一种miR-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用与流程

一种mir-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用
技术领域
[0001]
本发明属于间充质干细胞基因改造的技术领域，尤其涉及一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
皮肤经常因各种内在病理及外界机械因素而受损，这些急、慢性的皮肤缺损给患者及社会带来了沉重的负担。如何加速创面的愈合，促进创面的修复显得尤为重要。皮肤损伤是多种细胞死亡方式和炎性因子相互作用的综合结果，针对皮肤损伤的治疗应该是综合的再生策略。
[0003]
在创面修复领域，间充质干细胞疗法取得了可喜的治疗效果。起初研究认为间充质干细胞发挥创面修复作用主要与其多向分化潜能有关，近来研究发现，msc主要通过分泌细胞因子和外泌体(exosomes)等发挥生物学功能。外泌体是细胞释放的，直径为50～100nm的微粒，含有磷脂、微小rna等多种生物活性成分，是细胞间信息及遗传物质的传递载体。干细胞来源的外泌体仅具有干细胞本身的生物学特性，因此如果能够改变外泌体中的组成和丰度，可增强外泌体的效果，使干细胞外泌体更好的发挥促进血管新生、调节免疫、抑制纤维化、促进细胞增殖迁移与分化等作用；目前尚没有一种有效的改变外泌体中的组成和丰度方法。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞，所述间充质干细胞通过携带mir-17-92基因簇的慢病毒转染获得。
[0007]
优选的，所述mir-17-92基因簇包括mir-17、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a和mir-92a。
[0008]
优选的，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
[0009]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
1)分离并培养间充质干细胞；
[0011]
2)用携带mir-17-92基因簇的慢病毒转染步骤1)中所述的间充质干细胞获得mirna-17-92修饰的间充质干细胞。
[0012]
优选的，所述转染的moi为8～12。
[0013]
本发明提供了一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞外泌体，所述间充质干细胞外泌体表达mir-17-92基因簇。
[0014]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
培养所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞，收集培养液上清，将所述培养液上清进行第一离心，收集第一上清液，将所述第一上清液进行第二离心，收集第二上清液，将所述第二上清液与16％peg 6000等体积混合、静置后，进行第三离心，收集第三沉淀，将所述第三沉淀与无菌pbs混合重悬获得间充质干细胞外泌体粗品；将所述间充质干细胞外泌体粗品与无菌pbs混合进行第四离心，收集第四沉淀，将所述第四沉淀与无菌pbs混合获得间充质干细胞外泌体；
[0016]
所述第一离心的离心力为450～550g，所述第一离心的时间为4～6min；
[0017]
所述第二离心的离心力为1800～2200g，所述第二离心的时间为25～35min；
[0018]
所述第三离心的离心力为8000～12000g，所述第三离心的时间为50～70min；
[0019]
所述第四离心的离心力为90000～110000g，所述第四离心的时间为60～80min。
[0020]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞、所述的间充质干细胞外泌体在制备促进皮肤伤口愈合的药物中的应用。
[0021]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞、所述间充质干细胞外泌体在制备抑制铁死亡的药物中的应用。
[0022]
优选的，所述间充质干细胞外泌体能够抑制铁死亡相关分子a20、acsl4和p53的表达，上调铁死亡抑制分子gpx4的表达。
[0023]
本发明的有益效果：本发明提供的mirna-17-92修饰的间充质干细胞外泌体能够显著提高人血管内皮细胞的存活率、提高其迁移能力，在mrna水平和蛋白水平，均可抑制铁死亡相关分子a20、acsl4和p53的表达，上调铁死亡抑制分子gpx4的表达；能够应用于制备促进皮肤伤口愈合的药物。
附图说明
[0024]
图1为本发明分离的uc-msc的流式鉴定结果；
[0025]
图2为本发明制备的mir-17-92-msc-exo的电镜鉴定结果；
[0026]
图3为mir-17-92-msc-exo的nta粒径分析结果；
[0027]
图4为mir-17-92-msc-exo的表面特异蛋白表达情况；
[0028]
图5为mir-17-92-msc-exo中mir-17-92的表达情况；
[0029]
图6为mir-17-92-msc-exo对huvec细胞存活率的影响；
[0030]
图7为mir-17-92-msc-exo对huvec细胞迁移能力的影响；
[0031]
图8为mir-17-92-msc-exo调控铁死亡的相关分子。
具体实施方式
[0032]
本发明提供了一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞，所述间充质干细胞通过携带mir-17-92基因簇的慢病毒转染获得。
[0033]
在本发明中，所述mir-17-92基因簇包括mir-17、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a和mir-92a。在本发明中，所述mir-17、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a和mir-92a的核苷酸序列为本领域公知的序列，在此不再赘述。
[0034]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)分离并培养间充质干细胞；2)用携带mir-17-92基因簇的慢病毒转染步骤1)中所述的间充质干细胞获得mirna-17-92修饰的间充质干细胞。
[0035]
在本发明中，所述间充质干细胞优选为人脐带间充质干细胞。在本发明中，所述人脐带间充质干细胞来源于正常健康产胎儿的新鲜脐带；所述新鲜脐带优选的在无菌条件下获取；所述新鲜脐带的获取经伦理委员会许可并征得产妇知情同意。在本发明中，获得所述新鲜脐带后，优选的在无菌条件下，剥离脐带外膜，去除脐动脉与脐静脉，以pbs充分冲洗后，剪碎脐带间充质，以i型胶原酶消化、培养获得原代培养人脐带间充质干细胞(uc-msc)。在本发明中，所述无菌条件优选的由超净工作台提供。在本发明中，所述i型胶原酶优选的以酶溶液的形式存在，所述i型胶原酶的浓度优选为0.8～1.2mg/ml，更优选为1.0mg/ml；所述i型胶原酶与所述脐带间充质的体积比优选为1:1；所述消化优选的在细胞培养箱中进行，所述消化的温度优选为37℃，所述消化的co
2
浓度优选为5％，所述消化的时间优选为3～7h。本发明在所述消化结束后，优选的将消化后的细胞悬液接种至细胞培养皿中进行培养，所述培养优选的进行2～4代，更优选的进行3代；培养3代后的可见细胞呈长梭，多角样贴壁生长，细胞增殖良好，无分化现象。在本发明中，所述细胞培养的培养基优选的包括间充质干细胞培养基添加物(ultragro，美国hyclone公司)和间充质干细胞标准培养液(dmem-l，ultragro，美国hyclone公司)；所述间充质干细胞培养基添加物和间充质干细胞标准培养液的体积比优选为1：(16～20)，更优选为1:18。
[0036]
在本发明中，所述携带mir-17-92基因簇的慢病毒优选为lv-pcdh-mir-17-92慢病毒，所述lv-pcdh-mir-17-92慢病毒购自system biosciences(sbi,usa)公司。
[0037]
在本发明中，所述转染的moi优选为8～12，更优选为10，本发明对所述转染的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的转染步骤即可。在本发明中，所述转染后优选的还包括筛选的步骤，所述筛选优选的通过检测慢病毒所携带的puro抗性与gfp标志进行，当转染细胞具有puro抗性，并且所述gfp≥60％时，认为转染细胞为稳转细胞株，可进行后续操作。
[0038]
本发明还提供了一种mirna-17-92修饰的间充质干细胞外泌体，所述间充质干细胞外泌体表达mir-17-92基因簇。
[0039]
本发明中，所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：培养所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞，收集培养液上清，将所述培养液上清进行第一离心，收集第一上清液，将所述第一上清液进行第二离心，收集第二上清液，将所述第二上清液与16％peg6000等体积混合、静置后，进行第三离心，收集第三沉淀，将所述第三沉淀与无菌pbs混合重悬获得间充质干细胞外泌体粗品；将所述间充质干细胞外泌体粗品与无菌pbs混合进行第四离心，收集第四沉淀，将所述第四沉淀与无菌pbs混合获得间充质干细胞外泌体。
[0040]
在本发明中，所述mirna-17-92修饰的间充质干细胞的培养代数优选的为4～6代，更优选为5代。在本发明中，收集培养液上清优选的采用超速离心的方法进行。在本发明中，所述培养液上清优选的直接进行外泌体的提取或者放置于-80℃保存。在本发明中，如果采用-80℃保存的培养液上清，优选的进行解冻。
[0041]
在本发明中，所述第一离心的离心力优选为450～550g，更优选为500g，所述第一离心的时间优选为4～6min，更优选为5min；所述第二离心的离心力优选为1800～2200g，更
优选为2000g；所述第二离心的时间优选为25～35min，更优选为30min；所述第三离心的离心力为8000～12000g，所述第三离心的时间为50～70min，更优选为60min；所述第四离心的离心力优选为90000～110000g，更优选为100000g，所述第四离心的时间优选为60～80min，更优选为70min。在本发明中，所述16％peg 6000在混合前，优选的进行预冷，所述预冷的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述混合优选为颠倒混合；所述静置的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述静置的时间优选为10～14h，更优选为12h。在本发明中，所述无菌pbs优选的进行预冷，所述预冷的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
[0042]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞、所述的间充质干细胞外泌体在制备促进皮肤伤口愈合的药物中的应用。在本发明中，所述间充质干细胞外泌体能够显著提高人脐带间充质干细胞的存活率、提高人脐带间充质干细胞的迁移能力，能够应用于制备促进皮肤伤口愈合的药物。
[0043]
本发明提供了所述的mirna-17-92修饰的间充质干细胞、所述间充质干细胞外泌体在制备抑制铁死亡的药物中的应用。在本发明中，所述间充质干细胞外泌体，在mrna水平和蛋白水平，均能够抑制铁死亡相关分子a20、acsl4和p53的表达，上调铁死亡抑制分子gpx4的表达。
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0045]
实施例1
[0046]
(1)原代人脐带间充质干细胞的分离培养
[0047]
获得伦理委员会许可并征得产妇知情同意，于无菌条件下获取正常健康产胎儿的新鲜脐带。于超净工作台中剥离脐带外膜，去除脐动脉与脐静脉，以pbs充分冲洗后，剪碎脐带间充质并转移至无菌离心管内，以-型胶原酶消化培养原代培养人脐带间充质干细胞(uc-msc)。
[0048]
i型胶原酶的浓度为1.0mg/ml；i型胶原酶与脐带间充质的体积比为1:1；放入细胞培养箱(5％co
2
，37℃)3～7h后获得细胞悬液。接种至10cm的细胞培养皿中培养3代后可见细胞呈长梭，多角样贴壁生长，细胞增殖良好，无分化现象。细胞培养的培养基优选的包括25ml间充质干细胞培养基添加物(ultragro，美国hyclone公司)和450ml间充质干细胞标准培养液(dmem-l，ultragro，美国hyclone公司)混匀。
[0049]
(2)uc-msc的流式鉴定
[0050]
待细胞传至第二代时，采用流式细胞仪对所获得的原代uc-msc表面标志进行鉴定。细胞分别与鼠抗人fitc-cd90、pe-cd73、fitc-cd45、apc-cd19、apc-cd105、pe-cd14、fitc-hla-dr和pe-cd34抗体混合，具体步骤如下：以pbs重悬原代uc-msc沉淀，细胞计数后稀释为1
×
10
7
/ml，向流式管中加入100μl细胞悬液，每1
×
10
6
细胞加入5μl(ebioscience)或20μl(bd)流式抗体，充分吹打混匀。
[0051]
于4℃暗室中孵育30min，以鼠抗人pe/fitc-igg1作为平行对照，用流式细胞仪检测msc的免疫表型，发现其表达cd73、cd90和cd105，不表达cd14、cd19、cd34、cd45和hla-dr抗原，符合脐带间充质干细胞的典型表型(图1)。
[0052]
(3)以mir-17-92基因修饰uc-msc
[0053]
分别以携带(lv-pcdh-mir-17-92)的慢病毒和对照慢病毒(lv-pcdh-cmv)(购自
system biosciences(sbi,usa)公司)转染第二代uc-msc。uc-msc消化传代和培养过夜后进行慢病毒转染，转染的moi为10，并根据慢病毒所携带的puro抗性与gfp标志(gfp≥60％)进行稳转细胞株筛选，培养并扩增至第5代，收集培养液上清，-80℃储存。
[0054]
(4)mir-17-92-msc-exo的提取
[0055]
将-80℃储存的mir-17-92基因修饰的uc-msc培养液上清室温解冻，将50ml的培养液上清转移至50ml离心管中，在4℃环境中离心，转数500g、离心5min，收上清；再转移至新的50ml离心管中，在4℃环境中离心，转数2000g，离心30min，收上清，与预冷的16％peg 6000等体积混合，充分颠倒混匀，在4℃环境中静置过夜；在4℃环境中离心，转数10000g、离心60min，倒出上清，加入50～100μl预冷的无菌pbs重悬，即为粗间充质干细胞外泌体，加入15-20ml预冷的无菌pbs，混匀，在4℃环境中离心，转数100000g、离心70min，弃上清，加入200～400μl预冷的无菌pbs重悬，得到间充质干细胞外泌体。
[0056]
(5)mir-17-92-msc-exo的鉴定
[0057]
采用透射电镜观察外泌体的大小与形态，透射电镜下可见，所提取的mir-17-92-msc-exo呈大小均一的圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径约为40～110nm(图2)；通过nta粒径分析发现，所提取的mir-17-92-msc-exo粒径大小集中于80～120nm，符合外泌体直径的范围(图3)；采用westernblot检测外泌体表面特异蛋白cd9、cd63和cd81表达情况(图4)。
[0058]
(6)mir-17-92-msc-exo中mir-17-92的表达
[0059]
采用实时定量pcr(q-pcr)检测mir-17-92各组分(mir-17、mir-18、mir-19、mir-20和mir-92)的含量：利用rna提取试剂盒提取细胞内总rna；利用mircute mirna cdna第一链合成试剂盒对各个引物进行反转录；采用mircute mirna荧光定量检测试剂盒进行表达量检测，利用pcr引物扩增计算ct、δct和分子表达量差异。
[0060]
表1 mir-17、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a和mir-92a引物序列
[0061][0062]
转入pcdh和mir-17-92后的msc-exo中mir-17-92簇中的分子表达情况如图5所。
[0063]
(7)mir-17-92-msc-exo对huvec细胞存活率的影响
[0064]
取96孔板，接种100μl c2c12细胞(小鼠成肌细胞(c2c12)购自中国医学科学院基础医学研究所)，分别加入ctr-msc-exo(pcdh)，mir-17-92-msc-exo(mir-17-92)100μg/ml，每个浓度设置4个复孔，置于37℃，5％co
2
培养箱中培养24、48和72h。每孔加入10μl cck-8试剂，于细胞培养箱中作用2h后，用酶标仪检测450nm发射光的od值。细胞增殖实验结果显示，与control组相比，mir-17-92-msc-exo可明显提高huvec细胞的存活率(图6)。
[0065]
(8)mir-17-92-msc-exo对huvec细胞迁移能力的影响
[0066]
将5
×
10
4
/ml的细胞200μl置入transwell小室上层，下室分别加入ctr-msc-exo(pcdh)，mir-17-92-msc-exo(mir-17-92)100μg/ml的培养基，继续培养12h，观察不同组别穿透基质凝胶多空滤膜的细胞数。transwell实验结果表明，mir-17-92-msc-exo相对于ctr-msc-exo(pcdh)，促进huvec细胞迁移的能力更明显(图7)。
[0067]
(9)mir-17-92-msc-exo调控铁死亡的相关分子
[0068]
通过体外构建铁死亡模型验证mir-17-92-msc-exo对铁死亡的影响。
[0069]
人脐静脉血管内皮细胞(huvec)通过不同的erastin药物浓度(μm)dmso、2.5、5、7.5、10，同时设置fer-1抑制剂组。诱导24h后，每孔加入10μl cck-8，37℃/5％co
2
培养箱作用3h后，上机检测450nm的吸光od值，评价细胞的存活效率，随着erastin药物浓度的增大，huvec细胞发生死亡，呈剂量依赖关系。而抑制剂fer-1组能逆转erastin诱导的细胞死亡，结果显示后续实验可以用此细胞作为诱导细胞铁死亡的模型。
[0070]
以2.5μm浓度erastin诱导huvec发生铁死亡，分别加入ctr-msc-exo(pcdh)，mir-17-92-msc-exo(mir-17-92)100μg/ml，应用实时定量pcr和westernblot的方法，发现无论在mrna水平还是在蛋白制水平，mir-17-92-msc-exo均可抑制铁死亡相关分子a20、acsl4和p53的表达，上调铁死亡抑制分子gpx4的表达(图8)。
[0071]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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