水凝胶和间充质干细胞的制备方法与流程

[0001]
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种水凝胶和间充质干细胞的制备方法。


背景技术：

[0002]
间充质干细胞(mscs)是具有自我更新和分化能力的一类细胞，近年越来越多的研究证实其在多种疾病中具有治疗潜能。间充质干细胞有多种来源，例如脐带、骨髓、皮肤、外周血等组织，其中，围产期组织由于处于发育阶段早期，细胞活力更强，是理想的间充质干细胞来源。围产期组织的来源包括脐带和胎盘，人脐带间充质干细胞(huc-mscs)细胞纯度高，增殖和分泌活性强，免疫风险低，无需配型，是未来临床应用的理想种子细胞。
[0003]
然而，传统间充质干细胞的制备方法制得的间充质干细胞的量少，不能满足市场需求。


技术实现要素：

[0004]
基于此，有必要提供一种能提高间充质干细胞的产量的间充质干细胞的制备方法。
[0005]
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0006]
将组织置于预置有水凝胶的培养容器中培养，所述组织位于所述水凝胶上，其中，制备所述水凝胶的原料包括：100份～400份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～8份的引发剂、6份～8份的交联剂、18份～54份的壳聚糖和1份～4份的抗菌剂，所述抗菌剂选自可溶性锌盐及可溶性银盐中的至少一种，及将所述培养容器置于4℃～20℃条件下，以使从所述组织中爬出的间充质干细胞从所述水凝胶上脱附。
[0007]
上述间充质干细胞的制备方法通过在预置有水凝胶的培养容器中培养组织，该水凝胶由n-异丙基丙烯酰胺单体形成的聚(n-异丙基丙烯酰胺)与壳聚糖和抗菌剂中的阳离子形成的复合结构，促进从细胞从组织中爬出，提高细胞的产量；并且该水凝胶为温度敏感型水凝胶，当温度低于其临界溶解温度时，贴覆于水凝胶上的细胞由于水凝胶的体积相变而脱附，从而避免分离从组织爬出的细胞时胰酶消化对细胞的损伤，减少分离过程中细胞的死亡，也在提高收获的细胞量的同时也提高了收获的细胞的活性，进而也能提高细胞的产量。
[0008]
在其中一个实施例中，所述水凝胶的临界溶解温度为32℃～35℃。
[0009]
在其中一个实施例中，所述可溶性锌盐选自氯化锌及硫酸锌中的至少一种；
[0010]
及/或，所述可溶性银盐为硝酸银；
[0011]
及/或，所述壳聚糖的分子量为30000～3000000；
[0012]
及/或，所述引发剂选自过硫酸铵、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过氧化氢、过硫酸钾及叔丁基过氧化氢中的至少一种；
[0013]
及/或，所述交联剂选自n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酸及二丙烯酰胺中的至少
一种。
[0014]
在其中一个实施例中，制备所述水凝胶的原料还包括添加5份～10份的促进剂；
[0015]
优选地，所述促进剂选自四甲基乙二胺、三氧化铁及二乙基硫脲中的至少一种。
[0016]
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0017]
将组织置于预置有水凝胶的培养容器中培养，所述组织位于所述水凝胶上，其中，制备所述水凝胶的原料包括：100份～400份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～8份的引发剂、6份～8份的交联剂、18份～54份的壳聚糖和1份～4份的抗菌剂，所述抗菌剂选自可溶性锌盐及可溶性银盐中的至少一种，及
[0018]
将所述培养容器置于4℃～20℃条件下，以使从所述组织中爬出的间充质干细胞从所述水凝胶上脱附。
[0019]
在其中一个实施例中，在所述将所述培养容器置于4℃～20℃条件下，以使从所述组织中爬出的间充质干细胞从所述水凝胶上脱附的步骤中，不包括添加胰酶以消化从所述组织中爬出的间充质干细胞的步骤。
[0020]
在其中一个实施例中，所述组织为1立方毫米～5立方毫米的组织块。
[0021]
在其中一个实施例中，所述组织来源于脐带、骨髓、皮肤、血管或神经。
[0022]
在其中一个实施例中，在所述将所述培养容器置于4℃～20℃条件下，以使从所述组织中爬出的间充质干细胞从所述水凝胶上脱附的步骤之后，还包括将从所述水凝胶上脱附的间充质干细胞置于新的预置有水凝胶的培养容器中进行传代培养的步骤。
[0023]
在其中一个实施例中，制备所述水凝胶的步骤包括：将n-异丙基丙烯酰胺、引发剂和交联剂溶于1份～5份的水中，形成混合物；及将所述混合物与壳聚糖和抗菌剂混合，制备水凝胶。
附图说明
[0024]
图1为实施例1中去除静脉血管和动脉血管后的所有脐带组织；
[0025]
图2为实施例1中组织块培养5天后从组织块中爬出的细胞；
[0026]
图3为实施例1中第三代间充质干细胞的流式结果；
[0027]
图4为实施例1中由间充质干细胞诱导分化的脂肪细胞；
[0028]
图5为实施例2的间充质干细胞的流式结果；
[0029]
图6为对比例1的间充质干细胞的流式结果。
具体实施方式
[0030]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
[0031]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0032]
本发明一实施方式提供了一种间充质干细胞的制备方法，该间充质干细胞的制备方法步骤s1～步骤s3，具体地：
[0033]
步骤s1：在培养容器内预置水凝胶。
[0034]
具体地，在培养容器内预置水凝胶可以是在培养容器中制备水凝胶。当然，也可以先制备水凝胶，然后将制备好的水凝胶移入培养容器中。可以理解的是，培养容器没有特别限制，可以是培养皿，也可以是培养瓶、培养板等。
[0035]
本实施方式中，在培养容器中预置水凝胶的步骤包括步骤a～步骤d，具体地：
[0036]
步骤a：以质量份数计，将100份～400份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～8份的引发剂和6份～8份的交联剂溶于水中，形成混合物。
[0037]
具体地，n-异丙基丙烯酰胺作为经聚合反应而生成的水凝胶的单体。在一个可选地具体示例中，n-异丙基丙烯酰胺的质量份数为100份、200份、300份、400份。进一步地，n-异丙基丙烯酰胺的质量份数为200份～300份。
[0038]
具体地，引发剂用于引发n-异丙基丙烯酰胺单体的聚合反应。在其中一个实施例中，引发剂选自过硫酸铵(aps)、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过氧化氢、过硫酸钾及叔丁基过氧化氢中的至少一种。当然，在其他一些实施例中，引发剂不限于上述，还可以是其他物质。在一个可选地具体示例中，引发剂的质量份数为6份、7份或8份。进一步地，引发剂的质量份数为6份～7份。
[0039]
具体地，交联剂用于将n-异丙基丙烯酰胺单体交联而形成聚(n-异丙基丙烯酰胺)。在其中一个实施例中，交联剂选自n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)、丙烯酸及二丙烯酰胺中的至少一种。当然，在其他一些实施例中，交联剂不限于上述，还可以是其他能够使得n-异丙基丙烯酰胺单体交联的物质。在一个可选地具体示例中，交联剂的质量份数为6份、7份或8份。进一步地，交联剂的质量份数为6份～7份。
[0040]
具体地，形成混合物的操作在氮气氛围下进行。进一步地，形成混合物的操作在避光条件下进行。
[0041]
步骤b：以质量份数计，将混合物与18份～54份的壳聚糖和1份～4份的抗菌剂混合后，置于培养容器中，制备水凝胶。
[0042]
具体地，壳聚糖分散于n-异丙基丙烯酰胺聚合生成的聚(n-异丙基丙烯酰胺)中，并与抗菌剂中的阳离子形成络合物，壳聚糖用于增加制得的水凝胶的亲水性和机械强度，促进组织和细胞粘附。在本实施方式中，壳聚糖的分子量为30000～3000000；壳聚糖的脱乙酰度为50％～95％。进一步地，壳聚糖的分子量为30000～1500000，壳聚糖的脱乙酰度在95％以上。在一个可选地具体示例中，壳聚糖的质量份数为18份、25份、27份、32份、36份、40份、45份、50份或54份。
[0043]
抗菌剂用于抗菌，避免组织因受污染而使得分离的细胞不可用。抗菌剂的质量份数为1份～4份。在一个可选地具体示例中，抗菌剂的质量份数为1.224份、1.632份、2.04份、2.856份或3.67份。进一步地，抗菌剂选自可溶性锌盐及可溶性银盐中的至少一种。锌盐和银盐中的阳离子与壳聚糖和聚(n-异丙基丙烯酰胺)通过静电相互作用结合，改善水凝胶的机械强度。在其中一个实施例中，可溶性锌盐选自氯化锌及硫酸锌中的至少一种。可溶性银盐为硝酸银。当然，在其他一些实施方式中，锌盐和银盐均不限于上述。可以理解的是，在其他实施例中，抗菌剂不限于上述的可溶性锌盐及/或可溶性银盐，还可以是其他抗菌剂。
[0044]
具体地，将混合物与壳聚糖和抗菌剂混合的操作也在氮气气氛下进行。混合物与壳聚糖和抗菌剂的混合方式为搅拌。当然，混合物与壳聚糖和抗菌剂的混合方式不限于搅
拌，还可以是其他混合方式。
[0045]
在其中一个实施例中，壳聚糖以壳聚糖溶液的方式与混合物混合；抗菌剂以抗菌溶液的方式与混合物混合。在一个可选地具体示例中，在将混合物与壳聚糖和抗菌剂混合后形成的体系中，壳聚糖的浓度为0.6％(m/v)。抗菌溶液为锌盐溶液，在将混合物与壳聚糖和抗菌剂混合后形成的体系中，锌盐溶液中锌盐的浓度为5mmol/l。可以理解的是，壳聚糖溶液中壳聚糖的浓度和与混合物混合的壳聚糖溶液的体积可以根据需要制备的体系中的壳聚糖的浓度进行选择。当然，抗菌溶液中锌盐/银盐的浓度和与混合物混合的抗菌溶液的体积同理。
[0046]
在其中一个实施例中，在将混合物与壳聚糖和抗菌剂混合的步骤之后，还包括添加促进剂的步骤。具体地，将壳聚糖和抗菌剂混合后，加入促进剂并混匀。促进剂用于加快n-异丙基丙烯酰胺单体的聚合反应。具体地，促进剂的质量份数为5份～10份，促进剂选自n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)、三氧化铁及二乙基硫脲中的至少一种。进一步地，促进剂的质量份数为6份～9份。当然，在一些实施例中，促进剂可以省略，此时，加入促进剂的操作相应省略即可。
[0047]
在其中一个实施例中，制备水凝胶的原料包括：200份～300份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～7份的引发剂、6份～7份的交联剂、18份～54份的壳聚糖、1份～4份的锌盐和5份～10份的促进剂。进一步地，制备水凝胶的原料包括：300份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～7份的引发剂、6份～7份的交联剂、18份～54份的壳聚糖、1份～4份的锌盐和5份～10份的促进剂。
[0048]
在其中一个实施例中，制备水凝胶的原料由200份～300份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～7份的引发剂、6份～7份的交联剂、18份～54份的壳聚糖、1份～4份的锌盐、5份～10份的促进剂和1份～5份的水组成。进一步地，制备水凝胶的原料由300份的n-异丙基丙烯酰胺、6份～7份的引发剂、6份～7份的交联剂、18份～54份的壳聚糖、1份～4份的锌盐、5份～10份的促进剂和1份～5份的水组成。
[0049]
当然，在混合物与壳聚糖和抗菌剂反应生成水凝胶后，还包括去除水凝胶中未反应的物质的步骤。具体地，将水凝胶在水中浸泡，并每隔24小时～48小时更换一次浸泡水凝胶的水，以去除水凝胶中未反应的物质。在本实施方式中，水为去离子水。
[0050]
在其中一个实施例中，培养容器内的水凝胶的临界溶解温度为32℃～35℃。在一个可选地具体示例中，培养容器内的水凝胶的临界溶解温度为30℃、32℃、33℃或34℃。进一步地，培养容器内的水凝胶的临界溶解温度为32℃～34℃。
[0051]
上述水凝胶通过聚(n-异丙基丙烯酰胺)与壳聚糖和抗菌剂中的阳离子形成的复合物，促进从细胞从组织中爬出，提高细胞的产量；并且该水凝胶为温度敏感型水凝胶，当温度低于其临界溶解温度时，贴覆于水凝胶上的细胞由于水凝胶的体积相变而脱附，从而避免分离从组织爬出的细胞时胰酶消化对细胞的损伤，减少分离过程中细胞的死亡量，也在提高收获的细胞量的同时也提高了收获的细胞的活性，进而也提高了细胞的产量。
[0052]
步骤s2：将组织置于水凝胶上培养。
[0053]
具体地，将组织剪切成组织块置于水凝胶上培养。当然，置于水凝胶上的组织是经过预处理的组织。预处理包括清洗及/或剔除不需要的组织。
[0054]
在其中一个实施例中，组织为采用1立方毫米～5立方毫米的组织块。1立方毫米～5立方毫米的组织块利于细胞爬出。在一个可选地具体示例中，组织块为1立方毫米、2立方
毫米、2.5立方毫米、3立方毫米、4立方毫米或5立方毫米。进一步地，组织块为2立方毫米～4立方毫米的组织块。
[0055]
在其中的一个实施例中，培养的条件为：37℃，5％co
2
。培养用的培养基为含有10％～15％(m/v)的胎牛血清的dmem/f12。可以理解的是，在其他实施方式中，培养条件不限于上述，可以根据培养的具体组织进行选择培养条件。当然，培养用的培养基也不限于上述，同样可以根据具体的组装进行选择。此外，培养用的培养基还可以添加抗生素。例如，青霉素、链霉素等。
[0056]
在其中一个实施例中，组织来源于脐带、骨髓、皮肤、血管或神经。在本实施方式中，组织为脐带组织。进一步地，组织为人源组织。
[0057]
步骤s3：将承装有水凝胶的培养容器置于4℃～20℃条件下，使得从组织中爬出的间充质干细胞从水凝胶上脱附。
[0058]
在培养过程中，组织贴覆于上述水凝胶上，从组织中爬出的间充质干细胞也贴覆于上述水凝胶上生长。当从组织中爬出的细胞的融合度为80％～90％而需要传代培养时，将承装有上述水凝胶的培养容器置于4℃～20℃条件下，上述水凝胶因温度降低，亲水性减弱，表现出疏水性，且体积缩小；贴覆于上述水凝胶上的间充质干细胞由于上述水凝胶表现出的疏水及收缩情况，而从上述水凝胶上脱落，从而避免胰酶消化或化学试剂解离对间充质干细胞造成损伤，进而提高间充质干细胞的质量和产量。
[0059]
在本实施方式中，在将所述培养容器置于4℃～20℃条件下，以使从组织中爬出的间充质干细胞从水凝胶上脱附的步骤中，不包括添加胰酶以消化从组织中爬出的间充质干细胞的步骤。
[0060]
在其中一个实施例中，在将从组织中爬出的间充质干细胞进行传代培养的过程中，用于传代培养的培养容器上设有上述水凝胶，从而进一步地提高传代培养的产量和质量；同时，由于避免使用胰酶(异源的免疫风险)，也使得制得的间充质干细胞的安全性提高，更利于临床应用。
[0061]
当然，在一些实施例中，还可以敲击培养容器的底部或使用培养基轻轻吹打细胞，促进细胞脱落。
[0062]
上述间充质干细胞的制备方法采用预置有水凝胶的培养容器培养组织，该水凝胶通过聚(n-异丙基丙烯酰胺)与壳聚糖和抗菌剂中的阳离子形成的复合物，促进从细胞从组织中爬出，提高细胞的产量；并且该水凝胶为温度敏感型水凝胶，当温度低于其临界溶解温度时，贴覆于水凝胶上的细胞由于水凝胶的体积相变而脱附，从而避免分离从组织爬出的细胞时胰酶消化对细胞的损伤，减少分离过程中细胞的死亡量，也在提高收获的细胞量的同时也提高了收获的细胞的活性，进一步提高了细胞的产量。
[0063]
具体实施例
[0064]
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
[0065]
实施例1
[0066]
1.脐带收集：收集足月健康剖宫产胎儿脐带(直径为1.6厘米)，浸没于含1％(m/v)
的青霉素和1％(m/v)链霉素的pbs中，置于冰上。
[0067]
2.组织分离：在超净台中将脐带剪裁为长约3cm的小段，分别纵向剖开，用无菌pbs反复冲洗至液体无血污，用止血钳和眼科去除一根静脉血管和两根动脉血管(共三根)，得到去除动脉血管和静脉血管后的所有脐带组织(去除动脉血管和静脉血管后的所有脐带组织如图1所示)，然后去除羊膜层，得到华通胶。
[0068]
3.制备pnipaam/cs水凝胶并包板：将n-异丙基丙烯酰胺单体(nipa)300mg、过硫酸铵(aps)6mg和n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)6mg置于棕色玻璃瓶中，再加入2.4ml的去离子水，充氮气氛围下搅拌使固体全部溶解，然后加入0.6ml的壳聚糖的质量百分含量为3％的壳聚糖溶液(即加入的壳聚糖的质量为18mg)和2.04mg的zncl
2
，得到反应液，其中，反应液中的壳聚糖的浓度为0.6％(m/v)，zncl
2
的浓度为5mmol/l。然后向反应液中加入10μl促进剂temed混匀，得到用于铺板的混合溶液，接着将该混合溶液倒入培养皿中，并使其覆盖培养皿的底部，密封反应24小时后用去离子水浸泡，每隔24小时换水1次，更换3次去离子水后，得到水凝胶包被的培养皿。
[0069]
4.将步骤2得到的华通胶剪切成2mm
3
的组织块，以pbs冲洗后，置于步骤3得到的水凝胶包被的培养皿的水凝胶上，加入15％(v/v)胎牛血清的dmem/f12培养基，在37℃5％co
2
培养箱中培养。
[0070]
5.倒置相差显微镜下观察步骤4的组织块周围细胞爬出情况，5天后爬出的细胞的情况如图2所示。5天后首次换液(换液是指将培养皿中的培养上清去除后，加入含15％(v/v)胎牛血清的dmem/f12培养基)，以后每隔4天换一次。当细胞扩增面积占培养皿底面积的80％时，将承装有组织块的培养皿转移至4℃放置30min，使细胞脱附，计数，细胞悬液离心后，按照50％接种密度接种到空的聚苯乙烯培养瓶培养(未铺水凝胶)。本文中，将从组织块中爬出且未进行传代的细胞记为零代间充质干细胞(p0)，将零代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第一代间充质干细胞(p1)，将第一代间充质干细胞传代培养而得到的间充质干细胞记为第二代间充质干细胞(p2)，其他以此类推。
[0071]
经统计，实施例1中，每3cm脐带组织中爬出的细胞(零代间充质干细胞)的量为5
×
10
5
个，组织块的贴壁率(贴壁组织块的面积/接种组织块的面积)为50％。
[0072]
6.表型鉴定：
[0073]
(1)将第三代间充质干细胞进行表型鉴定：具体地，取1
×
10
6
个细胞，加100μl的细胞染色缓冲液。然后根据抗体说明书加入相应体积的抗体[小鼠抗人pe、apc或fitc标志的单抗cd105、cd44、cd90、cd29、cd34、cd45和人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，hla)-dr]，室温孵育30min，1000r/min离心5min，弃上清，加入500μl pbs上流式细胞仪进行检测。结果如表1和图3所示。图3为cd105、cd90、hla-dr、cd73、cd34、cd14和cd45的结果。
[0074]
表1
[0075][0076]
由表1和图3可知，第三代间充质干细胞的表面表达cd105、cd73、cd90、cd45、cd34、cd14、cd19和hla-dr的阳性率符合国际标准(国际标准中规定，间充质干细胞的细胞表面表达cd105、cd73和cd90(≥95％)，不表达cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79α或(≤2％))。
[0077]
7.诱导分化
[0078]
(1)成骨分化：用成骨培养液(由10％(v/v)fbs的dmem/f12与β-甘油磷酸钠、维生素c和地塞米松混合而成，成骨培养液含有10mmol/lβ-甘油磷酸钠、0.05mmol/l维生素c和100mmol/l地塞米松)将第四代间充质干细胞培养21天后，茜素红染色观察。结果显示，第四代间充质干细胞具有成骨能力。
[0079]
(2)成脂分化：用成脂培养液(由10％(v/v)fbs的dmem/f12与地塞米松、异丁基-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素混合而成，成脂培养液中含1
×
10-3
mol/l地塞米松、100mg/l异丁基-甲基黄嘌呤、100mg/l吲哚美辛和10mg/l胰岛素)将第四代间充质干细胞培养21天后，用4％多聚甲醛固定细胞，进行油红o染色，结果如图4所示。由图4可知，第四代间充质干细胞具有成脂能力。
[0080]
(3)软骨向分化：用成软骨培养液(由dmem/f12与地塞米松、转移生长因子β1、抗坏血酸、lits、丙酮酸钠、亚油酸和牛血清白蛋白混合而成，成软骨培养液含1
×
10-8
mol/l地塞米松、20μg/l转移生长因子β1、10mmol/l抗坏血酸、50mg/m lits、1mm丙酮酸钠、5.35μg/mg亚油酸和1.25ng/ml牛血清白蛋白)将第四代的间充质干细胞培养21天后，用10％甲醛固定细胞1h，进行1％甲苯胺蓝染色3h，加入95％乙醇，烘干后中性树胶封片。结果显示，第四代间充质干细胞具有成软骨能力。
[0081]
综上，实施例1制得的间充质干细胞具有良好的分化潜能。
[0082]
实施例2
[0083]
实施例2的间充质干细胞的制备方法与实施例1大致相同，其不同在于，实施例2的制备pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤中的壳聚糖的含量与实施例1的不同，实施例2制备
pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤包括：将异丙基丙烯酰胺单体(nipa)300mg、过硫酸铵(aps)6mg和n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)6mg置于棕色玻璃瓶中，再加入1.8ml的去离子水，充氮气氛围下搅拌使固体全部溶解，然后加入1.2ml的壳聚糖的质量百分含量为3％的壳聚糖溶液(即加入的壳聚糖的质量为36mg)和2.04mg的zncl
2
，得到反应液，其中，反应液中的壳聚糖的浓度为1.2％(m/v)，zncl
2
的浓度为5mmol/l。然后向反应液中加入10μl促进剂temed混匀，得到用于铺板的混合溶液，接着将该混合溶液倒入培养皿中，并使其覆盖培养皿的底部，密封反应24小时后用去离子水浸泡，每隔24小时换水1次，更换3次去离子水后，得到水凝胶包被的培养皿。
[0084]
经统计，实施例2中，每3cm脐带组织中爬出的细胞的量为1
×
10
6
个，组织块的贴壁率为60％。
[0085]
实施例2的流式结果如图5所示，由图5可知，实施例2的间充质干细胞的制备方法制得的间充质干细胞符合国际标准。
[0086]
实施例3
[0087]
实施例3的间充质干细胞的制备方法与实施例1大致相同，其不同在于，实施例3的制备pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤中的壳聚糖的含量与实施例1的不同，实施例4制备pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤包括：将异丙基丙烯酰胺单体(nipa)300mg、过硫酸铵(aps)6mg和n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)6mg置于棕色玻璃瓶中，再加入1.2ml的去离子水，充氮气氛围下搅拌使固体全部溶解，然后加入1.8ml的壳聚糖的质量百分含量为3％的壳聚糖溶液(即加入的壳聚糖的质量为54mg)和2.04mg zncl
2
，得到反应液，其中，反应液中的壳聚糖的浓度为1.8％(m/v)，zncl
2
的浓度为5mmol/l。然后向反应液中加入10μl促进剂temed混匀，得到用于铺板的混合溶液，接着将该混合溶液倒入培养皿中，并使其覆盖培养皿的底部，密封反应24小时后用去离子水浸泡，每隔24小时换水1次，更换3次去离子水后，得到水凝胶包被的培养皿。
[0088]
经统计，实施例4中，每3cm脐带组织中爬出的细胞的量为7
×
10
5
个，组织块的贴壁率为50％。
[0089]
对比例1
[0090]
对比例1的间充质干细胞的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例1省略了在培养皿上包被pnipaam/cs水凝胶的步骤。对比例1将由步骤2得到华通胶切成2mm
3
的组织块后，以pbs冲洗，置于空的培养皿上，然后加入15％(v/v)胎牛血清的dmem/f12培养基，在37℃5％co
2
培养箱中培养。
[0091]
经统计，对比例1中，每3cm脐带组织中爬出的细胞的量为1
×
10
4
个，组织块的贴壁率为5％。
[0092]
对比例1的流式结果如图6所示，由图6可知，对比例1的间充质干细胞的制备方法制得的间充质干细胞符合国际标准。
[0093]
对比例2
[0094]
对比例2的间充质干细胞的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例2制备的pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤中的异丙基丙烯酰胺单体的含量与实施例1的不同，对比例2制备pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤包括：将异丙基丙烯酰胺单体(nipa)100mg、过硫酸铵(aps)6mg和n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)6mg置于棕色玻璃瓶中，再加入2.6ml的
去离子水，充氮气氛围下搅拌使固体全部溶解，然后加入0.4ml的壳聚糖的质量百分含量为3％的壳聚糖溶液(即加入的壳聚糖的质量为12mg)和2.04mg的zncl
2
，得到反应液，其中，反应液中的壳聚糖的浓度为0.4％(m/v)，zncl
2
的浓度为5mmol/l。然后向反应液中加入10μl促进剂temed混匀，得到用于铺板的混合溶液，接着将该混合溶液倒入培养皿中，并使其覆盖培养皿的底部，密封反应24小时后用去离子水浸泡，每隔24小时换水1次，更换3次去离子水后，得到水凝胶包被的培养皿。
[0095]
经统计，对比例1中，每3cm脐带组织中爬出的细胞的量为5
×
10
4
个，组织块的贴壁率为20％。
[0096]
对比例3
[0097]
对比例3的间充质干细胞的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例3制备的pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤中的壳聚糖的含量与实施例1的不同，对比例3制备pnipaam/cs水凝胶并包板的步骤包括：将异丙基丙烯酰胺单体(nipa)300mg、过硫酸铵(aps)6mg和n，n
’-
亚甲基双丙烯酰胺(bis)6mg置于棕色玻璃瓶中，再加入1ml的去离子水，充氮气氛围下搅拌使固体全部溶解，然后加入2ml的的壳聚糖的质量百分含量为3％的壳聚糖溶液(即加入的壳聚糖的质量为60mg)和2.04mg的zncl
2
，得到反应液，其中，反应液中的壳聚糖的浓度为2％(m/v)，反应液中的zncl
2
的浓度为5mmol/l。然后向反应液中加入10μl促进剂temed混匀，得到用于铺板的混合溶液，接着将该混合溶液倒入培养皿中，并使其覆盖培养皿的底部，密封反应24小时后用去离子水浸泡，每隔24小时换水1次，更换3次去离子水后，得到水凝胶包被的培养皿。
[0098]
经统计，对比例1中，每3cm脐带组织中爬出的细胞的量为2
×
10
4
个，组织块的贴壁率为10％。
[0099]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0100]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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