用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组以及相关的评估方法、用途和试剂盒与流程

[0001]
本发明属于生物信息领域，具体涉及一种用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组以及相关的评估方法、用途和试剂盒。


背景技术：

[0002]
下一代测序(ngs)技术的出现为癌症精准治疗带来了一个新时代。ngs能够在单片检测数百种常见的癌症相关基因，不仅是基于酪氨酸激酶抑制剂(tki)的靶向治疗的首选，也是基于免疫检查点抑制剂(ici)的免疫治疗不可缺少的。
[0003]
虽然靶向治疗首次证明了精准药物和针对关键驱动突变(如eml4-alk融合或egfr l858r突变)的小分子抑制剂在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)中的有效性，并被证明取得了显著的成功，但通常在几个月内就会出现耐药性，而且不良反应可能会非常严重。近年来，免疫疗法通过激活和激活人体自身的免疫系统来摧毁癌细胞，显示出巨大的希望，并引起越来越多的关注。然而，尽管免疫疗法疗效显著，但其适用性有限，大多数癌症类型的只有10％-20％的患者有反应。
[0004]
在不同的癌症类型中，肿瘤突变负荷(tmb)已经成为免疫治疗成功的一个强有力的生物标志物。这反映了许多分子开关的竞争，tmb有一个清晰的基本原理，但复杂的机制。下游与新抗原负荷(nab)密切相关，影响免疫原性。在上游，它可能有多种驱动因素，从遗传因素(如hrd、dmmr或极突变)到环境因素(如吸烟或过度日晒)。因此，tmb作为生物标志物的吸引力不仅在于它的理论可靠性，还在于它的广泛覆盖。
[0005]
所以，根据肿瘤突变负荷的大小，可以在所有癌症中以用于选择治疗可以高获益的人群，以提高免疫疗法的经济学性能，进而避免不必要的资源浪费。
[0006]
但是，因为肿瘤突变负荷是统计癌组织上全部基因的突变情况，这样就需要对癌组织进行全基因组测序，价格昂贵，即使用fda批准的只是覆盖全外显子+关键基因内含子的方式(也即包括多个关键基因的大panel方式)进行检测，也由于基因数量众多，所以价格仍然较高，患者难以承受，并且，进行全基因组或大panel方式检测的时间也较长，所以往往容易让其实免疫治疗受益性并不好的患者错过其他治疗方案的最佳治疗时间，所以显然，直接进行肿瘤突变负荷检测以评估患者的免疫治疗的受益性，在应用中不能满足实际情况。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供一种用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组、以及基于该目标基因组的肿瘤突变负荷检测必要性的评估方法和免疫治疗受益性的评估方法。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009]
本发明提供了一种用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组，其特征在于：目标基因组用于评估非小细胞肺癌患者是否具有进行肿瘤突变负荷检测的必要性，其中，
目标基因组包括以下基因：egfr、tp53、cdkn2a以及sdha。
[0010]
本发明提供的目标基因组，还具有这样的特征：其中，当一个来自非小细胞肺癌患者的样本的目标基因组被判断满足以下三个预定条件中的任意一个或多个时，评估该非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性为非必要：第一预定条件：tp53基因突变，同时egfr基因突变；第二预定条件：cdkn2a基因突变，同时egfr基因突变；第三预定条件：tp53基因和sdha基因不同时突变。
[0011]
本发明提供的目标基因组，还具有这样的特征：其中，当一个来自非小细胞肺癌患者的样本的目标基因组被判断不满足三个预定条件中的任意一个时，评估该非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性不为非必要。
[0012]
本发明提供的目标基因组，还具有这样的特征：其中，各个基因分别涉及的突变为如表2的任意一个或多个突变位点。
[0013]
本发明还提供一种肿瘤突变负荷检测必要性的评估方法，用于评估非小细胞肺癌患者是否具有进行肿瘤突变负荷检测的必要性，其特征在于：基于目标基因组进行肿瘤突变负荷检测的必要性的评估，目标基因组包括以下基因：egfr、tp53、cdkn2a以及sdha。
[0014]
本发明提供的评估方法，还具有这样的特征：其中，当判断一个来自非小细胞肺癌患者的样本的目标基因组满足以下三个预定条件中的任意一个时，评估该非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性为非必要：第一预定条件：tp53基因突变，同时egfr基因突变；第二预定条件：cdkn2a基因突变，同时egfr基因突变；第三预定条件：tp53基因和sdha基因不同时突变。
[0015]
本发明提供的评估方法，还具有这样的特征：其中，当一个来自非小细胞肺癌患者的样本的目标基因组被判断不满足三个预定条件中的任意一个时，评估该非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性不为非必要。
[0016]
本发明提供的评估方法，还具有这样的特征：其中，各个基因分别涉及的突变包括如表2的突变位点。
[0017]
本发明还提供一种免疫治疗受益性的评估方法，用于评估非小细胞肺癌患者进行免疫治疗的受益性，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，评估肿瘤突变负荷检测必要性，基于目标基因组进行非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷检测的必要性的评估；步骤2，检测肿瘤突变负荷，对评估肿瘤突变负荷检测的必要性不为非必要的非小细胞肺癌患者进行肿瘤突变负荷检测得到肿瘤突变负荷；步骤3，免疫治疗受益性评估，对经步骤1评估认为肿瘤突变负荷检测的必要性为非必要的非小细胞肺癌患者或对经步骤2得到了肿瘤突变负荷的非小细胞肺癌患者评估相应的非小细胞肺癌患者的免疫治疗的受益性，其中，目标基因组包括以下基因：egfr、tp53、cdkn2a以及sdha。
[0018]
本发明还提供一种目标基因组在制备用于非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷检测必要性的评估的产品中的用途，其特征在于：其中，目标基因组为上述的目标基因组。
[0019]
本发明还提供一种试剂盒，用于检测用于非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷检测必要性的目标基因组，其特征在于：目标基因组为上述的目标基因组。
[0020]
发明作用与效果
[0021]
本发明提供的用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组以及相关的评估方法、用途和试剂盒，由于目标基因组包括基因egfr、tp53、cdkn2a以及sdha，而根据这几个基
因对于一个来自非小细胞肺癌患者的样本的tmb值结果存在的关联度分析，能够用来评估一个非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷检测的必要性，从而使得为了评估其是否容易从免疫治疗中受益，也即其免疫治疗的受益性，可以先基于上述包括的基因的数量极少的目标基因组进行肿瘤突变负荷检测必要性的评估，而不是直接进行肿瘤突变负荷的检测来进行评估，这样，相对直接进行肿瘤突变负荷检测来进行评估来说，能够低成本并且短时间拿到一个初判，这样，一方面，既不会耽误肿瘤突变负荷检测必要性评估结果不为非必要性的非小细胞肺癌患者进一步进行肿瘤突变负荷检测；另一方面，能避免肿瘤突变负荷检测必要性的评估结果为非必要的的非小细胞肺癌患者进行不必要地肿瘤突变负荷的检测，从而能为这部分非小细胞肺癌患者避免不必要的经济负担，并且避免由于进行肿瘤突变负荷检测而耽误其他治疗方案的最佳时间。
附图说明
[0022]
图1为本发明的实施例1涉及的免疫治疗受益性的评估方法的流程图。
具体实施方式
[0023]
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0024]
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0025]
实施例1
[0026]
本实施例1中，以对实体肿瘤为待测样本，对其肿瘤突变负荷进行预测为例进行说明。
[0027]
图1为本发明的实施例1涉及的免疫治疗受益性的评估方法的流程图。
[0028]
如图1所示，本实施例1提供了一种免疫治疗受益性的评估方法，该方法，包括以下步骤：
[0029]
步骤1(s1)，评估肿瘤突变负荷检测必要性，具体为：
[0030]
基于目标基因组进行非小细胞肺癌(nsclc)患者肿瘤突变负荷检测的必要性的评估。
[0031]
选择的目标基因组包括的基因以及相应的说明见表1所示。
[0032][0033]
针对目标基因组设计相应的探针，之后基于设计的这些探针，对一个来自非小细胞肺癌患者的样本进行捕获测序得到测序结果，然后将该测序结果比对到参考基因组得到相应的比对信息，根据该比对信息并进行判断，也即判断上述样本的目标基因组是否满足以下三个预定条件中的任意一个时，以评估该非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测必要性，具体地：
[0034]
三个预定条件分别为：
[0035]
第一预定条件：tp53基因突变，同时egfr基因突变；
[0036]
第二预定条件：cdkn2a基因突变，同时egfr基因突变；
[0037]
第三预定条件：tp53基因和sdha基因不同时突变。
[0038]
当判断目标基因组满足上述三个预定条件中的任意一个或多个时，评估相应的非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测必要性为非必要，此时，可以建议不需要再继续后面的肿瘤突变负荷检测，直接进入步骤3进行免疫治疗受益性的评估。
[0039]
其中，可以明确地是，以下几种情况，都符合“满足上述预定条件中的任意一个或多个”：
[0040]
(1)只满足第一预定条件；
[0041]
(2)只满足第二预定条件；
[0042]
(3)只满足第三预定条件；
[0043]
(4)只满足第一预定条件和第二预定条件；
[0044]
(5)只满足第一预定条件和第三预定条件；
[0045]
(6)只满足第二预定条件和第三预定条件；
[0046]
(7)第一预定条件、第二预定条件以及第三预定条件这三个预定条件都满足。
[0047]
反之，当判断目标基因组不满足上述三个预定条件中的任意一个时，也即当上述样本的目标基因组经测序后发现，其突变状态不包括上述7种情景中的任意一种时，评估相应的非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测必要性不为非必要。为了进一步能评估该非小细胞肺癌患者是否能从免疫治疗中获益，则建议需要再继续后面的肿瘤突变负荷检测。
[0048]
本实施例中，具体地，在上述三个预定条件中，各个基因分别涉及的突变为如表2的突变位点中任意一个或多个。
[0049]
[0050]
[0051]
[0052][0053]
步骤2，检测肿瘤突变负荷，具体为：
[0054]
本步骤对步骤1中评估肿瘤突变负荷检测的必要性不为非必要的非小细胞肺癌患者进行肿瘤突变负荷的检测。
[0055]
本步骤中，对肿瘤突变负荷(tmb)的检测采用上述覆盖全外显子+关键基因内含子的方式进行检测，tmb的计算公式为：突变个数/测序长度。
[0056]
测序长度为测序针对的测定区域的大小，其计算为将各个被设计用来捕获测定区域的相关基因的探针之间去除重叠部分后累计得到。
[0057]
步骤3，评估免疫治疗受益性，具体分为两种：
[0058]
(1)对经步骤1评估认为肿瘤突变负荷检测的必要性为非必要的非小细胞肺癌患者评估其免疫治疗的受益性：此时，是基于步骤1的评估结果，由上可知，对于评估相应的非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测必要性为非必要的，某种程度上就是认为该患者从免疫治疗中获益的程度较难，也即受益性不高。
[0059]
(2)对经步骤2得到了肿瘤突变负荷的非小细胞肺癌患者评估相应的非小细胞肺癌患者的评估其免疫治疗的受益性，此时，是基于步骤2得到的肿瘤突变负荷进行评估，当肿瘤突变负荷的大小超过阈值时，评估认为该患者从免疫治疗中获益的程度较容易，也即容易从免疫治疗中受益，受益性高，反之，则认为受益性不高。
[0060]
上述阈值，是对于非小细胞肺癌来说，普遍被接收的认为能够受益的肿瘤突变负荷的大小，比如可以是10，当肿瘤突变负荷经检测计算大于10，即认为受益性高。
[0061]
从上可以看出，对于非小细胞肺癌患者，为了评估其是否容易从免疫治疗中受益，也即其免疫治疗的受益性，可以先进行肿瘤突变负荷检测必要性的评估，而不是直接进行肿瘤突变负荷的检测来进行评估，此时，由于步骤1的评估肿瘤突变负荷检测必要性基于的目标基因组包括的基因数量极少，相对进来说能够低成本并且短时间拿到一个初判，这样，一方面，既不会耽误由于不满足上述三个预定条件中的任意一个或多个的非小细胞肺癌患者(也即评估肿瘤负荷检测的必要性不为非必要的非小细胞肺癌患者)进一步进行肿瘤突变负荷检测，同时，能避免满足上述三个预定条件中的任意一个或三个的非小细胞肺癌患者(也即评估蒸馏负荷检测的必要性为非必要的非小细胞肺癌患者)进行不必要地肿瘤突变负荷的检测，从而能为这部分非小细胞肺癌患者避免不必要的经济负担，并且避免由于进行肿瘤突变负荷检测而耽误其他治疗方案的最佳时间。
[0062]
实施例2
[0063]
本实施例2为了证实基于实施例1中的目标基因组，能够用于非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性评估和免疫治疗的受益性的评估。
[0064]
本实施例2的验证是基于的样本来源信息见表2所示。
[0065][0066]
本实施例中：
[0067]
第一步，采用上述大panel的方式，对这291个样本进行测序以及tmb的检测：通过构建样本dna测序文库，并使用特异探针对文库进行目标区域捕获富集，该过程采用试剂盒进行；捕获后的文库通过高通量测序，可实现多个基因多个突变的一次性检测。
[0068]
具体地如下：
[0069]
(1)以福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)和血液样本(配对样本)提取的dna为材料，对其进行片段化处理、加接头、及pcr富集等步骤制备预文库；其后采用具有特定序列的dna探针与预文库进行杂交，从而特异性地捕获来自人类基因组靶基因中的外显子与内含子区域；之后通过磁珠法富集被探针捕获的dna片段，并对捕获的文库进行定量与质控；最后将经定量的文库采用基因测序仪进行高通量测序。采用生物信息学软件判读靶基因中是否存在来自肿瘤的变异。本试剂盒包含阴、阳性质控品，用来监控实验环节及数据分析环节的随机误差及系统误差。
[0070]
(2)将肿瘤组织和配对的血样进行测序后，得到fastq格式序列，fastq文件质控合格，则比对到人类基因组的参考序列上，生成比对bam格式文件。对bam文件进行统计，可以得到该测序数据的平均深度等。将组织样本以配对的血样做对照，只保留体细胞突变，获取编码区的突变位点，进一步去掉公开数据库的snp位点、driver mutation，得到最终的突变位点。将这些位点计数，除以编码区域的碱基大小(mb)，可得到tmb值为每mb区间内的基因变异数量。
[0071]
适用仪器：illumina公司生产的nextseq 550dx或novaseq6000.
[0072]
样本要求：
[0073]
样本类型来源同一个体的配对样本，具体为：edta采血管保存的血液样本和福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)的实体瘤组织样本。ffpe样本保存年限不超过2年。
[0074]
检验方法：
[0075]
ffpe和血液核酸提取阶段主要将蜡块样本切片，选取肿瘤含量高的切片进行后续工作；
[0076]
文库构建；末端修复：这一步骤将dna末端补平，并在5
’
端进行磷酸化和3
’
端加da尾；接头连接：这一步骤将在末端修复后的产物末端连上接头；文库扩增：这一步骤将对纯
化后的接头连接产物进行pcr扩增。
[0077]
文库捕获：探头杂交：将文库混合、重新溶解、杂交；捕获：获取dna序列，然后选择捕获后的数据进行扩增。
[0078]
上机处理及测序：通过试剂对上机文库进行混合；混合后检测混合样本文库体积是否符合上机安排。然后对样本进行变性，复性
[0079]
(https://www.biomart.cn/experiment/430/502/527/528/28099.htm)稀释等上机前预处理；然后进入上机测序得到测序结果。
[0080]
第二步，根据测序结果比对，将涉及的关键基因，每两个基因为一组(a基因和b基因)，这两个基因之间分为有a基因突变但没有b基因突变的所有样本的tmb值(用x表示)、有b基因突变但有a基因突变的所有样本的tmb值(用y表示)以及两个基因都突变的所有样本的tmb值(用z表示)，然后对x和y之间、x和z之间、y和z之间分别做显著分析得到相应的各个p值，举例说明如下：关键基因总共有a、b、c和d四个时，对a和b两个基因之间，分为有a基因突变但没有b基因突变的tmb值，有b基因突变但有a基因突变的tmb值，a和b两个基因都突变的tmb值，这三个tmb值按照上述方式做显著分析，这样完成一组后，再针对下一组，比如a和c，依次下去，直至每个基因都与另一个基因为一组得到各个显著分析结果。
[0081]
第三步，将第二步得到的结果进行如下过滤：将进行显著分析的两个基因(双基因)同时突变对应的样本个数大于5的留下，以保证数据具有统计学意义，即能评估出25％和75％的数据：最大值，上四分卫，中位数，下四分卫以及最小值。
[0082]
本实施例2中，按照上述得到的显著分析结果如表3所示。
[0083][0084][0085]
表3说明：
[0086]
1、表格中出现的各个基因为本实施例2的大panel检测中涉及的各个关键基因；
[0087]
2、p_a_b表示有a基因突变但没有b基因突变的所有样本的tmb值，和有b基因突变但没有a基因突变的所有样本的tmb之间的显著性分析p值；
[0088]
3、p_a_both表示有a基因突变但没有b基因突变的所有样本的tmb值和a基因和b基因都突变的所有样本的tmb值之间的显著性分析p值；
[0089]
4、p_b_both表示有b基因突变但没有a基因突变的所有样本的tmb值和a基因和b基因都突变的所有样本的tmb值之间的显著性分析p值；
[0090]
5、#a表示有a基因突变但没有b基因突变的所有样本的tmb值的中位数；
[0091]
6、#b表示有b基因突变但没有a基因突变的所有样本的tmb值的中位数；
[0092]
7、#both表示a基因和b基因都突变的所有样本的tmb值的中位数。
[0093]
再次，根据表3中的结果，将p_a_b、p_a_both以及p_b_both对应的三个p值中任意一个小于等于0.05的组筛选出来，也即通过上述的显著分析过程，从而最后将一对基因相互之间对tmb的结果有显著关联的成对基因筛选出来，得到表4中的结果。
[0094][0095]
根据表4对应的基因，统计各自相应的突变位点，得到如表2位点。
[0096]
另外，实施例2中，以tbm的阈值为10进行划分，也即tmb值超过10的认为非小细胞肺癌患者进行免疫治疗的受益性较大，反之，则较小。
[0097]
从表4可以看出，egfr(a)和tp53(b)两个基因为一组时，只有egfr突变但没有tp53突变的所有样本的tmb的中位数最小(4.8)，也即该种情况下的样本的tmb中位数仅仅为4.8，根据统计学分析，说明这种情况下，一个具有这样突变的非小细胞肺癌患者的tmb数值大概率上都难以达到10；其次是egfr和tp53都突变的所有样本的tmb值的中位数(7.2)，同样地，一个具有这样突变的非小细胞肺癌患者的tmb，大概率上说也难以达到10；最后是只有tp53突变但没有egfr突变的所有样本的tmb的中位数(13.6)，根据统计学分析，说明一个具有这样突变的非小细胞肺癌患者的tmb，大概率上说很容易超过10。该结果说明，对于一个非小细胞肺癌患者而言，egfr和tp53这对双基因之间在对该非小细胞肺癌患者的tmb值的影响上具有关联性，这个关联性就是：在tp53突变的时候，如果也存在egfr的突变，会显著拉低一个样本的tmb值，也即egfr和tp53均突变的时候，对tmb值的结果具有抑制作用。因此，当一个非小细胞肺癌患者的样本，经检测为满足第一预定条件，也即tp53基因突变，同时egfr基因突变时，根据上述论述可知，我们可以评估这个非小细胞肺癌患者的最终肿瘤突变负荷检测结果大概率上是小于阈值10的。
[0098]
同样地道理，根据表格4还可以知道：
[0099]
egfr和cdkn2a这对双基因之间在对该样本的tmb值的影响上也具有关联性，这个关联性就是：egfr和cdkn2a均突变的时候，对tmb值的结果具有抑制作用。因此，当一个非小细胞肺癌患者的样本，经检测为满足第二预定条件，也即cdkn2a3基因突变，同时egfr基因突变时，根据上述论述可知，我们可以评估这个非小细胞肺癌患者的最终肿瘤突变负荷检测结果大概率上也是小于阈值10的；
[0100]
sdha和tp53这对双基因之间在对该样本的tmb值的影响上也具有关联性，这个关联性就是：在sdha突变的时候，如果也tp53未同时突变，那么一个样本的tmb值也会显著较低，且低于阈值10，也即sdha和tp53这两个基因之间相比单独存在突变的时候，同时存在突
变能将tbm值的结果进行增强，以能超过阈值10。因此，当一个非小细胞肺癌患者的样本，经检测为满足第三预定条件，也即sdha和tp53未同时突变的时候，根据上述论述可知，我们可以评估这个非小细胞肺癌患者的最终肿瘤突变负荷检测结果大概率上也是小于阈值10的。
[0101]
而一个样本的tmb值小于阈值时，则意味着该非小细胞肺癌患者进行免疫治疗的受益性不高，所以当一个来自非小细胞肺癌患者的样本的满足上述三个预定条件中的一个或多个时，进行肿瘤突变负荷检测的必要性为非必要，也即没必要继续检测肿瘤突变负荷，从而为该非小细胞肺癌患者避免了不必要的经济负担，并能让该非小细胞肺癌患者及时选择其他适合的治疗，以免耽误其他治疗方案的最佳时间。
[0102]
相反，当一个非小细胞肺癌癌患者的样本根据目标基因组检测发现不满足上述三个预定条件中的任意一个时，很大程度上说明该结直肠癌患者进行肿瘤突变负荷检测的必要性不为非必要，所以需要根据最终的肿瘤负荷大小，该非小细胞肺癌患者才能更有把握评价自己进行免疫治疗的受益性。
[0103]
所以，从上述总结可见，基于实施例1中的目标基因组，能够用于非小细胞肺癌患者的肿瘤突变负荷检测的必要性评估和免疫治疗的受益性的评估。
[0104]
实施例的作用与效果
[0105]
实施例1提供的用于非小细胞肺癌患者基因检测的目标基因组、以及基于该目标基因组的肿瘤突变负荷检测必要性的评估方法和免疫治疗受益性的评估方法，从实施例2可以看出，由于目标基因组包括基因egfr、tp53、cdkn2a以及sdha，而根据这几个基因对于一个来自非小细胞肺癌患者的样本的tmb值结果存在的关联度分析，能够用来评估一个非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷检测的必要性，从而使得为了评估其是否容易从免疫治疗中受益，也即其免疫治疗的受益性，可以先基于上述包括的基因的数量极少的目标基因组进行肿瘤突变负荷检测必要性的评估，而不是直接进行肿瘤突变负荷的检测来进行评估，这样，相对直接进行肿瘤突变负荷检测来进行评估来说，能够低成本并且短时间拿到一个初判，这样，一方面，既不会耽误肿瘤突变负荷检测必要性评估结果不为非必要性的非小细胞肺癌患者进一步进行肿瘤突变负荷检测；另一方面，能避免肿瘤突变负荷检测必要性的评估结果为非必要的的非小细胞肺癌患者进行不必要地肿瘤突变负荷的检测，从而能为这部分非小细胞肺癌患者避免不必要的经济负担，并且避免由于进行肿瘤突变负荷检测而耽误其他治疗方案的最佳时间。

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