调控棉花纤维伸长的基因GhBLH1及其应用的制作方法

调控棉花纤维伸长的基因ghblh1及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于棉花基因工程领域，具体涉及基因ghblh1及其在调控棉花纤维细胞伸长中的应用。


背景技术：

[0002]
已有的研究表明赤霉素在棉花纤维发育过程中发挥着重要的作用。外源施加赤霉素更是可以显著促进纤维细胞的起始和伸长，而外源施加赤霉素合成抑制剂paclobutrazol可以显著抑制纤维发育
[1]
。赤霉素信号通路中的两个关键蛋白gid1和slr1在纤维细胞中特异表达
[2]
。ghslr1能与ghgid1相互作用并响应赤霉素处理，过表达ghslr1导致拟南芥植株矮化且赤霉素应答基因表达量上升
[3]
。此外，过表达赤霉素合成的关键酶ga20-oxidase(ga20ox)显著增加赤霉素的含量及促进纤维细胞起始和伸长
[4]
。这些研究表明赤霉素信号通路与棉纤维细胞发育密切相关，但赤霉素信号通路是如何调控棉花纤维发育的过程并不清楚。本发明人团队通过分析赤霉素处理后胚珠的转录组数据，从中得到16个赤霉素处理后表达量显著升高的转录因子，利用酵母双杂交系统，从中筛选发现转录因子ghblh1可与棉花della(ghslr1)蛋白相互作用。通过赤霉素处理，显著诱导ghblh1基因的表达，而多效唑则显著抑制ghblh1基因的表达。ghblh1基因在纤维细胞快速伸长期表达量最高。ghblh1过量表达促进纤维伸长；ghblh1干涉后棉花纤维长度显著变短。
[0003]
[1]liao w b,ruan m b,cui b m,et al.isolation and characterization of a gai/rga-like gene from gossypium hirsutum[j].plant growth regulation,2009,58(1):35-45.
[0004]
[2]aleman l,kitamura j,abdel-mageed h,et al.functional analysis of cotton orthologs of ga signal transduction factors gid1 and slr1[j].plant molecular biology,2008,68(1-2):1.
[0005]
[3]griffiths j,murase k,rieu i,et al.genetic characterization and functional analysis of the gid1 gibberellin receptors in arabidopsis[j].the plant cell,2006,18(12):3399-3414.
[0006]
[4]xiao y h,li d m,yin m h,et al.gibberellin 20-oxidase promotes initiation and elongation of cotton fibers by regulating gibberellin synthesis[j].journal of plant physiology,2010,167(10):829-837.


技术实现要素：

[0007]
本发明所要解决的技术问题是如何调控棉花的纤维伸长发育，将ghblh1基因转入棉花中后，可以调控棉花纤维细胞的发育，从而显著增加棉花纤维的长度，依据是在赤霉素存在下，della蛋白ghslr1通过蛋白酶体途径被降解并释放与其互作的ghblh1，进而ghblh1通过mid结构域(meinox interacting domain)和homeodomain结构域与转录激活因子ghknox6蛋白发生互作。
[0008]
为解决上述技术问题，本发明提供调控植物发育的ghblh1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0009]
本发明还提供所述的基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系；其中，所述的重组表达载体，优选为植物表达载体，优选是将所述基因片段连接到载体pbi121或phellsgate4中，得到的重组质粒pbi121-ghblh或phellsgate4-ghblh。
[0010]
同时，本发明还提供所述的ghblh1基因，或所述的重组达载体在调控植物发育中的应用。
[0011]
所述的应用，其是在调控纤维细胞发育中的应用；优选在调控纤维细胞的伸长中的应用。
[0012]
所述的应用，其是将所述的ghblh1基因导入目的植物中，进行过表达，得到纤维细胞伸长的转基因植物。
[0013]
所述植物是双子叶植物，单子叶植物，禾本科植物，十字花科植物,拟南芥，野生型拟南芥columbia；所述植物优选为棉花，更为优选为亚洲棉，陆地棉，或雷蒙德式棉。
[0014]
本领域的普通技术人员可采用已知方法，对本发明的基因ghblh1的核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰后得到的具有与本发明基因ghblh1的核苷酸序列75％或是更高同一性的核苷酸，只要编码基因ghblh1且具有基因ghblh1的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列且等同于本发明的序列。
[0015]
本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入编码基因ghblh1，得到生长发育不同于所述受体植物的转基因植物。
[0016]
上述方法中，所述“向受体植物中导入基因ghblh1”，可通过向受体植物中导入重组质粒实现。
[0017]
所述重组质粒具体可为重组质粒pbi121-ghblh1，phellsgate4-ghblh。
[0018]
本发明具有以下有益效果：
[0019]
本发明所述的ghblh1基因，通过在赤霉素存在下，della蛋白ghslr1通过蛋白酶体途径被降解并释放与其互作的ghblh1，进而ghblh1通过mid结构域和homeodomain结构域与转录激活因子ghknox6蛋白发生互作，从而调控棉纤维发育，促进细胞伸长。本发明首先利用clustalx和dnaman软件分析了ghblh1蛋白与模式植物拟南芥同源蛋白之间的进化关系，与atblh1蛋白同源性为42％，本研究团队利用qrt-pcr技术，检测ghblh1在纤维不同发育时期的表达量，显示ghblh1在开花后15d的纤维中表达量最高，在20d时表达量下降，推测ghblh1可能在棉花纤维的伸长期发挥重要作用。通过拟南芥过表达和突变体互补实验，验证ghblh1基因参与棉花纤维细胞发育。接下来又将ghblh1过表达载体和基因干涉载体，转入棉花中，筛选得到ghblh1转基因棉花。同时，检测野生型棉花、过表达棉花和基因干涉株系的纤维长度。结果显示过表达ghblh1显著增加纤维长度，而干涉ghblh1基因显著抑制纤维长度，说明ghblh1基因调控纤维细胞发育。
[0020]
本发明提供了ghblh1基因在调控棉花纤维发育中的应用，将本发明的ghblh1基因转入棉花中后，可使棉花纤维伸长，对棉花纤维品质的研究和改良具有重大的意义。
附图说明
[0021]
图1：ghblh1在棉纤维不同发育时期的表达分析；
[0022]
图2：ghblh转基因拟南芥表型及表皮毛数量统计；
[0023]
图3:(a)ghblh1过表达转基因棉花植株分子鉴定，(b)ghblh1 rnai转基因棉花植株分子鉴定，(c)转基因棉花纤维表型，(d)转基因棉花纤维长度测量。
具体实施方式
[0024]
下面结合具体实施方法对本发明进行进一步的详细描述，给出的实例仅为了阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0025]
下述实例中，试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到；定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值；材料选择分别为开花后0、3、5、10、15、20天的棉花纤维组织，在文中分别简称为0dpa、3dpa、5dpa、10dpa、15dpa、20dpa。
[0026]
棉花品种徐州棉142，公知品种(也可从中国农业科学院棉花研究所获得)。
[0027]
野生型拟南芥columbia记载在如下文献中：
[0028]
a gigon，ar matos，d laffray，y zuily-fodil，at pham-thi.effect of drought stress on lipid metabolism in the leaves of arabidopsis thaliana(ecotype columbia).annals of botany,2004,94(3):345-351.
[0029]
根癌农杆菌gv3101记载在如下文献中：肖卫民，赵名琛，邹敏，苏承刚，杜小兵.拟南芥受伤和接种根癌农杆菌gv3101对转录的影响.《农业生物技术学报》,2013,21(5):537-545.
[0030]
质粒pbi121记载在如下文献中：曹家树，向珣，余小林，叶纨芝.pbi121表达载体及其转化植株的快速鉴定.《浙江大学学报》2008.34(2):137-142。
[0031]
光暗交替培养即光培养和暗培养交替，具体培养周期具体可为：14小时光照培养/10小时黑暗培养。
[0032]
本发明人通过棉花胚珠离体培养和大规模测序技术进行棉纤维高通量测序，筛选到16个ga处理后表达量显著升高的转录因子，ghblh1是其中之一，转录因子ghblh1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0033]
实施例1：ghblh1基因在棉花纤维发育不同时期的表达模式
[0034]
1、提取徐州棉142纤维发育不同时期0dpa、3dpa、5dpa、10dpa、15dpa、20dpa纤维组织的rna，反转录成第一条链cdna，根据优势基因序列设计引物，ghblh1-qrt-f:c c a a g g a g t a g c g t c a a t g a g t和g h b l h 1-q r t-r:c c a c t a c c g g t a t t a t c a g t t c c t进行q-p c r扩增。
[0035]
2、完成上述实验所使用的程序为95℃预变性15s；95℃变性5s，60℃复性34s，72℃延伸40s(数据接收)；共40个循环。
[0036]
3、完成上述试验所用内参基因为ghubq7,引物序列为ghubq7-f:ggcattccacctgaccaacaa，ghubq7-r:ccgcattagggcactcttttc。
[0037]
4、上述每个反应均设置3次生物重复和3次技术重复，相对定量的差异表达分析采用2
–
δδct
法，该方法记载在如下文献中(analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2
–
δδct method.livak and schmittgen,2001:25,402-408.
[0038]
5、定量表达的结果分析见图1。
[0039]
6、结果证明：ghblh1在15dpa显著高表达，而在20dpa时表达量下降，推测ghblh1可能与纤维伸长发育有关。
[0040]
实施例2：ghblh1过表达拟南芥和突变互补的表型鉴定
[0041]
一、重组质粒pbi121-ghblh过表达的构建
[0042]
1、用引物扩增得到目的基因片段，引物序列见下表。
[0043]
以棉花基因组(https://cottonfgd.org/)序列为参考设计引物，通过pcr扩增获得ghblh1基因的全长。以棉花15天纤维(棉花开花15天后的棉花纤维组织)的cdna为模板，扩增获得带酶切位点的ghblh1基因全长，下表引物中前9个核苷酸为保护碱基和酶切位点，下划线的为目的基因的序列，
[0044][0045]
2、同源重组的方法将目的基因片段连接到载体pbi121中，得到重组质粒pbi121-ghblh。
[0046]
3、将重组质粒pbi121-ghblh导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。
[0047]
4.用花序侵染法侵染野生型拟南芥和blh拟南芥突变体，将收获的t
0
代种子点在含70mg/l kana的1/2ms平板上，筛选得到阳性苗后，移植于营养土中，收得t
3
代种子后，进行表型鉴定，发现过表达拟南芥中茎表皮毛数量明显增多，ghblh1互补到blh1突变体后，茎表皮毛数量也恢复到野生型水平。表明blh1基因参与拟南芥茎表皮毛的发育。棉花纤维发育与拟南芥表皮毛发育有很多相似之处，暗示ghblh1基因可能参与棉花纤维细胞发育，ghblh转基因拟南芥表型及表皮毛数量统计见图2和下表，
[0048] wtblh1wt/35s::ghblh1blh1/35s::ghblh1表皮毛数量77
±
866
±
1286
±
1678
±
7
[0049]
。
[0050]
实施例3：ghblh1转基因棉花植株的获得和表型分析
[0051]
一、重组质粒pbi121-ghblh过表达的构建
[0052]
1、用引物扩增得到目的基因片段，引物序列同实施例2。
[0053]
以棉花15天纤维的cdna为模板，扩增获得带载体同源臂的ghblh1基因片段。
[0054]
2、同源重组的方法将目的基因片段连接到载体pbi121中，得到重组质粒pbi121-ghblh。
[0055]
3、将重组质粒pbi121-ghblh导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。
[0056]
二、重组质粒phellsgate4-ghblh基因干涉载体的构建
[0057]
1、用包含接头序列的引物扩増一段大约500bp目的基因特异片段。
[0058]
2.通过bp酶连接至rnai干扰载体phellsgate4，引物序列见下表。
[0059]
[0060][0061]
3.连接产物转化trans1-t1感受态细胞，分别用xho-和xba-单酶切鉴定，如果两次单酶切的片段大小一致说明载体构建成功。
[0062]
4.将重组质粒phellsgate4-ghblh导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。
[0063]
三、转基因植株的获得
[0064]
将上述获得的两种重组农杆菌侵染棉花的下胚轴段，获得胚性愈伤组织，和无菌苗，嫁接后鉴定阳性苗获得阳性植株，加代繁殖得到t
3
代纯合转基因植株。进行分子检测，结果见图3a、b，结果表明ghblh1的过表达载体和基因干涉载体已经成功转入棉花植株中。
[0065]
四、ghblh1转基因棉花纤维长度的测量
[0066]
随机选取过表达棉花株系和基因干涉株系的成熟纤维各10株，每株随机取15个棉桃，将纤维数次拉扯后使纤维平行，同时去掉附着的纤维。将纤维束放在黑色绒板上，用标尺衡量长度，见图3c、图3d，统计结果如下表
[0067] wlid typeblh1-oeblh1-rnai纤维长度(mm)26.8
±
0.428.9
±
0.525.0
±
0.4
[0068]
。
[0069]
表明野生型植株纤维长度平均为27mm，ghblh1过表达植株纤维长度为32mm，过表达植株纤维长度增加18％；ghblh1基因干涉株系纤维长度为23mm，相对于野生型纤维长度缩短15％。说明过表达ghblh1显著增加纤维长度，而干涉ghblh1基因显著抑制纤维长度，说明ghblh1基因调控纤维细胞发育。

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