一种鸡新城疫病毒分离方法与流程

[0001]
本发明属于病毒分离领域。


背景技术：

[0002]
鸡新城疫(newcastle disease，nd)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，该病被世界动物卫生组织(oie)列为a类传染病，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。目前检测鸡新城疫的金标准为病毒分离鉴定，该方法是将样本接种到鸡胚或细胞内培养一定时间，得以分离出病毒，再通过血清学方法和分子生物学方法等进行病毒具体种类的鉴定。因此，鸡新城疫病毒的分离鉴定方法包括分离方法和鉴定方法两部分。
[0003]
鸡新城疫病毒分离方法中，广泛使用的方法为接种spf鸡胚进行分离(简称“spf鸡胚法”)，但其耗时费力，受制于spf鸡胚来源的限制，且费用较高。而接种细胞进行分离的方法(简称“细胞法”)，主要将样本接种到鸡胚成纤维细胞，该方法的分离鉴定灵敏度相对较低，其应用因此并不广泛。且鸡胚成纤维细胞是由spf鸡胚制备的原代细胞，存在spf鸡胚法同样的问题，另外，其制备过程复杂、易污染，增加了试验的不确定性。
[0004]
鸭胚视网膜细胞(age1.cr.pix细胞，以下简称age1细胞)，是德国probiogen公司从美洲鸭的胚胎视网膜中分离的细胞，转染人5型腺病毒f1基因和pix基因后，永生化制备的细胞系，后期经过驯化，成为悬浮细胞。目前，age1细胞已被用于疫苗生产。但未见将其用做鸡新城疫的分离，其主要原因还是在于分离的灵敏度不够，尚无法对spf鸡胚形成优势。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的问题是：提供一种新的鸡新城疫病毒分离方法。
[0006]
本发明的技术方案如下：
[0007]
一种鸡新城疫病毒的分离方法，包括如下步骤：
[0008]
1)将样本与终浓度为10～20μg/ml的胰酶溶液混合，孵育8～15min；
[0009]
2)将步骤1)所得混合物接种到age1细胞，培养100～140h，期间每日添加终浓度为3～8μg/ml的胰酶溶液。
[0010]
如前述的分离方法，步骤1)所述胰酶溶液终浓度为15μg/ml。
[0011]
如前述的分离方法，步骤1)所述的孵育持续10min。
[0012]
如前述的分离方法，步骤2)所述的培养时间是120h。
[0013]
如前述的分离方法，步骤2)所述的胰酶溶液终浓度为5μg/ml。
[0014]
如前述的分离方法，步骤2)所述的培养是指在35℃、8％co
2
条件下培养。
[0015]
如前述的分离方法，所述培养是在摇床培养，摇床转速200r/min。
[0016]
本发明的有益效果如下：
[0017]
本发明的方法，可以简单快捷地实现鸡新城疫病毒的分离，且灵敏度显著高于spf鸡胚，有望取代spf鸡胚法。
[0018]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离
本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0020]
图1：age1悬浮细胞显微观察图；标尺(scale bar)：100μm。
具体实施方式
[0021]
实施例1 age1悬浮细胞的复苏与培养
[0022]
从液氮罐中取出1支age1细胞，37℃水浴迅速解冻，200g离心5分钟，弃去上清，用30ml细胞生长液悬浮细胞，接种于125ml摇瓶中，200r/min、37℃、5％co2条件下培养，当细胞密度可达到4.0～6.0
×
10
6
/ml，将细胞扩大传代至500ml摇瓶中，细胞起始密度为1.0
×
10
6
/ml。age1细胞培养72h，取样，显微镜观察，细胞呈圆形，易接团，如图1所示。
[0023]
实施例2鸡新城疫病毒的分离方法
[0024]
将实施例1中的age1细胞培养达到6.0～8.0
×
10
6
/ml时，分装至50ml的tpp管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，加入到装有age1细胞的tpp管内200r/min、35℃、8％co
2
条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液，培养120h。
[0025]
实施例3鸡新城疫病毒的分离方法
[0026]
将实施例1中的age1细胞培养达到6.0～8.0
×
10
6
/ml时，分装至50ml的tpp管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为20μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育15min，加入到装有age1细胞的tpp管内200r/min、35℃、8％co
2
条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为3μg/ml的胰酶溶液，培养100h。
[0027]
实施例4鸡新城疫病毒的分离方法
[0028]
将实施例1中的age1细胞培养达到6.0～8.0
×
10
6
/ml时，分装至50ml的tpp管中，10～15ml/管，放于摇床备用。向待检样本添加终浓度为10μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育8min，加入到装有age1细胞的tpp管内200r/min、35℃、8％co
2
条件下培养，每日(不含接种当日)添加终浓度为8μg/ml的胰酶溶液，培养140h。
[0029]
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。为了便于表述，本发明的鸡新城疫分离。方法简称为“age1细胞法”。
[0030]
实验例1胰酶对分离效果的影响
[0031]
方法：
[0032]
实施例1的细胞培养3～4日，当细胞密度达到6.0～8.0
×
10
6
/ml时，分装至50ml的tpp管中，10～15ml/管，放于摇床，以备接毒。分别取ndv基因ii型la sota株病毒和基因vii型asg10株病毒，使用细胞培养基以10倍系列稀释后，取10-8
、10-9
、10-10
稀释的病毒液0.1ml，分别添加终浓度为15μg/ml的胰酶溶液，37℃孵育10min，然后将每个稀释度处理的病毒液分别接种5管age1悬浮细胞，200r/min、35℃、8％co2条件下培养，每日添加终浓度为5μg/ml的胰酶溶液。另外，设未添加胰酶处理病毒组(仅省略一开始的15μg/ml胰酶处理，每
日仍添加终浓度5μg/ml胰酶)。分别培养120h，取样进行进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。
[0033]
结果：
[0034]
经过胰酶处理的病毒液，la sota株10-8
病毒分离5/5阳性，10-9
病毒分离4/5阳性，10-10
病毒分离2/5阳性，未经胰酶处理的病毒液，10-8
病毒分离2/5阳性，10-9
与10-10
病毒分离均为0/5阳性，asg10株10-8
、10-9
病毒分离均为5/5阳性，10-10
病毒分离2/5阳性，未经胰酶处理的病毒液，10-8
病毒分离1/5阳性，10-9
与10-10
病毒分离均为0/5阳性，结果详见表1。
[0035]
表1胰酶对分离鉴定敏感性的影响
[0036][0037]
结论：添加胰酶后，不同基因型的ndv都更加容易侵染age1细胞，进而显著提高分离的敏感度。
[0038]
实验例2本发明方法与spf鸡胚法敏感性的比较
[0039]
方法：
[0040]
分别取ndv基因ii型la sota株病毒和基因vii型asg10株病毒，10倍系列稀释后，取10-8
、10-9
、10-10
稀释的病毒，分别按照spf鸡胚法接种5枚鸡胚，age1细胞法(本实验例具体使用实施例2的方法)接种5管细胞，分别培养120小时，取样进行ha效价测定，ha效价不低于4log2，判定为病毒分离阳性。
[0041]
其中，spf鸡胚法具体为：
[0042]
将待检测的病毒10倍系列稀释至10-10
，取10-8
、10-9
、10-10
稀释度病毒液，经尿囊腔途径接种10日龄spf鸡胚各5枚，每枚0.2ml，鸡胚接种后于37℃孵育120小时，每日照胚2次，弃去24小时内死亡鸡胚，分别收集24～120小时内死亡鸡胚及120小时存活鸡胚尿囊液，进行ha效价检测。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚尿囊液的ha效价不低于1：16，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，盲传一次后再进行判定。盲传后仍为阴性者，方判为病毒分离阴性。
[0043]
结果：
[0044]
病毒稀释到10-10
接种age1细胞，病毒分离1/5阳性，而10-10
稀释病毒接种spf鸡胚，无阳性。结果详见表2。
[0045]
表2本发明方法和spf鸡胚法敏感性比对试验结果
[0046][0047][0048]
结论：age1细胞法比spf鸡胚法更敏感。
[0049]
实验例3 age1细胞法检测ndv相关灭活苗的应用
[0050]
方法：
[0051]
取鸡新城疫、禽流感(h9亚型)二联灭活疫苗(la sota株+ss株)，批号201807，鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(h9亚型)三联灭活疫苗(la sota株+m41株+ss株)，批号201803，均购自成都天邦生物制品有限公司。重组新城疫病毒、禽流感病毒(h9亚型)二联灭活疫苗(asg10株+g株)由成都天邦实验室制备。按照3种疫苗新城疫部分的攻毒效力检验法，3种疫苗分别经颈部皮下注射免疫35日龄spf鸡各10只，另取同日龄15只spf鸡不免疫作为对照组。接种后21日后，3种疫苗经肌肉注射相应的ndv株病毒液0.2ml(10
5.0
eld
50
/只)。攻毒后5日，分别采集存活鸡的泄殖腔拭子，分别接种spf鸡胚和age1细胞进行病毒分离。
[0052]
结果：
[0053]
攻毒后5日，攻毒对照组，均全部死亡，免疫组观察至14日，均未死亡。病毒分离：鸡新城疫、禽流感(h9亚型)二联灭活疫苗(la sota株+ss株)免疫组，age1细胞法病毒分离率为1/10，spf鸡胚法为0/10；鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(h9亚型)三联灭活疫苗(la sota株+m41株+ss株)免疫组，age1细胞法与spf鸡胚法均为0/10；重组新城疫病毒、禽流感病毒(h9亚型)二联灭活疫苗(asg10株+g株)免疫组，age1细胞法病毒分离率为1/10，spf鸡胚法为0/10。结果详见表3。
[0054]
表3 age1细胞分离法检测ndv相关灭活苗的应用结果
[0055]
[0056][0057]
结论：
[0058]
age1细胞法比鸡胚法分离病毒更敏感，可以替代spf鸡胚法。
[0059]
综上，本发明的鸡新城疫病毒的分离方法，结合age1细胞和胰酶处理，能提高新城疫病毒在细胞中的存活和增殖能力，相比传统的spf鸡胚法具有更高的新城疫病毒分离成功率。

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