转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌及应用的制作方法

[0001]
本发明涉及利用分子生物学技术，通过重构嗜木质素芽孢杆菌菌株的代谢途径获得能够大量蓄积香草醛的嗜木质素芽孢杆菌基因工程菌(以下简称基因工程菌)，实现将含木质素类生物质或者工业木质素及它们的解聚产物转化合成香草醛的方法，属于生物技术领域。


背景技术：

[0002]
香草醛(vanillin，c
8
h
8
o
3
)，学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，也称之为香兰素，是世界上产量最大、用途最广的广谱型高档香料，应用于食品、日化、橡胶、塑料和医药等行业。
[0003]
化学合成方法合成香兰素是市场主要香兰素的来源，年产量已经高达20000吨，但是化学合成香兰素虽然成本低廉，规模大，但是容易造成环境污染，且不能满足人们对天然食品的要求。
[0004]
天然香兰素目前主要通过香荚兰豆提取获得，但是由于香荚兰种植中需要人工授粉，劳动强度大，难以大规模种植。目前香荚兰的种植量每年仅仅在2000-3000吨左右，提取的天然香兰素的产量仅仅20吨左右，市场售价高达3200美元/kg。近年来消费者对天然香兰素的需求越来越大，并且一些国外(例如欧洲)的立法机构，建议在食品中使用天然香兰素，但用植物组织提取的方法产率低、成本高、造成了天然香兰素的紧缺。
[0005]
微生物降解转化木质素，具有转化法工艺简单，收率较高、能耗低、产品安全等优点。美国食品药品监督管理局规定“天然香料必须是来自于植物或动物的原料，经物理、酶法或者微生物加工过程得到的产品”。因此，微生物法转化合成香兰素，将是今后发展的重要趋势。
[0006]
木质素作为全球最丰富的天然芳香化合物的主要来源，长久以来未得到重视和利用。如何将木质素成分转变为高值化产品是提高解聚木质素综合利用的一个可行途径。木质素解聚产物中含有大量的阿魏酸、肉桂酸、香草酸、香草醛和香豆酸等芳香化合物。通过生物方法将木质素中的芳香化合物转化为特定单一的芳香化合物，对实现木质素的高值化利用具有重要的现实意义，也是实现农林业可持续发展的要求。木质素化学降解分离纯化香草醛已经有不少相关报道，例如碱性条件下氧化解聚木质素后再提取分离获得香草醛，缺点是使用的催化剂主要为贵金属和过渡金属基催化剂，成本较高并且分离纯化困难，并且容易造成污染，因此很难得到工业应用。通过生物方法在温和条件下将木质素转化为香草醛，避免了使用催化剂和产生环境污染物，是未来利用木质素转化生产香兰素可行的方法之一。之前有报道构建的工程菌rhodococcus jostii rha045可以利用麦草秸秆和葡萄糖做原料生产香草醛，6天的发酵后可以达到96mg/l的产量(paul d.sainsbury,et al.acs chemical biology,2013,8,2151-2156)。但是这株菌不能利用木质素做单碳源，使用碱性木质素做碳源发酵48-72小时，仅仅得到1.0-1.3g/l的香草醛，显然这株菌不适合利用木质素生产香兰素。而且6天的过长发酵时间也影响了香兰素生产的效率，所以难以实现木质素转化香兰素的生产。
[0007]
嗜木质素芽孢杆菌l1是在深海沉积物中筛选到的一株嗜碱耐盐的极端微生物，其能够在ph 7-11的环境中生存，l1生长适应性强(10-50℃、ph 6.0-11.0、0-10％nacl，最适生长ph 9)，是目前已知的木质素降解菌中对碱耐受性最高菌株之一。我们前期研究表明：香草醛和香草酸是β-芳基醚、联苯、二芳基丙烷和阿魏酸等途径的共同中间产物，在l1解聚碱性木质素的芳香产物中占比高达30-44.2％(zhu d,et al.biotechnology for biofuels,2017,10(1):44)。表明香草醛是木质素生物解聚和转化最理想的目标产物之一。香草醛可以通过香草醛脱氢酶转化为香草酸。因此，敲除香草醛脱氢酶基因，阻断香兰素的降解，能够实现香兰素的大量积累。
[0008]
本发明所要解决的技术问题是通过构建基因工程菌株，提供一种高效的将木质素类生物质及其解聚产物转化制备香草醛的方法。


技术实现要素：

[0009]
本发明目的是公开一种将木质素包括各种工业木质素和造纸黑液等廉价物质转化为高附加值的芳香化合物香草醛的方法，本发明所述的方法解决了木质素的高值化利用瓶颈，实现了生物转化合成香草醛，具有重要的工业价值。
[0010]
本发明公开了一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌，该菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(bacillus ligniniphilus)l1-vdh,其已于2019年12月20日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议的分类命名为bacillus ligniniphilus，保藏号为：cgmcc no.19226。
[0011]
应用上述一株转化含木质素类生物质合成香草醛的基因工程菌转化含木质素类生物质合成香草醛的方法，按照下述步骤进行：
[0012]
(1)木质素解聚混合物的制备：将工业木质素或者预处理后的含木质素预处理液采用热裂解方法、酶解聚方法、微波、金属催化剂裂解方法、碱水解方法等方法的一种处理，达到解聚木质素的目的，解聚反应液ph调至中性备用。
[0013]
其中步骤(1)所述的热裂解方法：将不高于10％(v/v)的木质素水溶液在反应釜中以250-450℃的温度热裂解5-30分钟。压力控制在30兆帕以内。
[0014]
其中步骤(1)所述的酶解聚方法：将漆酶以0.1g/l的浓度溶解有乙酸盐缓冲液(ph 4)中，然后将漆酶溶液以1:1(v/v)比例与10％的木质素溶液混合均匀，在30℃下反应12小时。
[0015]
其中步骤(1)所述的碱水解方法：将不高于10％(g/v)的氢氧化钠溶液加入木质素(溶液中木质素含量不超过10g/l)，在80-100℃下处理1-6h。
[0016]
其中步骤(1)所述的金属催化剂裂解方法：以金属催化剂(镍、钛、锌等)为催化剂，在10％的木质素溶液体系中100-300℃下处理0.5-1h。将木质素以1-10％(g/l)的浓度溶解于2-10％nacl溶液当中，然后在反应釜中60-200℃反应1-3小时后收集滤液备用。
[0017]
(2)将嗜木质素芽孢杆菌(bacillus ligniniphilus)的基因工程菌l1-vdh(保藏号：cgmcc no.19226)冻存管接种到含有卡那霉素(50μg.ml-1
)的2216e培养基中37℃活化预培养24h，然后按照1:10(v/v)的比例接入发酵培养基在发酵罐内37℃培养24h，通过naoh和hcl调整ph在9左右，培养过程中通过补料方式在葡萄糖低于5g/l的时候补充葡萄糖，在发
酵od值30以上时停止发酵，然后将发酵液置换为以木质素解聚产物为单碳源的mm63培养基，在37℃继续培养24h，通过naoh和hcl调整ph在9左右，以hplc检测香草醛合成量。
[0018]
其中步骤(2)2216e培养基成分如下：蛋白胨5g/l，酵母粉1g/l，柠檬酸铁0.1g/l，氯化钠19.45g/l，氯化镁5.97g/l，硫酸钠3.24g/l，氯化钙1.8g/l，碳酸钠0.16g/l，溴化钾0.08g/l，氯化锶0.034g/l，硼酸0.022g/l，硅酸钠0.004g/l，氟化钠0.0024g/l，硝酸钠0.0016g/l，磷酸二氢钠0.008g/l。
[0019]
其中步骤(2)所述的所述的发酵培养基成分如下：酶解豆粕粉50g/l，玉米浆粉30g/l，葡萄糖10g/l，feso
4 0.1g/l，mgso
4 0.5g/l，磷酸盐缓冲液50mm。
[0020]
其中步骤(2)所述的mm63培养基成分如下：100mm kh
2
po
4
,75mm koh,15mm(nh
4
)
2
so
4
,1mm mgso
4
,3.9μm feso
4
，木质素解聚产物1-30g/l。
[0021]
(3)发酵液通过离心或者陶瓷膜过滤收集上清液，置入储罐备用。收集的菌体通过高压均质机破碎细胞，然后通过陶瓷膜过滤收集上清液，然后与发酵液上清液合并置入储罐。
[0022]
(4)上清液通过聚砜超滤膜除去杂蛋白、多肽、多糖等其它聚合物，收集滤液。
[0023]
(5)滤液经有机溶剂萃取、浓缩、结晶等常规步骤制备香草醛。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
本发明涉及将各种木质素以高效微生物转化方式合成香草醛的新方法。木质素由于其组成成分复杂，解聚后产生的化合物多达几十种，难以分离纯化和利用。本发明可以将木质素及解聚产物通过基因工程改造微生物的生物合成转化得到主要产物香草醛。为木质素的高值化利用提供了有效方法。并且微生物合成香草醛被认为是天然香草醛的一种，可以作为天然香料的添加剂。
附图说明
[0026]
图1为香草醛脱氢酶基因敲除示意图；
[0027]
图2为hplc方法检测发酵液中香草醛的含量。
具体实施方式
[0028]
现在参照以下实施例来描述本发明，这些实施例仅为了例证的目的被提供，并且本发明不限于这些实施例，而是涵盖作为本文提供的指导的结果是显著的所有的变型。
[0029]
本发明的实施方式
[0030]
以下文详细的说明了本发明的实施方式。
[0031]
本发明是利用木质素为底物通过微生物转化合成香草醛的方法，该方法包括以后述的木质素为原料，或者以通过系列生物、化学或者物理方法解聚后的木质素为原料以基因工程菌解聚转化合成香草醛并提取到有机溶剂相中，然后进一步精制纯化。
[0032]
在本发明的香草醛微生物合成制备方法中，作为底物的木质素生物质只要是含有苯丙烷单元的木质素为主要成分之一的来源于植物生物质即可，没有特殊的限制。其具体例子可列举如：杨木、柳木、松木、木屑、芒草、柳枝稷、高粱秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、麦秆、蔗渣、稻壳粉、麦麸、碱性木质素、木质素磺酸钠、木质素硫酸钠、磨木木质素、木糖渣、醋糟、造纸黑液等。
[0033]
本发明所选用的微生物为嗜木质素芽孢杆菌l1的典型株。
[0034]
本发明所选用的嗜木质素芽孢杆菌l1的香草醛脱氢酶基因敲除方法可以为同源臂重组方法或者crisp-cas9基因编辑方法或者其他能够将香草醛脱氢酶基因失活的方法。
[0035]
本发明的香草醛合成制备方法中，木质素解聚方法包括并不限于热裂解、酶法、微波、金属催化剂、碱催化方法。
[0036]
本发明中的“解聚”是指木质素结构能够达到产生阿魏酸、对香豆酸等单体芳香化合物的程度。
[0037]
本发明中基因工程菌培养用的培养基和培养方法没有特殊的限制，可以恰当的选择合适作为菌生长和转化的营养成分和培养方法。培养时间也没有特殊的限制，只要可以将木质素解聚产物能够转化合成所需目标量的香草醛即可。优选菌体生长培养基为2216e培养基(成分g/l,蛋白胨5，酵母粉1，柠檬酸铁0.1，氯化钠19.45，氯化镁5.97，硫酸钠3.24，氯化钙1.8，碳酸钠0.16，溴化钾0.08，氯化锶0.034，硼酸0.022，硅酸钠0.004，氟化钠0.0024，硝酸钠0.0016，磷酸二氢钠0.008)。
[0038]
本发明中基因工程菌培养时间也没有特殊的限制，只要可以将木质素解聚产物能够转化合成所需目标量的香草醛即可，优选24h。在上述情况下的香草醛的产量根据目的没有特殊的限制，就例如单位培养基中香草醛的含量而言，可以是例如0.2mg/l以上，优选100mg/l以上，更优选300mg/l以上。
[0039]
在本发明的香草醛合成转化方法中，从上述培养液中提取香草醛时，可以从微生物培养液直接提取，也可以根据需要破碎上述细菌细胞成为细胞破碎物，从所述破碎物中提取。提取和破碎也可以同时进行。
[0040]
本发明中香草醛提取时所用有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丁酮、环己酮、乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸正丙酯、二甲基亚砜等一种或多种以不同比例混合。
[0041]
菌体分离方法可以为离心方法也可以是陶瓷膜过滤方法。过滤液通过超滤膜进一步去除多糖、蛋白、细胞壁碎片等生物大分子。
[0042]
纯化方法可以是离子交换柱、大孔树脂或者硅胶柱洗脱。
[0043]
实施例1：实施例同源臂法基因敲除工程菌l1-vdh的构建
[0044]
利用引物设计软件(primer premier 5.0)软件根据香草醛脱氢酶基因vdh序列(seq id no.1)的上下游500bp范围内设计上下游同源臂引物，并分别添加酶切位点(kpni、hindiii、noti和psti)(构建基因敲除菌所设计的引物见表1)。克隆载体的构建：通过pcr分别克隆目的基因(命名为ch1-ch7)的上下游同源臂，产物纯化后连接到pmd19-t质粒并转化到大肠杆菌e.coli bl21感受态细胞(购自苏州泓迅生物科技有限公司)，鉴定阳性克隆(pt-ch-up，pt-ch-down)。敲除载体的构建：用内切酶kpni和hindiii分别消化上游阳性克隆质粒和pks1温敏型质粒，得到携带相同粘性末端的同源片段，将上游同源片段克隆到pks1并双酶切验证阳性克隆(pks1-ch-up)。用内切酶noti和psti分别消化pt-ch-down和pks1-ch-up并回收纯化双酶切产物，将下游同源片段克隆到pks1-ch-up质粒，验证阳性克隆(pks1-ch-up-down)。将阳性克隆pks1-ch-up-down通过电转方法转到细菌l1的感受态细胞转化，温度诱导敲除方法获得敲除阳性菌，通过电泳验证基因的成功敲除(流程见图1)。该工程菌命名为嗜木质素芽孢杆菌(bacillus ligniniphilus)l1-vdh,其已于2019年12月
1mpa，温度为40℃。上清液置于储罐备用。菌体沉淀经过均质机破壁后16000转高速离心，收集上清液，合并到两种上清液。然后上清液通过截留分子量2500以上10-100nm聚砜膜进行超滤，收集滤液。滤液用石油醚按1：1(v/v)连续萃取，然后通过二效蒸发器减压浓缩回收石油醚，得到饱和浓缩液。将饱和浓缩液泵入第一级结晶罐，然后饱和料液从第一级结晶罐进入第二级结晶罐。然后进入第三级结晶罐。最终达到结晶率在80％以上。结晶的香草醛冷水洗涤后烘干得到成品，hplc检测纯度为99.5％。
[0055]
实施例6：:利用造纸黑液为底物转化合成香草醛及提取分离
[0056]
将造纸黑液通过喷雾干燥，收集造纸黑液干燥粉备用。将基因工程菌l1-vdh接种到2216e培养基(含有卡那霉素10μg/l)，三角瓶扩培24小时，然后接种到50l发酵罐，发酵培养基为2216e培养基，发酵18小时后置换为含有10％造纸黑液喷干粉的mm63培养基。然后继续培养24-36小时。通过hplc检测香草醛在培养液的含量为1.23g/l。发酵液经过均质机破壁后5000转离心，收集上清液，上清液用5倍体积的乙醚萃取，然后减压浓缩回收乙醚，得到香草醛浓缩液。将香草醛浓缩液，将香草醛浓缩液与10倍重量的苯乙烯非极性大孔树脂搅拌均匀装柱吸附，ph调至6-7。用10％乙醇水溶液洗脱，通过硅胶薄层层析鉴定香草醛洗脱成分(正丁醇：冰醋酸：水＝5:1:3)，合并含有香草醛的洗脱液，然后减压浓缩。浓缩液冷却后析出结晶，然后通过重结晶获得香草醛结晶粉。hplc检测纯度为98％。收率为7.6％。
[0057]

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