天收集气管灌洗(“tl”)样品。通过如上所述的噬斑测定分析np和tl样品以定量病毒脱落(viral shedding)。为了评估免疫原性，在免疫后第0天、第14天、第21天和第28天收集血清，并通过prnt
60
分析rsv-和mpv-中和抗体。
[0197]
如下进行prnt
60
(60％噬斑减少中和测试)。通过分别使用rsv-gfp和mpv-gfp对vero细胞进行prnt
60
测定，分析血清样品的rsv-和mpv-中和抗体滴度。用rmpv-f1、-f3或wt rsv免疫的所有12只动物的血清在相同的实验中并行分析rsv中和抗体水平。在使用前，将血清样品在56℃孵育30分钟以灭活血清补体。然后将血清的系列稀释液与等体积的稀释的rsv-gfp或mpv-gfp混合，并在37℃孵育30分钟。rsv中和试验在10％豚鼠补体(lonza,walkersville,md)存在下进行。将补体从mpv中和测定中排除，因为它使病毒失活。在感染后第6天，通过在typhoon成像仪(lonza,walkersville,md)上扫描获得rsv-gfp和mpv-gfp噬斑的图像，并计算prnt
60
。每个样品以一式两份进行测试，平均值报告为log
2 prnt
60
。表2.来自用指定的rmpv-rsv f载体或用wt rsv接种的恒河猴的上呼吸道的鼻咽拭子样品的病毒滴度
[0198]
在第10天后的时间点没有可检测到的病毒，并且未示出。检测下限为0.7log
10
pfu/ml。没有任何可检测病毒的样品表示为
“---”
。“脱落天数”表示检测到病毒的第一天至最后一天的时间段，包括其间的阴性天数(如果有的话)。表3.来自用指定的rmpv-rsv f载体或用wt rsv接种的恒河猴的下呼吸道的气管灌洗样品的病毒滴度
[0199]
在第8天后的时间点没有可检测到的病毒，并且未示出。没有任何可检测病毒的样品表示为
“---”
。检测下限为0.7log
10
pfu/ml。“脱落天数的#”表示检测到病毒的第一天至最
后一天的时间段，包括其间的阴性天数(如果有的话)。表4.从用rmpv载体接种的恒河猴的上呼吸道和下呼吸道收集的样品中表达rsv f的噬斑形成单位(pfu)的百分比
[0200]
在鼻内免疫后的指定天数收集的鼻咽拭子和气管灌洗液样品通过在vero细胞上的荧光双重染色噬斑测定来分析，以确定体内病毒复制期间共表达rsv f和mpv抗原的病毒pfu的百分比。这些百分比值由每个样品约100个噬斑确定。没有任何可检测到的病毒的样品表示为
“---”
。未收集样品的天数用“nc”标明。表5.来自用rmpv-rsv-f载体或用wt rsv免疫的恒河猴的血清样品的rsv 60％噬斑减少中和滴度(prnt
60
)
[0201]
rsv prnt
60
测定的检测下限为3.3(log
2 60％滴度)。log
2
prnt
60
值≥5.3的rsv血清样品被认为是阳性的。表6.来自用rmpv-rsv-f载体免疫的恒河猴的血清样品的mpv 60％噬斑减少中和滴度(prnt
60
)
[0202]
(prnt
60
)测定的检测下限为3.3(log
2 60％滴度)。log
2 prnt
60
值≥5.3的mpv血清样品被认为是阳性的。
[0203]
如表2-6所示，两种病毒(rmpv-f1和rmpv-f1)在上呼吸道和下呼吸道中以低水平复制，保持稳定的rsv f表达，并诱导高水平的rsv中和血清抗体，类似于复制至5-25倍更高滴度的wt rsv所诱导的水平。本研究显示了rmpv为rsv f蛋白的表达提供了高度减毒但具有免疫原性的载体，在rsv-初始(rsv-)和rsv-成熟(rsv-experienced)的群体中具有潜在的应用。
[0204]
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用并入，其程度如同每份参考文献单独地和具体地表示为通过引用并入并且在本文以其整体示出。
[0205]
在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一
个/一种(a)”、“一个/一种(an)”、“所述”、至少一种/一个以及类似的引用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种/一个”之后一项或多项列举(例如，“a和b中的至少一种/一个”)的使用应被解释为意指选自列出的项中的一项(a或b)或者两个或更多个列出的项的组合(a和b)，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式的术语(即意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文叙述的值的范围仅旨在作为分别提及落入该范围内的每个单独值的速记法，除非本文另外指明，并且将每一单独的值并入本说明书，如同本文对其单独叙述。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。使用的本文提供的任何以及全部实例或示例性语言(例如“诸如”)仅旨在更好地说明本发明，并不对本发明的范围进行限制，除非另有声明。不应将本说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的元素对实施本发明是必要的。
[0206]
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明最佳方式。通过阅读前面的描述，这些优选实施方案的变化对本领域普通技术人员是显而易见的。发明人期望技术人员适当地使用此类变型，并且发明人意欲以不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，如适用法律所允许的，本发明包括所附权利要求中叙述的主题的所有变型和等同主题。此外，本发明涵盖上述元素以其所有可能的变体形式的任何组合，除非本文另外指明或者与上下文明显矛盾。

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