一种脑卒中诊疗效果评价相关微生物的制作方法
2021-02-02 11:02:45|350|起点商标网
[0001]
本发明属于生物医学领域,具体地,本发明涉及一种脑卒中诊疗效果评价相关微生物。
背景技术:
[0002]
脑卒中是一种急性脑血管疾病,在中国,脑卒中发病率高、复发率高、致死致残率高,已跃升为我国国民死因首位。根据全国范围内的人口调查,中国每年大约有240万新增脑卒中病例,每年110万与脑卒中相关的死亡,因此给国家和个人带来了巨大的经济负担(wang w,jiang b,et al.prevalence,incidence,and mortality of stroke in china:results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults.circulation,2017,21,135(8):759-771.)。其中is(ischemic stroke,缺血性脑卒中)也被称为脑梗死,占所有中风病例的87%。缺血性脑卒中是一种遗传和环境因素共同作用的复杂性疾病。
[0003]
人类肠道拥有大量的共生微生物包括细菌、病毒、古细菌、原生动物和真菌。人类与这些微生物共同进化以共生方式相处。肠道微生物中的基因数量是人类基因至少2倍之多(an integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome.nat.biotechno1,2014,32:834-841.)。微生物有许多生理作用包括产生必需维生素(如维生素b和维生素k)、参与碳水化合物的消化、免疫系统的建立、调节代谢包括胆固醇和脂质代谢以及产生信号分子如包括短链脂肪酸和二级胆汁酸。微生物群可以影响宿主生理,但外在因素如遗传、药理化合物、饮食、生活方式和卫生也影响微生物组成。于此同时微生物群在许多疾病中都发挥着重要作用包括神经系统疾病(sekirov i,russell sl,et al.gut microbiotain health anddisease.physiol rev,2010,90:859-904.)。
[0004]
在过去的十年中,他汀类药物作为神经保护药物在阿尔茨海默病或帕金森病中的潜在作用已被广泛研究,这些研究提供了对它们的多效性和免疫调节活性的有趣见解,而与脂质谱的改善无关。他汀类药物被认为是通过减少β-淀粉样蛋白肽沉积对阿尔茨海默病产生积极的作用:动物实验或体外细胞培养的初步研究表明,他汀类药物能降低β-淀粉样蛋白的产生;他汀类药物治疗的这种“积极”效应也通过一些纵向研究证实,其中在服用他汀类药物的患者中观察到阿尔茨海默病的患病率降低。在帕金森病中,他汀类药物可以通过抑制氧化应激通路,减少黑质中的神经炎症性神经变性过程,从而降低疾病的发生率(van der most p j,dolga a m,nijholt i m,et al.statins:mechanisms of neuroprotection[j].prog neurobiol.2009,88(1):64-75.)。这些研究表明他汀类药物存在可以减少神经元损伤和缺血性脑卒中的局部缺血后炎症反应的潜在用途。研究肠道菌群与他汀类药物治疗脑卒中的相关性,对于揭示他汀类药物的作用机制以及探究新的治疗脑卒中的手段具有重要的意义。
技术实现要素:
[0005]
本发明的目的在于提供一种通过检测的丰度对脑卒中进行诊断或对治疗效果进行评价的方法和产品。
[0006]
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
[0007]
本发明提供了检测christensenella的产品在制备脑卒中诊断或辅助药物治疗效果评价工具中的应用。
[0008]
进一步,所述检测christensenella的产品包括检测检测christensenella丰度的产品。
[0009]
进一步,所述药物为他汀类药物。
[0010]
进一步,所述他汀类药物为阿托伐他汀。
[0011]
进一步,利用产品检测药物治疗后样本中的christensenella丰度,与对照组相比,如果样本中的christensenella的丰度显著降低,则表明评价所述药物治疗效果较好,受试者适合使用该药物治疗。
[0012]
进一步,所述样本的来源是粪便。
[0013]
本发明提供了一种用于脑卒中患者诊断或辅助药物治疗效果评价的工具,所述工具包括检测样本中christensenella丰度的试剂。
[0014]
进一步,所述试剂包括能够特异性结合christensenella的靶核酸的寡核苷酸或者能够特异性结合christensenella的靶蛋白的抗体。
[0015]
进一步,所述靶核酸为christensenella特异性核酸。
[0016]
进一步,所述靶蛋白为christensenella特异性蛋白。
[0017]
本发明提供了christensenella在制备治疗脑卒中的药物中的应用。
[0018]
进一步,所述药物包括christensenella的抑制剂。
[0019]
本发明的优点和有益效果:
[0020]
本发明通过比较脑卒中以及用药后的样本中的肠道菌群的丰度,首次发现了肠道菌属christensenella与他汀类药物治疗的脑卒中相关,为辅助诊断他汀类药物的治疗效果以及治疗脑卒中提供了一种手段。
附图说明
[0021]
图1是christensenella在不同样本中的丰度图;
[0022]
图2是christensenella作为检测变量的roc曲线图;
[0023]
图3是fmt移植实验结果图;其中图a是mnss评分图;图b是跑轮实验图;图c是粘附物移除实验中接触时间检测图;图d是粘附物移除实验中接触时间检测图。
具体实施方式
[0024]
本发明通过对脑卒中组与他汀治疗组的样本进行微生物测序,首次发现了christensenella与脑卒中的他汀类药物治疗相关,同时通过粪便移植技术证实了肠道菌群可以改善神经行为学,降低脑梗死体积,从而起到治疗脑卒中的作用。
[0025]
基于此,本发明提供了检测christensenella的产品在制备脑卒中诊断或辅助药物治疗效果评价工具中的应用;所述试剂可以是本领域的任何常规的试剂,只要可以检测
christensenella的丰度即可。所述产品或试剂包括能够特异性结合christensenella的靶核酸的寡核苷酸或者能够特异性结合christensenella的靶蛋白的抗体。
[0026]
本发明的检测christensenella特异性核酸的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能:如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0027]
上面所述的寡核苷酸包括扩增christensenella特异性靶核酸的引物,产品中包括的引物可以通过化学合成来制备,通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计,并通过化学合成来制备。
[0028]
上面所述的寡核苷酸还可包括探针,与christensenella特异性靶核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
[0029]
本发明的检测christensenella的靶蛋白的产品或试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能:例如,可以包括elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等。
[0030]
本发明的检测christensenella的靶蛋白的的产品或试剂包括特异性结合靶蛋白的抗体。所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如,嵌合抗体、scfv、fab、f(ab
’
)2、fv等。只要所述片段能够保留与christensenella蛋白的结合能力即可。
[0031]
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如,制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后,从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的靶蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对靶蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体:用与上文相同的抗原免疫动物,从经过免疫的动物收集血液样品,从血液中分离出血清,然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0032]
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如,可以如下荧光标记蛋白质或肽:用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽,添加用dmso、缓冲剂、等准备的染料,然后混合溶液,再于室温放置10分钟。另外,标记可使用商品化的标记试剂盒,诸如生物素标记试剂盒,如生物素标记试剂盒-nh2、生物素标记试剂盒-sh(dojindolaboratories);碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-nh2、碱性磷酸酶标记试剂盒-sh(dojindo laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-nh2、过氧化物酶标记试剂盒-nh2(dojindo laboratories);藻胆蛋白标记试剂
盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-nh2、藻胆蛋白标记试剂盒-sh、b-藻红蛋白标记试剂盒-nh2,b-藻红蛋白标记试剂盒-sh、r-藻红蛋白标记试剂盒-nh2、r-藻红蛋白标记试剂盒sh(dojindolaboratories);荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-nh2、hilyte fluor(tm)555标记试剂盒-nh2、hilyte fluor(tm)647标记试剂盒-nh2(dojindo laboratories);及dylight 547和dylight647(techno chemical corp.)、zenon(tm)、alexa fluor(tm)抗体标记试剂盒、qdot(tm)抗体标记试剂盒(invitrogen corporation)和ez-标记物蛋白质标记试剂盒(funakoshi corporation)。为了正确标记,可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
[0033]
作为依照本发明的检测产品的样本,可以使用例如自患者获得的固体样品或流体。样本不受特别限制,只要它适于本发明的测定;例如,它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、粪便或其级分或经过处理的材料。
[0034]
作为一种优选的实施方式,所述样本来自受试者的粪便。
[0035]
本发明提供了一种用于脑卒中患者诊断或辅助药物治疗效果评价的工具。所述工具能够检测受试者样本中christensenella丰度。所述工具包括检测样本中christensenella丰度的试剂。
[0036]
作为可选择的实施方式,所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台;高通量测序平台是一种特殊的诊断工具,随着高通量测序技术的发展,微生物表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比实验组和对照组的表达谱,容易分析出差异表达与疾病之间的相关性。
[0037]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
[0038]
实施例1与脑梗死相关的生物标志物
[0039]
1.实验动物
[0040]
特定无病原体等级的成年雄性c57bl/6小鼠(体重23.0至26.0g,8至12周龄)购自北京维通利华。所有c57bl/6小鼠都饲养在无特定病原体的条件下,具有相对恒定的湿度(60%
±
5%)和温度(22℃
±
3℃),光照时间为12h/黑暗时间为12h,所有的动物都是可以自由饮食和喝水。通过电凝法建立小鼠局灶性皮层脑梗死模型,将小鼠随机分为两组,对照组(pmcao,25只)和用药组(25只)。
[0041]
2.药物干预:阿托伐他汀(美国辉瑞公司)以2mg/ml的浓度溶于0.9%的生理盐水中。通过灌胃给予该药物20mg/kg/d。脑梗死组用等体积的生理盐水处理。用药1天后收集小鼠的粪便样本;同时检测小鼠的行为学特征以及脑梗死体积。
[0042]
3.16s rrna基因测序
[0043]
使用dna提取试剂盒自样本中提取细菌dna,操作步骤按说明书进行。
[0044]
dna样品被接收后,对样品进行检测;检测合格的样品构建文库:回收目的amplicon片段,用t4 dna polymerase、klenow dna polymerase和t4 pnk将打断形成的粘性末端修复成平末端,再通过3'端加碱基“a”,使得dna片段能与3'端带有“t”碱基的特殊接头连接;或者设计合成含有测序接头的双index融合引物,以基因组dna为模板,进行融合引
物pcr,磁珠筛选目的amplicon片段,最后,用合格的文库进行cluster制备和测序。
[0045]
4.数据分析
[0046]
用下机得到的数据进行相应的生物信息分析。下机数据经过数据过滤,滤除低质量的reads,剩余高质量的clean data方可用于后期分析;通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags;在给定的相似度下将tags聚成otu,然后通过otu与数据库比对,对otu进行物种注释;基于otu和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
[0047]
4.1数据处理
[0048]
在进行数据处理过滤时,使用内部撰写的程序对原始的测序数据进行如下处理,获得clean data,具体步骤如下:
[0049]
1)采取按窗口去低质量的方法,具体操作如下:设置30bp为窗口长度,如果窗口平均质量值低于20,从窗口开始截除read末端序列,移除最终read长度低于原始read长度75%的reads;
[0050]
2)去除接头污染reads(默认adapter序列与read序列有15bp的overlap,设置为15bp,允许错配数为3);
[0051]
3)去除含n的reads;
[0052]
4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10,设置10bp)。
[0053]
如果样品通过barcode合并建库,得到clean data后,利用barcode序列通过内部撰写的程序对样品进行拆分。barcode序列与测序reads比对允许的错配个数为0bp。
[0054]
4.2序列拼接
[0055]
序列拼接使用软件flash(fast length adjustment of short reads,v1.2.11),利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列,得到高变区的tags。拼接条件如下:
[0056]
1)最小匹配长度15bp;
[0057]
2)重叠区域允许错配率为0.1。去除没有overlap关系的reads。paired end reads通过reads之间的overlap关系拼接成tags。
[0058]
4.3物种分类和丰度分析
[0059]
将经过上述处理的clean tags进行otu聚类,然后通过对otu注释完成otu的物种分类。
[0060]
利用软件usearch(v7.0.1090)将拼接好的tags聚类为otu。其主要步骤如下:
[0061]
1)利用uparse在97%相似度下进行聚类,得到otu的代表序列;
[0062]
2)利用uchime(v4.2.40)将pcr扩增产生的嵌合体从otu代表序列中去除;16s和its采取和已有的嵌合体数据库进行比对的方法去除嵌合体。18s采取denovo的方法去除嵌合体16s嵌合体数据库:gold database(v20110519)its嵌合体数据库:unite(v20140703),分为its全长,its1和its2,按测序区域进行选择。
[0063]
3)使用usearch_global方法将所有tags比对回otu代表序列,得到每个样品在每个otu的丰度统计表。得到otu代表序列后,通过rdp classifer(v2.2)软件将otu代表序列与数据库有比对进行物种注释,置信度阈值设置为1。其中,对注释结果进行如下过滤:
[0064]
去除没有注释结果的otu;
[0065]
去除注释结果不属于分析项目中的物种。例如,样品为细菌16s,如果otu注释上古
菌则去除。剩余的otu方可用于后期分析。
[0066]
比对数据库:16s(包括细菌与古菌):greengene(默认):v201305;rdp:release9 201203
[0067]
4)物种差异分析
[0068]
运用生物信息学分析方法分析物种差异分析根据得到的群落丰度数据,检测不同组(或样本)微生物群落表现出的丰度差异。物种差异性分析的内容包括:组间差异显著性检验、lefse多级物种差异判别分析。本项目使用组间差异显著性检验进行差异物种的筛选。
[0069]
组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据,运用严格的统计学方法可以检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种,进行假设性检验,评估观察到的差异的显著性。分析可选择域、界、门、纲、目、科、属、种、otu等不同分类水平。
[0070]
1)wilcox秩和检验(wilcoxon rank-sum test),也叫曼-惠特尼u检验(mann-whitney u test),是两组独立样本非参数检验的一种方法。其原假设为两组独立样本来自的两总体分布无显著差异,通过对两组样本平均秩的研究来实现判断两总体的分布是否存在差异,该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析,并对p值进行多种方法的校正。
[0071]
2)多重检验校正,即对p值进行多重检验校正方法为"fdr"。
[0072]
3)双尾检验,用于指定所求置信区间的类型,选择双尾检验(求置信区间)。
[0073]
4)ci计算方法,即计算置信区间的方法,方法为dp:welch
’
s confidence inverted。置信度选择:0.95。
[0074]
运用dp的方法计算影响大小(effect size),即mean1-mean2;运用welch t检验的方法计算置信区间,筛选标准fdr<0.05。
[0075]
5)根据差异菌群的丰度,绘制受试者工作特征曲线(roc),计算二项精确置信空间,分析差异菌群的诊断效能。
[0076]
5、结果
[0077]
1)行为学检测结果显示,相比对照组,用药后小鼠的mnss评分降低,rotarod跑轮时间增加,粘附物移除实验中接触时间及移除时间降低;同时脑梗死的体积降低。
[0078]
2)生物信息学分析结果显示,与模型组相比,christensenella在用药组中呈现显著性差异(图1),christensenella在模型组中的平均丰度为0.1765581,在用药组中的丰度为0.01529307。
[0079]
3)诊断效能结果显示,christensenella作为检测指标的曲线下面积为0.883,截断值为0.014,该点的敏感性为0.640,特异性为1.000(图2),具有较高的敏感性和特异性。
[0080]
实施例2粪便移植实验(fmt)
[0081]
在无菌条件下收集阿托伐他汀治疗的小鼠的粪便材料,将供体小鼠的粪便(0.1g)混合并悬浮在1ml无菌pbs中。使用台式涡流(vortex-genie 2,science industries,美国)将混合物混合15s,室温800g离心3min后,取上清液500μl经口灌胃给pmcao小鼠(n=12)。新鲜粪便制备于粪便移植当天,于灌胃前15min内完成。测定fmt小鼠的神经行为,并与pmcao组(n=12)进行比较。
[0082]
结果如图3所示,粪便移植后,改善了小鼠的神经行为学,降低了mnss评分(图3a),
增加了rotarod跑轮时间(图3b),降低粘附物移除实验中接触时间(图3c)及移除时间(图3d)。
[0083]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
起点商标作为专业知识产权交易平台,可以帮助大家解决很多问题,如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通,为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
tips