与茄子果实长度主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记及应用的制作方法

与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记及应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子遗传育种技术领域，特别涉及一种与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记、检测方法及应用。


背景技术：

[0002]
茄子(solanommelongenal.,2n＝24)是茄科(solanaceae)茄属(solanum)的一种重要蔬菜作物，具有重要的农业经济价值和保健作用；我国是茄子第一生产国，茄子年产量常年占世界产量的60％左右；我国茄子品种类型因生态环境和消费习惯的不同存在明显的地域差异，尤其是在果实长度方面差异明显，茄子果实长度受到复杂的数量遗传性状位点(qtl)控制。利用传统育种方法进行茄子果实长度性状的育种是较为耗时费力的，一般要等到茄子开花结果之后才能知道商品茄子的果实长度，育种周期较长，期间也需要投入较大的工作量。
[0003]
开发与茄子果实长度性状紧密连锁的分子标记，对于茄子分子标记辅助选择育种具有重要的指导意义，是实现目标果实长度高效分子育种的必要前提，具有重要的育种实践价值。开发与茄子果实长度性状紧密连锁的分子标记，利用标记设计的特殊引物序列，通过pcr扩增等技术，将目的片段扩增，利用kasp分型技术检测snp位点基因型，确认目标基因型是否相同，从而提前预判茄子的果实长度，在苗期就能准确预测茄子果实长度，从而提前授粉，配制相应杂交组合或者选取目标单株自交留种，节省育种时间和田间育种工作量，从而提高育种效率。


技术实现要素：

[0004]
本发明为了解决现有茄子果实长度选择性育种过程中所存在的上述技术问题，提供了一种与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记、检测方法及应用，它具有减少育种工作量、缩短育种时间和提高育种效率的特点。
[0005]
本发明的第一种技术方案：与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，所述snp分子标记位于茄子3号染色体的第78393511位碱基，所述第78393511位碱基为t或a；
[0006]
所述茄子3号染色体的第78393511位碱基上游的100个碱基序列如seq id no:1所示；
[0007]
所述茄子3号染色体的第78393511位碱基下游的100个碱基序列如seq id no:2所示。
[0008]
其中茄子3号染色体第78393511位碱基上下游碱基序列信息选自浙茄基因组：http://eggplant-hq.cn/；
[0009]
snp标记为t与a的转换，
[0010]
茄子3号染色体的第78393511位碱基上游的100个碱基序列为：
[0011]
agatagatacatggaaaccacgtttaaaccccaaaccaagtgagaaaaagtctcgcaattcacattatt
catcttggaacgacaatgttcacggaacaag
[0012]
茄子3号染色体的第78393511位碱基下游的100个碱基序列为：
[0013]
actgtcaactctatatctaaacatttggcaaaccatatgaaaccaaatcctagtatatcttcaggggaagtgtcatctttaaggtcactgacattttgtc
[0014]
本发明中snp分子标记位于茄子3号染色体的第78393511位碱基，所述第78393511位碱基为t或a，可用于茄子果实长度性状育种的早期分子标记辅助选择，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用；在常规育种方法中，要获得茄子商品果果实长度，需要等到茄子商品果成熟期后才能确定，浪费了大量的时间和精力，而通过检测与茄子果实长度性状连锁的分子标记，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本，而且大大提高选择效率；本发明通过qtl-seq技术以及遗传图谱定位，确定了与茄子果实长度性状相关的主效qtl位点的位置，并发现了与该位点紧密连锁的分子标记，可用于茄子果实长度性状的分子标记筛选，这为实现基于分子辅助育种的多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提，使得对于选择目标育种长度的茄子品种的工作量大幅度较少，选择时间大幅度缩短，育种效率也大幅提高，适于大规模推广应用；本发明中与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp标记，经试验检测，连锁性和可靠性均较高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。
[0015]
本发明的第二种技术方案：与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记检测方法，包括以下步骤，
[0016]
(1)提取所述snp分子标记上游的100个碱基序列和下游的100个碱基序列；
[0017]
(2)将步骤(1)整体碱基序列中的snp分子标记通过引物设计软件转化为kasp标记；
[0018]
(3)将步骤(2)中的整体碱基序列，通过基因分型检测平台，进行基于kasp的snp基因分型检测。
[0019]
本发明通过检测与茄子果实长度性状相关的分子标记，即可预测茄子果实长度，进而准确快速筛选较长果实茄子的优良单株，分子标记位点的检测方法方便快捷，不受环境影响；本发明可以检测茄子果实长度大小，可以预测茄子果实长度大小，可以对需要长度的茄子种子或幼苗进行有效选择，还可以用于茄子果实长度的分子标记辅助育种，加速针对茄子果实长度育种的进程，适于大规模推广应用；本发明通过对未知茄子材料的种子或者苗期叶片提取dna，结合kasp引物进行kasp分子标记分型试验，通过标记的分型结果就可以预测茄子的果实长度，而不用像常规育种中，等到茄子果实达到商品果时进行测量判定，可以明显提高育种效率，节约育种成本。其中的引物设计软件可以选择使用oligo引物设计软件。
[0020]
作为优选，所述步骤(3)中用到的kasp引物为，
[0021]
正向引物，f-1：gaaggtgaccaagttcatgctcgacaatgttcacggaacaagt，如seq id no:3所示；
[0022]
正向引物，f-2：gaaggtcggagtcaacggattcgacaatgttcacggaacaaga，如seq id no:4所示；
[0023]
反向引物，r：agatatactaggatttggtttc，如seq id no:5所示。
[0024]
本发明根据定位的茄子果实长度性状主效qtl位点，开发检测茄子果实长度大小
的kasp引物，用于检测snp位点的多态性表达茄子果实长度的差异，预测茄子果实长度大小差异，为茄子果实长度大小的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
[0025]
作为优选，所述kasp所在的反应体系包含kasp引物混合物、kasp主混合物和dna模板；所述kasp引物混合物包括正向引物f-1、正向引物f-2和反向引物r；所述kasp主混合物包括正向引物f-1尾部fam标记的寡序列、正向引物f-2尾部hex标记的寡序列、fam染料、hex染料和淬灭剂；所述dna模板为茄子基因组dna。反应体系中的各物质，为snp位点的多态性表达茄子果实长度的差异检测，提供了良好的反应环境，保证整个检测过程的顺利完成。
[0026]
本发明的第三种技术方案：与茄子果实长度主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记在对茄子果实长度性状进行早期鉴定和筛选中的应用。
[0027]
本发明在定位的茄子果实长度主效的qtl位点内，开发了与性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测茄子果实的长度，为实现茄子果实长度性状的早期鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术。
[0028]
本发明具有如下有益效果：
[0029]
(1)snp分子标记位于茄子3号染色体的第78393511位碱基，所述第78393511位碱基为t或a，可用于茄子果实长度性状育种的早期分子标记辅助选择，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用；在常规育种方法中，要获得茄子商品果果实长度，需要等到茄子商品成熟期后才能确定，浪费了大量的时间和精力，而通过检测与茄子果实长度主效位点连锁的分子标记，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本，而且大大提高选择效率；
[0030]
(2)通过qtl-seq技术以及遗传图谱定位，确定了茄子果实长度的主效qtl位点的位置，并发现了与该位点紧密连锁的分子标记，可用于茄子果实长度性状的分子标记筛选，这为实现基于分子辅助育种的多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提，使得对于选择目标育种长度的茄子品种的工作量大幅度较少，选择时间大幅度缩短，育种效率也大幅提高，适于大规模推广应用；
[0031]
(3)与茄子果实长度性状紧密连锁的分子标记位于茄子果实长度主效qtl位点内，连锁性和可靠性均较高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。
附图说明
[0032]
图1是本发明中qtl-seq对茄子果实长度的定位图；图1中横坐标表示染色体，纵坐标表示两个子代snp-index差值；
[0033]
图2是本发明中kasp分型可视化结果图；图2中横坐标表示fam等位基因型，纵坐标表示hex等位基因型。
[0034]
附图中的标记为：100-tt碱基类型，200-以水作为阴性对照的显示，300-at杂合碱基类型，400-aa碱基类型。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
[0036]
实施例1：
master mix+assay：0.8ul，总反应体积：1.6ul；
[0055]
c、将kasp基因分型混合液加到已含dna模板的array tape膜上。利用intelliqube的snp基因检测平台编制程序，并依次将384array tape、dna样品板、kasp基因分型混合液放置进机器，操作机器执行程序，分别自动进行dna样品稀释液和kasp基因分型混合液向384孔的array tape分装、封膜的过程；
[0056]
d、进行pcr循环反应。pcr反应可在intelliqube机器内以snp genotyping inline(单张膜时)模式进行，亦可在hydrocycler内以snp genotyping outline(多张膜时)模式进行水浴pcr。程序设置如下：1.预变性：温度94℃，15min，1次循环；2.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度61-55℃，60sec(-0.6℃/循环)；第2步10次循环；3.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度55℃，60sec，第3步26次循环；
[0057]
e、荧光数据读取和分析。pcr反应结束后，利用intelliqube机器进行荧光数据读取和分析；荧光fam激发(nm)485，发射(nm)520；hex激发535，发射556，rox激发575，发射610；
[0058]
f、加循环。如果数据荧光信号较低，分群较散，可增加循环后进行荧光读取；加循环的条件如下：变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度57℃，60sec，循环数为3；
[0059]
k、该分子标记的kasp分型结果进行分析，131株f
2
分为3种基因型，其中，30株为f
2
代中tt碱基类型100，平均果实长度为21.85cm，亲本浙江紫红线茄
‘
1838
’
为此种基因型；69株为f
2
代中at杂合碱基类型300，平均长度为16.22cm；32株为f
2
代中aa碱基类型400，平均长度为11.97cm，亲本绿色卵圆茄子
‘
1815
’
为此种基因型。对131株f
2
代单株平均果实长度进行显著性检验，分析显示如图2所示的三种类型基因型个体的果实长度平均差值分别为5.63cm(tt-at)，9.88cm(tt-aa)，4.25cm(at-aa)，差异极显著(p<0.005)；图2中tt碱基类型100、以水作为阴性对照的显示200、at杂合碱基类型300和aa碱基类型400可以看出，f
2
代中tt碱基类型100的果实长度比f
2
代中aa碱基类型400果实度要长，对于未知品种，经标记kasp分型后，果实长度与相同标记类型的样本果实长度相似；
[0060]
l、因此，通过对比果实长度的测定值和kasp分型试验结果，证明3号染色体第78393511个碱基处的snp标记与果实长度性状紧密连锁，可以用于检测茄子果实长度的差异；
[0061]
kasp分型结果：首先，以上引物和方法能够在茄子上检测与果实长度相关的主效qtl位点fl3.1是否存在，同时检测标记的多态性类型，标记类型与相应的果实长度表型一致，通过标记类型预判果实长度性状，达到提前预测果实长度的目的，从而实现对茄子果实长度性状的分子标记辅助选择。
[0062]
本发明通过qtl-seq技术以及遗传图谱定位发现了位于茄子3号染色体上与果实长度性状相关的主效qtl位点fl3.1，并在位点内进一步开发了与果实长度性状紧密连锁的分子标记，通过对未知茄子材料的种子或者苗期叶片提取dna，结合本发明的kasp引物进行kasp分子标记分型试验，通过标记的分型结果就可以预测茄子的果实长度，而不用像常规育种中，等到茄子果实达到商品果时进行测量判定，可以明显提高育种效率，节约育种成本。

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