一种利用马克斯克鲁维酵母酿造水果西打的方法与流程

[0001]
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及水果西打的酿造方法。


背景技术：

[0002]
马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)广泛存在于酸奶、酸乳酒、水果及甘蔗叶子等环境中, 是食品安全级酵母, 在一个多世纪前被分离获得，近20 年来, 由于该酵母表现出的食品安全性、高生长速率、高生物量、耐高温等特征, 并先后得到美国食品药品管理局(us food and drug administration, fda) 的gras 认证欧盟食品安全监督局(european food safety authority, efsa)的qps 认证， 2013 年被中国国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料得到生产应用领域的关注，而且，马克斯克鲁维酵母中能够产果胶酶，国外已有研究将马克斯克鲁维酵母应用于红葡萄酒的发酵，提高葡萄浸皮过程香味物质的效果，以改善红酒的风味。
[0003]
西打源于英文cider的音译，通常意指苹果酒，是由苹果汁发酵酿制而成的酒精饮料，在世界上是仅次于葡萄酒的第二大果酒，酒精度通常在2%-8.5%。 随着时代的发展，西打不仅指代苹果发酵的果酒，逐渐演化成由各种水果果汁发酵酿制而成的果酒的总称。西打酒精度低，富含营养，符合当代人追求健康饮食，健康生活的需求，在欧洲，美洲，澳大利亚等地广为流行。根据国际葡萄酒与烈酒数据分析公司iwsr(international wine & spirit research)的数据，2017年全球的苹果酒销量增长了2.5%（相当于5670万升）。中国是世界上最大苹果生产国，年产量超过世界苹果年总产量的50%。中国的苹果消费市场主要以鲜食为主，少量加工为果汁，果干等产品，极少一部分进行出口。据我国农科院的统计，截止至2017年，我国的苹果产量已呈现严重的供过于求的现象。西打作为由苹果等水果发酵酿制的酒精饮料，通过益生菌——酵母的代谢提高苹果汁的营养价值，提高附加值，还够提高附加值，也能一定程度解决我国苹果等水果产量过剩的问题。而传统苹果西打酒采用酿酒酵母进行发酵，发酵周期长，香味物质不够丰富，口感较单一。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种营养丰富、酸味适中、气味清香、色泽透亮、口感清爽的水果西打的酿造方法。
[0005]
本发明通过深入研究不同酵母的絮凝性以及发酵水果汁产生代谢产物、营养成分的差异，筛选到一株马克斯克鲁维酵母，采用该马克斯克鲁维酵母发酵酿造的苹果等水果西打，果香、奶酪香浓郁，营养丰富、酸味适中、气味清香、色泽透亮、口感清爽。
[0006]
本发明提供的水果西打的酿造方法，采用马克斯克鲁维酵母fim-1作为发酵菌种；所述马克斯克鲁维酵母fim-1，保存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心在中国菌种保藏中心(cgmcc)，保藏号是：no.10621，保藏日期为：2015年5月13日。
[0007]
本发明提供的水果西打的酿造方法，具体步骤如下：（1）取水果，去核后捣碎，去渣，取果汁；
（2）加入适量的糖，调节果汁糖度为13-16
°
bx；（3）加入20-100ppm的焦亚硫酸钾，搅拌溶解后放置12-24h；（4）接入马克斯克鲁维酵母fim-1菌种，进行果汁的液态发酵，发酵温度为20-30℃，发酵时间5-14天；（5）发酵结束后，对发酵液过滤澄清，然后充二氧化碳，罐装；（6）巴氏杀菌后得到水果西打酒产品。
[0008]
本发明步骤（1）中，所述水果典型的有苹果、梨、桃子、李子、木瓜、西瓜等等，但不限于此。优选苹果、梨、桃子、李子、木瓜，更优选苹果。
[0009]
本发明步骤（1）中，水果带皮捣碎（如苹果、梨、桃子、李子、木瓜等），以后带皮低温发酵，可提取水果皮中的香味物质。
[0010]
本发明步骤（2）中，所述的糖可选葡萄、蔗糖或果葡糖浆中的一种或多种，优选蔗糖。
[0011]
本发明步骤（2）中，制作低酒精度的水果西打的果汁糖度为12-13
°
bx；制作中酒精度的水果西打的果汁糖度为13-14
°
bx；制作高酒精度的水果西打的果汁糖度为14-16
°
bx。
[0012]
本发明步骤（3）中，焦亚硫酸钾的用量，以游离的so
2
计算，游离的so
2
含量为20-25 mg/l，以防止果汁的酶促褐变，同时能够起到抑制杂菌的生长。
[0013]
本发明步骤（4）中，马克斯克鲁维酵母fim-1菌种的添加量为果汁重量的0.02-0.1%。发酵过程中，每隔24h检测果汁中的残糖量和酒精度。
[0014]
本发明步骤（5）中，所述过滤澄清，采用板框压滤，然后用0.2 μm孔径的滤膜器澄清。所述充二氧化碳，可进行低温充气或调配好的西打预冷后充气，充入的二氧化碳的量为1.5-4.0 g/l。
[0015]
与现有技术相比，本发明具有如下特点：（1）本发明采用马克斯克鲁维酵母（km）进行发酵生产水果西打，发酵时间不超过14天，酒精度含量2%-8%。利用马克斯克鲁维酵母能够自产果胶酶的特性，提高水果浸皮过程中风味物质的萃取效率，获得气味清香，色泽透亮，口感清爽的水果西打。
[0016]
（2）苹果等水果汁经km发酵后，氨基酸总量提高到3.870mg/ml，氨基酸含量提高了13%，而酿酒酵母（sc）发酵后氨基酸总量2.937mg/ml，降低了14%左右。而更为常用的酿酒酵母发酵，氨基酸的含量却明显减少。
[0017]
（3）km发酵后天门冬氨酸、胱氨酸、亮氨酸以及酪氨酸含量增加显著，而sc发酵后的含量则减少显著。km发酵后咖啡酸的含量提高了86.85%。
[0018]
（4）经上海市酒类产品质量检验中心检测，苹果汁等经km发酵经发酵后高级醇（包括正丙醇、异丁醇和异戊醇等）的含量为88.5mg/l，而sc发酵的苹果汁中高级醇含量高达178.5mg/l。
附图说明
[0019]
图1为不同马克斯克鲁维酵母菌株的絮凝性。
[0020]
图2为马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母发酵苹果汁后苹果酸、柠檬酸、乳酸和乙酰乙酸甲酯的含量对比。
[0021]
图3为马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母发酵苹果汁后氨基丁酸、鸟嘌呤、黄嘌呤1甲
基黄嘌呤、丁酸内酯、辛酮和维生素含量对比。
[0022]
图4为苹果汁发酵前后氨基酸含量的对比。
[0023]
图5为苹果汁发酵前后主要成分含量对比，相比发酵前，糖基化咖啡酸含量提高了86.85%，苹果酸含量下降了7.42%，柠檬酸含量下降了8.34%，海藻糖含量上升了61.48%。
[0024]
图6为苹果汁马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母发酵后高级醇的含量。
[0025]
图7为马克斯克鲁维酵母fim-1（km）与酿酒酵母（sc）氧化呼吸链和atp合成相关基因的mrna水平的比较。
[0026]
图8为 马克斯克鲁维酵母fim-1中的atp合成效率提高比较。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0028]
实施例1，酒精度含量2%的苹果西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取云南省大理自治州李家庄苹果20 kg，剔除烂果，破损果。并用3%的盐水浸泡洗净。
[0029]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约10 l的苹果汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0030]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为13%；（4）加入0.5 g的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0031]
（5）接入2 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为2%时结束发酵，发酵时长约3-4天。
[0032]
（6）将得到的发酵液进行板框过滤。
[0033]
（7）用0.2 μm的膜过滤器进行进一步澄清。
[0034]
（8）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0035]
（9）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0036]
实施例2，酒精度含量4%苹果西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取云南省大理自治州李家庄苹果20 kg，剔除烂果，破损果。并用3%的盐水浸泡洗净。
[0037]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约10 l的苹果汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0038]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为14%。
[0039]
（4）加入0.5 g的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0040]
（5）接入2 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为4%时结束发酵，发酵时长约5-7天。
[0041]
（6）将得到的发酵液进行板框过滤。
[0042]
（7）用0.2 μm的膜过滤器进行进一步澄清。
[0043]
（8）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0044]
（9）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴
标。获得成品。
[0045]
实施例3，酒精度含量8%苹果西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取云南省大理自治州李家庄苹果20 kg，剔除烂果，破损果。并用3%的盐水浸泡洗净。
[0046]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约10 l的苹果汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0047]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为16%。
[0048]
（4）加入0.5 g的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0049]
（5）接入2 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中25 ℃恒温发酵。待酒精度为8%时结束发酵，发酵周期约10-14天。
[0050]
（6）将得到的发酵液进行板框过滤。
[0051]
（7）用0.2 μm的膜过滤器进行进一步澄清。
[0052]
（8）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0053]
（9）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0054]
实施例4，一种梨西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取河北皇冠梨5 kg，剔除烂果，破损果。并3%的盐水浸泡洗净。
[0055]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约3 l的梨汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0056]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为14%。
[0057]
（4）加入25 ppm的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0058]
（5）接入0.6 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为5%时结束发酵，发酵时长约3-5天。
[0059]
（6）将得到的发酵液进行过滤澄清。
[0060]
（7）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0061]
（8）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0062]
实施例5，酒精度含量5%桃子西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取江苏无锡水蜜桃6 kg，剔除烂果，破损果。并3%的盐水浸泡洗净。
[0063]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约2 l的桃子汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0064]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为14%。
[0065]
（4）加入25 ppm的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0066]
（5）接入0.4 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为5%时结束发酵，发酵时长约3-5天。
[0067]
（6）将得到的发酵液进行过滤澄清。
[0068]
（7）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0069]
（8）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0070]
实施例6，酒精度含量5%李子西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取广西黑布李6 kg，剔除烂果，破损果。并3%的盐水浸泡洗净。
[0071]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约3 l的李子汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0072]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为14% 。
[0073]
（4）加入25 ppm的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0074]
（5）接入0.6 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为5%时结束发酵，发酵时长约3-5天。
[0075]
（6）将得到的发酵液进行过滤澄清。
[0076]
（7）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0077]
（8）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0078]
实施例7，酒精度含量5%西瓜西打酒的制备，具体步骤为：（1）选取山东麒麟西瓜4 kg，需无明显破损、外观正常，并3%的盐水浸泡洗净。
[0079]
（2）切块，去皮，利用压榨机榨汁，得到约3 l的西瓜汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0080]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为14% 。
[0081]
（4）加入25 ppm的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0082]
（5）接入0.6 g的干酵母fim-1，充分搅拌溶解，置于发酵罐中28 ℃恒温发酵。待酒精度为5%时结束发酵，发酵时长约2-3天。
[0083]
（6）将得到的发酵液进行过滤澄清。
[0084]
（7）将澄清后的果汁，4 ℃冷藏2-4 h后，用二氧化碳充气机充气，并进行灌装。
[0085]
（8）将灌装好的西打置于68 ℃恒温箱中放置2 h进行巴氏灭菌。冷却至室温后贴标。获得成品。
[0086]
实施例8，不同水果制取的西打酒的指标比较。
[0087]
选取梨、桃子、西瓜、黑布李和山东皱木瓜等，清洗后榨汁。果汁接种经0.2g/l的马克斯克鲁维酵母干酵母fim-1，经低温发酵3-7天后过滤澄清、罐装，制成不同品种的水果西打。利用马克斯克鲁维酵母发酵果汁，不仅能改善果汁的营养，释放水果特有的香味，还能赋予微醺、奶香以及发酵后的酯香（如表1）。
[0088]
表1：不同水果榨汁后发酵制成的西打理化与感官指标
实施例9 （比较例），马克斯克鲁维酵母菌株fim-1与其它马克斯克鲁维酵母菌的比较酵母细胞的絮凝性能是一种重要的特性，它是由于酵母细胞壁表面存在一种特定的絮凝素蛋白（絮凝素）可与其他酵母细胞壁上的甘露糖残基之间专一性结合引起酵母的絮凝。高絮凝性酵母的优点是可以在发酵结束时高效、简单且低能耗地分离细胞，有利于下游加工，但缺点高絮凝性酵母发酵均一性较差，而且易导致双乙酰水平增加。
[0089]
为筛选用于苹果西打酿制的马克斯克鲁维酵母，本发明首先对5株不同来源的马克斯克鲁维酵母k. marxianus nbrc1777、k. marxianus atcc26548、k. marxianus nq-1、k. marxianus nq-18和k. marxianus fim-1（y179wt）(cgmcc no.10621)絮凝性进行了分析。将5株马克斯克鲁维酵母接种与ypd培养基中，30℃培养48h后静置30min观察絮凝现象，结果如图1所示，k. marxianus nbrc1777、k. marxianus nq-1和k. marxianus nq-18的絮凝性相对较高， k. marxianus atcc26548和 k. marxianus fim-1（y179wt）絮凝性适中，适合苹果汁的发酵。
[0090]
随后将5株马克斯克鲁维酵母按相同细胞密度接种于150ml苹果汁中，发酵3-4天左右当酒精度达3.0%左右中止发酵，进行感官评价，结果如表2所示，k. marxianus fim-1发酵苹果汁的口味最佳。
[0091]
表2：不同马克斯克鲁维酵母发酵苹果汁的感官评价实施例10（比较例），马克斯克鲁维酵母fim-1与酿酒酵母发酵苹果汁的代谢组学差异5株马克斯克鲁维酵母和1株酿酒酵母（安琪果酒发酵酵母）按相同细胞密度接种于150ml苹果汁中，25℃发酵4天，取样送至上海敏芯信息科技有限公司进行代谢组学分析。相比其它马克斯克鲁维酵母以及酿酒酵母，马克斯克鲁维酵母fim-1菌株能显著降低苹果汁中的苹果酸和柠檬酸，产生更多柔和且具有奶酪风味的乳酸（图1所示）。此外该菌株发酵可
产生乙酰乙酸甲酯、丁酸内酯、氨基丁酸和辛酮，从而丰富苹果西打的风味。在营养上，fim-1菌株不仅能降低果汁中的嘌呤含量，从而减低饮用痛风风险，还能提高b族维生素如泛酸(维生素b5)和烟酸（维生素b3）含量（图2所示）。 因此，fim-1菌株是一种优良的苹果西打酿制酵母。
[0092]
实施例11（比较例），马克斯克鲁维酵母fim-1与酿酒酵母发酵苹果西打的营养比较。
[0093]
（1）选取富士苹果20 kg，剔除烂果，破损果。并3%的盐水浸泡洗净。
[0094]
（2）切块，去除果核，去果蒂后，利用压榨机榨汁，得到约10 l的苹果汁，将果汁倒入消毒灭菌的发酵罐中。
[0095]
（3）加入白砂糖，充分搅拌溶解，调整糖度为16%。
[0096]
（4）加入0.5 g的焦亚磷酸钾，充分搅拌溶解。
[0097]
（5）接入终浓度为0.2 od
600nm
的马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母，充分搅拌溶解，置于发酵罐中25℃恒温发酵。待酒精度为5%时结束发酵，发酵周期约5-7天。
[0098]
（6）将得到的发酵液进行板框过滤。
[0099]
（7）测定过滤后的西打酒氨基酸含量，结果如表3所示：苹果原汁中氨基酸总量为3.426 mg/ml，经马克斯克鲁维酵母fim-1发酵后，氨基酸总量提高到3.870mg/ml，增加了13%，酿酒酵母发酵后氨基酸总量2.937mg/ml，降低了14%左右。马克斯克鲁维酵母发酵后天门冬氨酸、胱氨酸、亮氨酸以及酪氨酸含量增加显著，而酿酒酵母（sc）发酵后的含量则减少显著。结果表明马克斯克鲁维酵母发酵的西打酒能够显著提高苹果汁的营养水平。
[0100]
表3：不同酵母发酵富士苹果汁前后的氨基酸含量检测结果
（8）马克斯克鲁维酵母fim-1和酿酒酵母发酵的西打酒高级醇含量测定过滤澄清后西打酒送至上海酒类产品质粒检验中心测定高级醇（包括正丙醇、异丁醇和异戊醇等）的含量， km发酵经发酵后高级醇含量为88.5mg/l，sc发酵后高级醇含量高达178.5mg/l。
[0101]
关于马克斯克鲁维酵母fim-1快速生长的机制说明用反转录pcr的方法测试基因表达的转录水平，对比分析马克斯克鲁维酵母fim-1（km）比酿酒酵母（sc）生长快速的分子机制。在接种后1小时后，fim-1中氧化呼吸链和atp合成相关基因的表达水平明显高于酿酒酵母（sc）中同源基因的表达水平（参见图7），提示了fim-1生长快速的一个重要原因是它增强了对于氧化呼吸链、tca循环和atp合成基因的上调表达。
[0102]
传统的酿酒酵母atp合成过程中，糖酵解-氧化呼吸链途径中虽然atp的总产量高，但是由于产生atp的速度慢，会影响葡萄糖运输效率，导致生长缓慢 （图8（a））。通过对于fim-1生长快速时期的基因表达分析，发现fim-1在上调氧化呼吸链基因表达的同时，也上调了对于葡萄糖运输相关的基因，从而弥补由于葡萄糖不足导致的生长缓慢。此外，fim-1
同时上调了tca和atp合成的基因，提升了atp合成效率，促进了生长（图8（b））。

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